專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種應(yīng)用納米技術(shù)促進(jìn)鐵皮石斛快速增殖的組培方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥用石斛的快速增殖方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體的講，是指一種采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行快速繁殖的方法。二
背景技術(shù)：
：植物組織培養(yǎng)是指用植物的各種器官、組織或細(xì)胞，在人工控制的條件下進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，通過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，產(chǎn)生可以用于繁殖的完整植株，并在數(shù)量上得到大幅度的增加。該技術(shù)取材少，培養(yǎng)植物材料成本低，生長(zhǎng)周期短，管理方便。利用植物組織培養(yǎng)這種快速繁殖技術(shù)，能在短時(shí)間內(nèi)繁衍出大量植株，并且能較好的保持母本的遺傳性狀。在我國(guó)通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖的植物已有數(shù)千種。鐵皮石斛[DeA7drojb/'wmo所c/Va/eK/'muraefM/'go]是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥和名貴的室內(nèi)觀賞植物，由于生長(zhǎng)條件苛刻，自然條件下生長(zhǎng)極為緩慢，常規(guī)繁殖又較難，通過(guò)種子播種不能得到大量與親代性狀一致的植株，分株和高位芽扦插繁殖則速度很慢，一般在1年中的繁殖速度為2-3倍。目前大量的采挖已經(jīng)使野生的鐵皮石斛資源瀕臨滅絕。由于其具有極高的藥用價(jià)值，同時(shí)鐵皮石斛花色艷麗，花期長(zhǎng)，適合于做盆花栽培，目前國(guó)際市場(chǎng)市場(chǎng)價(jià)格為1300-3600美元/公斤，因此極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。對(duì)石斛的開(kāi)發(fā)，快速繁殖是第一步。目前有關(guān)于石斛屬組培快繁的技術(shù)報(bào)道比較多，從外植體的選擇、培養(yǎng)基的篩選等方面可以說(shuō)已經(jīng)相當(dāng)成熟了。一般是以成熟或未成熟的種子為材料，在有激素或無(wú)激素的培養(yǎng)基上萌發(fā)，形成原球莖，原球莖繼續(xù)擴(kuò)增或成苗。但上述方法以種子為材料，由于石斛屬植物在自然狀態(tài)下，主要以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主要繁殖方式，雖然開(kāi)花多，當(dāng)授粉結(jié)實(shí)率低，使得種子的獲得具有一定的困難，且接種時(shí)間受到嚴(yán)格的限制；選擇幼嫩莖尖為材料，不僅接種時(shí)間受到限制，材料數(shù)量有限，還會(huì)明顯的影響栽培植株的正常生長(zhǎng)；不利于材料的更新。此外，在煉苗技術(shù)上，多數(shù)方法要求較高，如要求栽在活苔蘚上，才能獲得較高的成功率等，所以難以大規(guī)模生產(chǎn)。納米化二氧化鈦(Titaniumdioxide,Ti02)是目前最具有應(yīng)用潛力和開(kāi)發(fā)前景的一種光半導(dǎo)體材料，其本身無(wú)毒、無(wú)味、無(wú)剌激性，并且具有價(jià)格低廉、性能穩(wěn)定、催化性能高、無(wú)污染和對(duì)人畜無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，物質(zhì)的納米顆粒因?yàn)槠渌哂械木薮蟊砻娣e會(huì)有利于細(xì)胞的吞噬吸收，顆粒的納米尺度可能會(huì)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的吞噬吸收來(lái)影響細(xì)胞的生理活動(dòng)。同時(shí)，微量金屬元素對(duì)植物的生長(zhǎng)有一種類(lèi)似于激素(生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素)的效應(yīng)，其對(duì)高等植物具有促進(jìn)其生長(zhǎng)的功效。三、發(fā)明專(zhuān)利內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有石斛組織培養(yǎng)方法的不足，對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，提供一種能夠適合鐵皮石斛、采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖的方法。本發(fā)明的方法是在現(xiàn)有石斛組織培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中加入各種納米化的材料，利用其吸附能力對(duì)培養(yǎng)基中各種成分形成的緩釋作用來(lái)減少因培養(yǎng)基中的物質(zhì)消耗而進(jìn)行的繼代培養(yǎng)次數(shù)，以提高繁殖效率；利用其類(lèi)激素效應(yīng)促進(jìn)組織生長(zhǎng)，以提高生長(zhǎng)效率。本發(fā)明所述的鐵皮石斛快速繁殖組織培養(yǎng)技術(shù)方法包括以下步驟-(1)外植體的選擇與滅菌選擇當(dāng)年萌生的有嫩莖尖，先用無(wú)菌水沖洗干凈，去除葉鞘，切成具有1-4個(gè)腋芽、長(zhǎng)3-5cm段，用0.5g/L的多菌靈溶液浸泡2-3個(gè)小時(shí)，再用75%乙醇消毒30秒鐘，用0.1%升汞水浸泡20分鐘，無(wú)菌水沖洗5-6次，取出材料，切成具有一個(gè)腋芽、長(zhǎng)度為lcm左右的小段，最后用12%次氯酸鈉殺菌30秒，無(wú)菌水沖洗5-6次。(2)腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ne培養(yǎng)基，加入的5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料，納米Ti02(Titaniumdioxide,Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復(fù)配粉體、鎳納米材料、0.5mg/L的6-BA、l.Omg/L的NAA和150.0mg/L的椰子汁，在25±1°C、光照1500-2000Lx、光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)，直至形成帶葉的小苗。其中Ne基本培養(yǎng)基是本行業(yè)常用的一種培養(yǎng)基，其組成成分如下表表lN6培養(yǎng)基的組成和配方組成成分?jǐn)?shù)量(mg/L)組成成分?jǐn)?shù)量(mg/L)KN032.3MgS04'7H2。185CaCl2H20166KH2P04400(NH4)2so4463KI0.8H3B。31.6MnS044H204.4ZnSO47H201.5Na2-EDTA37.3FeS047H2027.8蔗糖50pH5.8煙酸0.5鹽酸吡眵醇0.5甘氨酸2.0鹽酸硫銨1.0(3)叢生芽誘導(dǎo)將小苗接種在含有5mg/m1—20mg/ml濃度的納米顆粒如納米Ti02(Titaniumdioxide,Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米SiQ2、納米4Fe304/Ti02、納米ZnQ、納米SnSe2、Ce-Mn-O納米粉體、納米Si02復(fù)配粉體、鎳納米材料、l.Omg/LNAA和150.0mg/L的椰子汁的1/2N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至形成叢生芽，培養(yǎng)條件25士rC、光照1500-2000Lx、光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天。(4)成苗培養(yǎng)將分化的小苗接種到含有5mg/m1—20mg/ml濃度的納米顆粒納米Ti。2(Titaniumdioxide，Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復(fù)配粉體、鎳納米材料、O.lmg/L的6-BA和l.Omg/LNAA的2/3MS成苗培養(yǎng)基上，在25士TC、光照1500-2000Lx、光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的條件下。培養(yǎng)29-31天生根，形成完整植株。其中MS基本培養(yǎng)基是本行業(yè)常用的一種培養(yǎng)基，其組成成分如下表表2MS培養(yǎng)基的組成和配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(5)煉苗和移栽先將組培苗在室內(nèi)鍛煉20-25天后，洗凈根上的培養(yǎng)基，用0.1%的多菌靈消毒后，栽培于活苔蘚中，栽后澆足水，以后經(jīng)常進(jìn)行人工噴霧，保持環(huán)境濕潤(rùn)，每隔10-15天灑一次營(yíng)養(yǎng)液。在上述發(fā)明的描述中，6-BA是6-芐基腺嘌呤，NAA是萘乙酸，1102納米顆粒直徑約為20nm，Lx是光強(qiáng)的單位——勒克斯。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果(1)克服了傳統(tǒng)繁殖方法繁殖速度慢，很難滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)需求的不足。在短時(shí)間內(nèi)能夠繁殖出滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)所需要的種苗；(2)本方法保證了遺傳的穩(wěn)定性；(3)本方法具有成本低廉的特點(diǎn)。權(quán)利要求1、一種應(yīng)用納米技術(shù)促進(jìn)鐵皮石斛快速增殖的組培方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)外植體的選擇與滅菌；(2)腋芽的萌發(fā)；(3)叢生芽誘導(dǎo)；(4)成苗培養(yǎng)；(5)煉苗和移栽。2、如權(quán)利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(1)中，選擇當(dāng)年萌生的有嫩莖尖，先用無(wú)菌水沖洗干凈，去除葉鞘，切成具有l(wèi)-4個(gè)腋芽、長(zhǎng)3-5cm段，用0.5g/L的多菌靈溶液浸泡2-3個(gè)小時(shí)，再用75%乙醇消毒30秒鐘，用0.1%升汞水浸泡20分鐘，無(wú)菌水沖洗5-6次，取出材料，切成具有一個(gè)腋芽、長(zhǎng)度為lcm左右的小段，最后用12%次氯酸鈉殺菌30秒，無(wú)菌水沖洗5-6次。3、如權(quán)利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(2)中，所采用的培養(yǎng)基為加入5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料，如納米Ti02(Titaniumdioxide，Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-O納米粉體、納米Si02復(fù)配粉體、鎳納米材料、0.5mg/L的6-BA、l.Omg/L的NAA和150.0mg/L的椰子汁的Ns培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為在25±TC、光照1500-2000Lx、光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天。4、如權(quán)利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(3)中，所采用的培養(yǎng)基為加入5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料納米Ti02(Titaniumdioxide,Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復(fù)配粉體、鎳納米材料、l.Omg/LNAA和150.0mg/L的椰子汁的1/2Ne培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為在25±1°C、光照1500-2000Lx、光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天。5、如權(quán)利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(4)中，所采用的培養(yǎng)基為加入5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料納米Ti02(Titaniumdioxide，Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復(fù)配粉體、鎳納米材料、O.lmg/L的6-BA和1.0mg/LNAA的2/3MS成苗培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為在25±1°C、光照1500-2000Lx、光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天。全文摘要本發(fā)明屬生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供一種應(yīng)用納米技術(shù)促進(jìn)鐵皮石斛快速增殖的組培方法，通過(guò)將各種納米材料如納米TiO₂(Titaniumdioxide，TiO₂)、納米SnO₂、納米CdSe、納米SiO₂、納米Fe₃O₄/TiO₂、納米ZnO、納米SnSe₂、Ce-Mn-O納米粉體、納米SiO₂復(fù)配粉體、鎳納米材料等應(yīng)用于鐵皮石斛組織培養(yǎng)過(guò)程，促進(jìn)鐵皮石斛組培苗再生芽發(fā)育，從而達(dá)到鐵皮石斛快速增殖的目的。培養(yǎng)基中加入的納米材料顆粒的巨大表面積吸附了一部分植物激素，培養(yǎng)基中植物組織可利用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度相對(duì)下降，從而促進(jìn)植物組培苗再生芽的發(fā)育。文檔編號(hào)A01H4/00GK101548644SQ20091003812公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年3月25日優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日發(fā)明者劉星華申請(qǐng)人:劉星華;劉宏源