專利名稱：：一種甘草提取物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物殺菌劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種甘草提取物在防治植物病害中的新用途。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，隨著植物病理學(xué)、生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，農(nóng)藥中殺菌劑的研究已進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。高效內(nèi)吸性殺菌劑如Strobilurn類殺菌劑的出現(xiàn)，一方面使植物病害的防治獲得了突破性進(jìn)展，另一方面也造成病原菌對(duì)藥劑的抗性問題日益突出。尋求對(duì)環(huán)境相容性好，對(duì)病原菌具有持久效果的無(wú)公害農(nóng)藥，在綠色食品日益被重視的今天顯得格外重要。天然產(chǎn)物常表現(xiàn)出許多生物活性，數(shù)百年來(lái)廣為人們所用。其中，植物源殺菌活性成分的研究和開發(fā)是解決當(dāng)前化學(xué)殺菌劑諸多負(fù)面效應(yīng)的一個(gè)重要研究方向。植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫(kù)，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過400000種，據(jù)報(bào)道，現(xiàn)在地球上的35萬(wàn)多種植物中，約有2400種植物具有控制有害生物的活性。多年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研工作者對(duì)多種植物如楝科Meliacea植物中米仔蘭屬Aglaia植物、樟科Lauraceae植物印度鱷梨Perseaindica、天南星科Araceae、植物菖蒲等進(jìn)行了殺蟲物質(zhì)的研究，而植物源抑菌、殺菌活性物質(zhì)的研究相對(duì)較少，實(shí)際上據(jù)報(bào)道有1389種植物有可能作為殺菌劑，植物中的抗毒素、類黃酮、罹病相關(guān)的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和酚類化合物等均有殺菌和抗菌活性。植物源殺菌物質(zhì)大多為復(fù)合的抑菌有效成分，且具有多種作用位點(diǎn)和作用機(jī)制，因而植物被認(rèn)為是化學(xué)合成殺菌劑替代品最好的開發(fā)資源。甘草是豆科甘草屬植物，其根和根莖是最常用的中藥，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古和新疆維吾爾自治區(qū)，除用作藥品外，還廣泛用在食品、釀造和化妝品工業(yè)上，有著越來(lái)越廣的應(yīng)用前景。近些年，甘草的活性研究已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。在臨床醫(yī)學(xué)上，該屬植物廣泛用于抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗?jié)儭⒖垢窝?、解毒、治療?nèi)分泌系統(tǒng)疾病等方面，即具有抗腫瘤作用、抗炎及抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗病原微生物作用、免疫調(diào)節(jié)作用等功效，作為抗病原微生物藥物還可以應(yīng)用在食品的保鮮防腐方面。甘草的殺菌活性可見于醫(yī)學(xué)上的報(bào)道，而關(guān)于甘草及其提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性卻尚未見報(bào)道。因此，研究甘草及其提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性，將甘草及其提取物質(zhì)應(yīng)用到植物病害的防治上，對(duì)解決病原菌對(duì)藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服甘草開發(fā)應(yīng)用技術(shù)的不足，提供一種甘草提取物的新應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)提供甘草提取物在防治植物病害方面的應(yīng)用。所述甘草提取物為甘草的甲醇提取物。所述甘草提取物的制備方法是采集甘草全株，優(yōu)選甘草干燥根，置于5(TC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干；粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。所得植物粉用密封袋密封避光處保存?zhèn)溆谩２捎贸暡ㄌ崛》ㄖ苽涓什萏崛∥?。所述植物病害包括霜疫霉?i^rawp/z"/zoraChen)、疫霉屬(尸/zy/cip/^/zon3ca/w/c/Leonian)、芽豐支霉屬(C/adaspon'wmLK.exFr)、核盤菌屬(5Wera""/a入炭疽菌屬(CoZ/etofWc/wwCorda)等屬的常見植物病害。本發(fā)明用75%甲醇作為溶劑將甘草提取物配制成一定濃度的藥液，采用菌絲生長(zhǎng)速率法、孢子囊芽管萌發(fā)法、離體葉片法對(duì)甘草甲醇提取物對(duì)霜疫霉屬(戶en9"0/7/7j^/20n3Chen)、疫霉屬(i^/zj^op/z/Zzwaca/w/c/Leonian)、芽枝霉屬(C7"(iaspoW謂LK.exFr)、核盤菌屬(5WmrimW、炭疽菌屬(Co//eto^'C/2wmCorda)等屬的常見植物病害進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定并進(jìn)行了溫室盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，甘草甲醇提取物對(duì)所述病原菌具有良好的抑制效果，可以開發(fā)其在防治植物病害中的新用途。作為一個(gè)優(yōu)選方案，本發(fā)明提供了所述甘草提取物以40(Hig/mL的干粉濃度應(yīng)用于防治辣椒辣椒疫霉病。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明突破傳統(tǒng)的甘草僅應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)的限制，對(duì)甘草的應(yīng)用提出了新的思路，并確定了甘草提取物用于防治植物病害的技術(shù)方案。為植物替代化學(xué)合成殺菌劑提供了新的開發(fā)資源，對(duì)解決病原菌對(duì)藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1甘草提取物的制備采集甘草根，置于5(TC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干；粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。所得植物粉用密封袋密封避光處保存?zhèn)涮崛∮?。本發(fā)明采用現(xiàn)有常規(guī)的超聲波提取法制備甘草提取物，也可以參用現(xiàn)有的其他常規(guī)技術(shù)提取制備。實(shí)施例2:甘草甲醇粗提物對(duì)霜疫霉屬(尸ei^7，力j^^raChen)病菌的抑制作用用75%甲醇作溶劑溶解提取物，然后再與PDA培養(yǎng)基配制成帶毒培養(yǎng)基，以菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同溶劑提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。具體操作是采用菌絲生長(zhǎng)速率法用75%甲醇作為溶劑將甘草提取物配制成一定濃度的供試藥液，準(zhǔn)確吸取lmL藥液加入到49mL融化的PDA培養(yǎng)基中(約5(TC)混合均勻后倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中(直徑9cm)，每瓶均勻倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中，配制成所需濃度的帶毒培養(yǎng)基。以混入相同體積的無(wú)菌水或75%甲醇做對(duì)照。供試病菌荔枝霜疫霉病菌在直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)用約17mLPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后在菌落邊緣菌絲生長(zhǎng)旺盛處用打孔器打取直徑為0.6cm的菌餅，分別接種于每個(gè)培養(yǎng)皿中央，有菌絲的一面向下。每個(gè)培養(yǎng)皿放一個(gè)菌餅，每個(gè)處理做三個(gè)重復(fù)，25。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑(cm)，按以下公式計(jì)算抑菌率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l:(CK菌落直徑一0.6)—(處理菌落直徑一0.6)抑菌率(％)——-x100CK菌落直徑_0.6表1甘草甲醇提取物對(duì)蕩枝霜疫霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用(7天)處理濃度(干粉)mg/mL菌落直徑(cm)平均抑菌率(%)CK(1.5%甲醇)7.42-12.68土0.031h63.836cL43士0.021k80.683b100.78士0.031L89.443a注1)表中結(jié)果為三次重復(fù)的平均值;2)同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有相同字母者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。實(shí)驗(yàn)表明，甲醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率明顯高于處理，在10mg/mL、5mg/mL、lmg/mL干粉濃度時(shí)抑制率達(dá)89.443%、80.683°/。、63.830%，顯示出很強(qiáng)的抑菌作用。實(shí)施例3:甘草甲醇粗提物對(duì)霜疫霉屬(尸er朋，力j^orsChen)病菌的抑制作用采用載玻片法(方中達(dá)，1998)測(cè)定將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天的荔枝霜疫霉病菌用無(wú)菌水洗下孢子囊，加入藥液制備成含各種濃度藥液的孢子囊懸浮液，孢子囊濃度調(diào)整為每視野(10x10倍)約4060個(gè)孢子囊，取50pL孢子囊懸浮液滴在載玻片上，再將載玻片置于己放一張濾紙的9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，并在濾紙上滴加少量無(wú)菌水以保濕，蓋上培養(yǎng)皿，置于28"C下光照培養(yǎng)4小時(shí)后觀察孢子囊萌發(fā)情況。按下式計(jì)算藥劑處理的孢子囊萌發(fā)率和藥劑對(duì)孢子囊萌發(fā)的抑制百分率。孢子囊萌發(fā)數(shù)孢子囊萌發(fā)率(％)=觀察孢子囊數(shù)x畫對(duì)照孢子囊萌發(fā)率一藥劑處理孢子囊萌發(fā)率孢子囊萌發(fā)抑制率(％)=xlOO對(duì)照孢子囊萌發(fā)率采用載玻片法測(cè)定了甘草甲醇粗提物在1.3、1.0、0.7、0.5、0.3、0.15mg/mL(干粉有效成分的濃度)下對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊芽管萌發(fā)的抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明處理后4小時(shí)，顯微鏡下觀察，隨著處理濃度的升高，孢子囊萌發(fā)率相應(yīng)降低，抑制率依次為97.84%、86.45%、67.27%、52.67%、30.21%、13.26%，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。將平均抑制率值進(jìn)行百分率一概率轉(zhuǎn)換，以概率幾率值為橫坐標(biāo)，處理濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，求取回歸曲線，得到毒力回歸方程y=3.0474x+5.9922，相關(guān)系數(shù)R=0.9288，EC5o為0.47mg/mL，95%置信限0.450.49。表2甘草甲醇粗提物對(duì)荔枝霜疫霉病菌孢子囊芽管萌發(fā)的抑制活性(4小時(shí))處理(mg/mL)孢子囊總數(shù)萌發(fā)孢子囊總、w.數(shù)萌發(fā)率(%)抑制率(%)(f土S.五.)1.3679182.16±0.4297.84士0.42f1.07394213.55±1.0786.45士1.07e0.7672卯32.73±0.9667.27士0.96d0.50.30.15CK72079473370827874769868947.33±0.9969.79±1.7686.74±1.9797.28±0.8852,67士0.99c30.21士1.76b13.26士1.97a2.72±0.88注1)表中萌發(fā)率、抑制率結(jié)果分別為五次重復(fù)的平均值；2)同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有相同字母者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。實(shí)施例4:甘草甲醇粗提物對(duì)疫霉屬(/^7"P力ao"capw'ciLeonian)病菌的的溫室盆栽試驗(yàn)辣椒疫霉病菌孢子囊液的制備采用MSS溶液法(常彩濤等，1995)誘導(dǎo)辣椒疫霉病菌產(chǎn)生大量孢子囊，即將在PSA上培養(yǎng)7天的菌絲塊，接種于含PS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在2527。C下培養(yǎng)4860小時(shí)后，濾去液體培養(yǎng)基，用20mLMSS液將濾紙上的菌絲清洗沖回三角瓶，在2527"C下光照培養(yǎng)24小時(shí)后，取培養(yǎng)菌液用于接種辣椒苗上。試劑配方如下(1)MSS液配方MgS047H20，KNChFe-EDTA蒸餾水(2)Fe-EDTA的配方:EDTA-Na2FeS047H200.004mol/L0.05mol/LlmL1000mL14.86g24.9g蒸餾水lOOOmL盆栽試驗(yàn)在塑料大棚中進(jìn)行。每個(gè)塑料盆缽裝自然風(fēng)干菜園土0.5kg，移栽4葉期健壯辣椒苗。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5盆，每盆4株。在幼苗長(zhǎng)到45片真葉時(shí)，先噴藥液，對(duì)照噴自來(lái)水，并設(shè)甲霜靈對(duì)照，2h后噴接制備好的辣椒疫霉病菌孢子囊懸浮液，并立即覆蓋塑料薄膜保濕24h。2、4、7d分別觀察發(fā)病情況，記錄溫度，發(fā)病程度一株為單位，按04級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)査0級(jí)無(wú)病；l級(jí)l片葉發(fā)病；2級(jí)2片葉發(fā)?。?級(jí)3片葉發(fā)??；4級(jí)4片以上葉發(fā)病或莖受害病情指數(shù):E(病級(jí)葉片數(shù)x病級(jí)級(jí)數(shù))葉片總數(shù)X最高病級(jí)級(jí)數(shù)X100處理病情指數(shù)防治效果(％)(l一對(duì)照病情指數(shù)xioo實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示表3甘草甲醇提取物對(duì)辣椒疫霉病的盆栽防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注1)53%雷多米爾處理為稀釋500倍液;2)表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；數(shù)據(jù)后標(biāo)有相同字母者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。室內(nèi)盆栽測(cè)試結(jié)果顯示，甘草甲醇提取物對(duì)辣椒疫霉病有較好的防治效果，防治效果隨處理濃度的升高而提高。供試濃度為50、100、200、300、400pg/mL(提取物干粉濃度)時(shí)，處理2天后防效依次為65.54%、72.40%、86.22%、85.66%、96.57;處理5天后防效依次為44.44%、74.61%、82.53%、84.13%、88.90%;處理10天后防效依次為34.38%、50.00%、68.75%、75.00%、86.46%。結(jié)果還顯示處理濃度為400Mg/mL的防效優(yōu)于對(duì)照藥劑雷多米爾錳鋅。實(shí)施例5:甘草甲醇粗提物對(duì)3種病原菌的抑菌活性采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定甘草甲醇粗提物對(duì)3種分屬于芽枝霉屬(C7acfos;o"'謂LK.exFr)、核盤菌屬(5"c/eraffm'a入炭疽菌屬(Co//etoWc/wwCorda)的花生黑霉病、大麥條紋病、香蕉炭疽病原真菌的抑制效果。在無(wú)菌條件下，配制不同濃度藥劑，再倒入已融化的培養(yǎng)基(溫度約為60°C)中，充分搖勻，趁熱倒入90cm的培養(yǎng)皿中制成含藥培養(yǎng)基平板。平板凝固冷卻后用接種針接進(jìn)大小一致、生長(zhǎng)一致的各種植物病原真菌菌餅(O=5.0mm)，每皿接1個(gè)菌餅，生長(zhǎng)有菌落的一面朝下，每處理3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)清水空白對(duì)照、1%甲醇對(duì)照。置于生化培養(yǎng)箱中，25'C條件下培養(yǎng)5天，再用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落直徑的大小，按以下公式計(jì)算抑菌率，進(jìn)而計(jì)算藥劑處理對(duì)不同病菌的有效抑制中濃度(EC5Q)及相關(guān)系數(shù)(r)值。抑菌率(％)-[處理(O)-原菌餅①][CK(O)-原菌餅①]:100抑菌活性測(cè)定結(jié)果見表4。表4甘草甲醇粗提物對(duì)3種植物病原真菌的抑菌活性處理病害名稱回歸曲線相關(guān)系數(shù)RGC50(pg/mL)95%置信區(qū)間花生黑霉病大麥條紋病y=1.8545x+6.2928y=0.3794x+5.2172y=1.0662x+5.65680.90570.98050.9725200.86267.62242.09168.4251.74228.9315.06223.7264.8權(quán)利要求1、甘草提取物在防治植物病害方面的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘草提取物為甘草的甲醇提取物。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘草提取物的制備方法是采集甘草全株，烘干，粉碎得甘草粉；甘草粉經(jīng)超聲波提取制備得到甘草提取物。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物病害包括霜疫霉屬、疫霉屬、芽枝霉屬、核盤菌屬和炭疽菌屬植物病害。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘草提取物以400pg/mL的干粉濃度應(yīng)用于防治辣椒辣椒疫霉病。全文摘要本發(fā)明公開了一種甘草提取物的應(yīng)用，具體應(yīng)用于防治植物病害。通過室內(nèi)生物測(cè)定和盆栽試驗(yàn)，本發(fā)明提供了甘草的甲醇提取物對(duì)霜疫霉屬(PeronophythoraChen)、疫霉屬(PhytophthoracapsiciLeonian)、芽枝霉屬(CladosporiumLK.exFr)、核盤菌屬(Sclerotinia)、炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)等屬的常見植物病害良好的防治應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)甘草及其提取物用于防治植物病害的新用途提出了新的思路，為植物替代化學(xué)合成殺菌劑提供了新的開發(fā)資源，對(duì)解決病原菌對(duì)藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。文檔編號(hào)A01P3/00GK101524090SQ20091003827公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年3月30日優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日發(fā)明者玥何,羅建軍,胡美英,胡黎明,郝衛(wèi)寧,鐘國(guó)華申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)