專利名稱：：轉(zhuǎn)移酶、差向異構(gòu)酶、編碼它們的多核苷酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備植物的組合物和方法。所述植物具有改變GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或改變的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或改變的抗壞血酸含
背景技術(shù)：
：抗壞血酸是植物中最豐富的可溶性抗氧化劑，其對(duì)于人和一些其他動(dòng)物也是首要的營養(yǎng)素?？箟难犸@著地有助于人類膳食中"游離自由基清除劑"或"抗氧化代謝產(chǎn)物"的全面攝入。令人信服的證據(jù)現(xiàn)在表明，這種代謝產(chǎn)物作為抗癌癥形成劑和預(yù)防冠心病單獨(dú)或者聯(lián)合地有助于健康和身體。人類攝入的幾乎全部的膳食抗壞血酸來源于植物產(chǎn)品。然而，植物組織的抗壞血酸含量顯著不同。同時(shí)，草本和木本植物中，葉子的抗壞血酸含量一般很高并相對(duì)一致，在非綠色的可食用的植物組織中，發(fā)現(xiàn)的抗壞血酸含量有巨大的無法解釋的不同。例如，在果實(shí)中，在Mz7r/an'aJW/a的卡姆果rcamucamu)中高達(dá)30mggFW-lAsA，而在Afe^//^genwaw/ca的枸禾己(medlar)中低于3|iggFW陽lAsA(Rodriguez等人1992,JChromatogrSci,30:433-437)。已報(bào)道獼猴桃中抗壞血酸值變化很大(Ferguson,A.R.，Botanicalnominclature:J"/mW<3c/n'we肌、y4c".mWat/Wc/ay",and」W/<i/fl"toy".kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.Warrington禾卩G.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.Beever，D.J禾口G.Hopkirk,Fruitdevelopmentandfruitphysiology.Kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.WarringtonandG.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.)。不同的藤蔓植物水果的抗壞血酸含量，對(duì)于美味獼猴桃(A^"c/ora)范圍是30-400mg/100g(Ferguson,A.R.,1991ActaHort.290:p.603-656,Spano,D.,等人，1997ActaHort.,.444:p.501-506.)，而對(duì)于栽培品種"Hayward"報(bào)道的范圍是80-120mg/100g(Beever，D.J禾口G.Hopkirk,Fruitdevelopmentandfruitphysiology.Kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.Warrington禾卩G.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.)。據(jù)報(bào)道，軟棗獼猴桃".wgwto)、中華獼猴桃".cW"e"&)(Muggleston,S.等人，Orchardist,1998.71(8):p.38-40,Chen,Q.和Q.Chen,CropGeneticResources,1998(2):p.3，Coggiatti，S.,1971ItalAgr，Oct,.108(10):p.935-941)、金花獼猴桃".c/7，朋Aa)和葛棗獼猴桃(^po(K^ma)的果實(shí)中含有較高濃度的抗壞血酸，在毛花獼猴桃(Aw/fl"決a)和闊葉獼猴桃(A中水平非常高(>1%鮮重)(Ferguson1991ActaHort.290:p.603-656.禾卩Ayto/om汰to(Kola,J.和J.Pavelka,1988Nahrung，.32(5):p.513-515)。已提出植物中生物合成抗壞血酸的三種途徑，一種是通過L-半乳糖(L-Gal)(Wheeler等人1998,淑騰393，365-369)，另一種是由肌醇(myoinositol)合成(Loe雨s和Kelly,1961,爿rc/z.歷oc/e附.5/op/^&95,483-493;Lorence等人，(2004)P/a"f尸/^w'o/.134，1200-1205)，第三種途徑是通過半乳糖醛酸(Agius等人2003，淑萬她c/mo/21，177-81)。L-Gal途徑通過L-半乳糖生成半乳糖酸-l，4-內(nèi)酯(galactono-l,4-lactone)，并因此形成抗壞血酸(Wheeler等人1998,Atow"393，365-369)。迄今為止，對(duì)于L-半乳糖途徑，已經(jīng)鑒定出來或至少部分鑒定出來編碼這些酶的所有基因和他們相關(guān)的酶活性，除了一種將GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)化成L-半乳糖-l-磷酸的推測(cè)的酶。被鑒定的基因和酶活性包括GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(Conklin,1998;Conklin等人，1999;Keller等人，1999)，GDP-D-甘露糖3',5'-差向異構(gòu)酶(Wolucka等人，2001;Wolucka和VanMontagu,2003;Watanabe等人，2006)，L-半乳糖-l-P磷酸酶(Laing等人，2004;Conklin等人，2006)，L-半乳糖脫氫酶(Wheeler等人，1998;Gatzek等人，2002;Laing等人，2004)和L-半乳糖酸-l,4-內(nèi)酯脫氫酶(Imai等人,1998;Bartoli等人，2005)。缺失的酶，沒有報(bào)道(最大限度地就申請(qǐng)人所知)其作為提取的或純化的酶活性，或者作為表達(dá)基因用于分析，其催化抗壞血酸生物合成的第二關(guān)鍵步驟(committedstep)。在抗臭氧的篩選中鑒定出擬南芥64ra6/tfo;w&Aa//awaJ游FTC2突變體，其還顯示出特別低的抗壞血酸水平的特征(Conklin等人,2000)。使用基于圖的方法來克隆突變基因Uander等人,2002)，并作為編碼新型蛋白的基因(At4g26850)將其鑒定。然而，據(jù)報(bào)該基因與擬南芥屬64ra6zWo/w^J的其他基因無同源性，除了同樣未鑒定的At5g55120和其他物種的其他未鑒定基因。據(jù)報(bào)道編碼的蛋白與擬南芥屬蛋白MC015.7，秀麗隱桿線蟲(Cae"w/wW^e/egara)蛋白C10F3.4和黑腹果蠅(Z)raw;/n7ame/a朋g氾妙)蛋白質(zhì)CG3552最相似，這些蛋白中無一具有證實(shí)的功能。盡管已報(bào)道擬南芥屬基因(AtAg26850)與FTC2突變體的四個(gè)等位基因互補(bǔ)，然而未提供細(xì)節(jié)(Jander等人，2002)。另外作者陳述"盡管我們有與VTC2突變相關(guān)的表型，然而在這些突變體中還需要發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致維生素C水平下降的調(diào)節(jié)途徑或生物合成途徑"。在產(chǎn)生抗壞血酸的生物合成途徑中鑒定編碼酶的基因，給以基于基因的方法操縱植物中抗壞血酸含量提供了機(jī)會(huì)。然而，盡管對(duì)于生物合成抗壞血酸的L-半乳糖途經(jīng)的許多步驟，已經(jīng)產(chǎn)生在L-半乳糖途經(jīng)中不同基因表達(dá)改變的轉(zhuǎn)基因植物或突變體，降低的基因表達(dá)(和酶的水平)能導(dǎo)致抗壞血酸降低，過表達(dá)不導(dǎo)致葉子中抗壞血酸增加(Ishikawa等人，2006和Conklin等人，2006)。本發(fā)明的目標(biāo)是為調(diào)節(jié)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性；和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的活性；和/或植物中的抗壞血酸含量提供改進(jìn)的組合物和方法，或至少為公眾提供有用的選擇。
發(fā)明內(nèi)容第一方面，本發(fā)明提供制備具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)的植物細(xì)胞或植物的方法，所述方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:1至11中任一氨基酸序列)或該多肽變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，該變體包含氨基酸序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列GYNSLGAFAT腿LHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:13.序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:1至11中任一個(gè)的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1至11中任一個(gè)的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:IO的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供制備具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自SEQIDNO:14至24之中任一序列的核苷酸序列)或其變體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14至24之中任一序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含編碼序列SEQIDNO:14至24之中任一序列的全長。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:14的全長編碼序列具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含編碼序列SEQIDNO:14的全長。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:19具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:19全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:20具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:20全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:21具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:21全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:22具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:22全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:23具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23的全長編碼序列。優(yōu)選地，通過本發(fā)明所述的方法制備的具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的植物或植物細(xì)胞還具有增加的抗壞血酸含量。在另一方面，本發(fā)明提供具有增加抗壞血酸含量的植物或植物細(xì)胞的方法，該方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:l至ll中任一個(gè)的氨基酸序列)或多肽變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列AINVSP正YGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列SEQIDNO:12和SEQIDNO:13.13在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll中任一個(gè)的多肽具有至少60%序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll中任一個(gè)的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中的多肽。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包含用編碼多肽(具有氨基酸序列SEQIDNO:25至35之中任一個(gè))或該多肽變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中變體具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含SEQIDNO:36和SEQIDNO:37序列。變體與氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1變體與氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:6變體與氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:7變體與氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:8變體與氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:9變體與氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽具有a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:10在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。以轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化可以任一順序連續(xù)進(jìn)行。另外，以差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化可同時(shí)發(fā)生。當(dāng)同時(shí)發(fā)生時(shí)，編碼差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶的序列可在同一構(gòu)建體或載體上或分別在不同構(gòu)建體或載體上。在另一方面，本發(fā)明提供制備具有增加抗壞血酸的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自SEQIDNO:14至24之中任一序列的核苷酸序列)或其變體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中變體編碼具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14至24之中的任一個(gè)具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中任一個(gè)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:14的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14的全長編碼序列。15在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:19具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:19的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:20具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:20的全長編碼序列具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:21具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:21全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:22具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:22全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:23具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:23的全長編碼序列。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包含用多核苷酸(包含選自SEQIDNO:38至48之中任一序列的核苷酸序列)或其變體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:38至48中任一個(gè)具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至48中的任一個(gè)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48中任一個(gè)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:38具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:39序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:39的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:40序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全長編碼序列。以轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化可以任一順序連續(xù)進(jìn)行?；蛘咭圆钕虍悩?gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，編碼差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶的序列可在同一構(gòu)建體或載體上，或分別在不同的構(gòu)建體或載體上。在另一方面，本發(fā)明提供制備具有增加GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:25至35之中任一氨基酸序列)或多肽變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含SEQIDNO:36和SEQIDNO:37序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一個(gè)的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一個(gè)的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供制備具有增加GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自序列SEQIDNO:38至48之中任一個(gè)的核苷酸序列)，或其變體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:38至48之中任一個(gè)具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至48中的任一個(gè)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48中任一個(gè)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:39具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:39的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:40具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全長編碼序列。在第一方面，本發(fā)明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)氨基酸序列)或多肽變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列AA固GGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列SEQIDNO:36禾卩SEQIDNO:37。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細(xì)胞或植物的方法，也可用編碼GDP-L-半乳糖-脒基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化該植物或植物細(xì)胞。以差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化可以任何順序連續(xù)進(jìn)行?；蛘呖梢圆钕虍悩?gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，編碼差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶的序列可在同一構(gòu)建體或載體上，也可分別在不同構(gòu)建體或載體上。優(yōu)選地，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶具有SEQIDNO:1至11的氨基酸序列，或該多肽的變體，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列A雨SP正YGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:13序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll之中任一個(gè)的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1至11之中任一個(gè)的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:7的20多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:IO的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自序列SEQIDNO:38至48之中任一個(gè)的核苷酸序列)或其變體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38至48之中的任一序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48之中的任一序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48之中任一的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38的序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:39序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:39的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全長編碼序列。制備具有增加抗壞血酸含量的植物細(xì)胞或植物方法的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式中，還是以編碼GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。以差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化可以任何順序連續(xù)進(jìn)行?；蛘呖梢圆钕虍悩?gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，編碼差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶的序列可在同一構(gòu)建體或載體上，也可分別在不同構(gòu)建體或載體上。優(yōu)選地，編碼GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸具有選自SEQIDNO:14至24之中的任一序列或其變體的核苷酸序列，其中該變體編碼具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:14至24.之中任一序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中任一全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:14的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:14全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:19的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:19的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:20的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:20的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:21的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:21的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:22的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:22的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:23的全長編碼序列。在另一方面，本發(fā)明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細(xì)胞或植物的方法，該方法包含以下列成分轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物a)編碼GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸；和b)編碼GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。23在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶包含與SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶包含SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶包含氨基酸序列A雨SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO:1至11之中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶包含氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll之中的任一個(gè)。在另一方面，本發(fā)明提供編碼多肽(包含選自SEQIDNO:1至7之中任一個(gè)的序列)或其變體的分離的多核苷酸，其中變體是GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列SEQIDNO:12禾BSEQIDNO:13。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:1至7中任一序列具有至少72%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含SEQIDNO:l至7中任一個(gè)的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:1的序列具有至少75%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:1。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:2的序列具有至少74%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:2。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，包含與SEQIDNO:3的序列具有至少75%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:3。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:4的序列具有至少78%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:4。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:5的序列具有至少75%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:5。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:6的序列具有至少72%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:6。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:7的序列具有至少73%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:7。在另一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸(包含SEQIDNO:14至20之中任一個(gè)的全長編碼序列)或其變體，其中變體編碼GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:14至20之中任一個(gè)的全長編碼序列具有至少68%序列同一性的序列。在一個(gè)具體實(shí)施方式中多核苷酸包含SEQIDNO:14至20之中任一個(gè)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:14至20之中任一個(gè)序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:14的全長編碼序列具有至少68%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:14序列之內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:15的全長編碼序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:15序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:15。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:16的全長編碼序列具有至少66%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:16序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:16。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:17的全長編碼序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:17序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:17。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:18的全長編碼序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:18序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:18。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:19的全長編碼序列具有至少68%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:19序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:20的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:20序列內(nèi)全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一方面，本發(fā)明提供包含氨基酸序列是SEQIDNO:1至7的分離的多肽或其變體，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體多肽與選自SEQIDNO:1至7之中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少72%序列同一性，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少75%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:1。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽具有與氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少74%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:2。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:3具有至少75%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:3。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:4的多肽具有至少78%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:4。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:5具有至少75%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:5。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列是SEQIDNO:6具有至少72%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:6。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:7具有至少73%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:7。在另一方面，本發(fā)明提供編碼多肽(包含選自SEQIDNO:25至27之中任一序列)或其變體的分離的多核苷酸，其中變體是GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含序列SEQIDNO:36和SEQIDNO:37。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:25至27中任一序列具有至少91%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含選自SEQIDNO:25至27中的任一序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:25序列具有至少91%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:25。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:26序列具有至少91%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:26。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO:27中任一序列具有至少91%同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:27。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:38至40中任一全長編碼序列的分離的多核苷酸或其變體，其中變體編碼GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體包含與SEQIDNO:38至40中任一全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至40中任一全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:38至40的任一序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:38的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:38序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:39序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:40序列內(nèi)的全長編碼序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一方面，本發(fā)明提供包含氨基酸序列SEQIDNO:25至27或其變體的分離的多肽，其中變體具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，變體多肽與選自SEQIDNO:25至27中任一氨基酸序列具有至少91%的序列同一性，其中變體具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:25具有至少91%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:25。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:26具有至少91%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:26。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:27具有至少91%的序列同一性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，分離多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:27。在另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明所述多肽的分離的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供包含下列成分的分離的多核苷酸a)包含本發(fā)明所述的多核苷酸的長度至少是15個(gè)核苷酸的片段的多核苷酸；b)包含本發(fā)明所述的多核苷酸的長度至少是15個(gè)核苷酸的互補(bǔ)的多核苷酸；或d)包含能與本發(fā)明所述的多核苷酸雜交的長度至少是15個(gè)核苷酸的序列的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)本發(fā)明所述的多核苷酸的遺傳構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)本發(fā)明所述的多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)本發(fā)明所述的多核苷酸的RNAi構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明所述的表達(dá)構(gòu)建體、遺傳構(gòu)建體或RNAi構(gòu)建體的載體。在另一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)本發(fā)明所述的表達(dá)構(gòu)建體或遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供遺傳改造的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)至少一個(gè)本發(fā)明所述的多核苷酸，或至少一個(gè)本發(fā)明所述的多肽。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是遺傳修飾的用于表達(dá)編碼GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸；和編碼GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供制備GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的多肽的方法，該方法包含培養(yǎng)包含能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶多肽的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體或本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供制備GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的酶產(chǎn)物的方法，該方法包含在酶的底物存在條件下，培養(yǎng)包括能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶多肽的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體或本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述的酶的底物可供應(yīng)給宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞中天然存在。在另一方面，本發(fā)明提供制備GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)包含能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體或本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供制備GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的酶產(chǎn)物的方法，該方法包括在酶的底物存在條件下，培養(yǎng)包括能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體或本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述的酶的底物可供應(yīng)給宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞中天然存在。在另一方面，本發(fā)明提供生物合成抗壞血酸的方法，該方法包含在抗壞血酸前體存在下，培養(yǎng)包含能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體或本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞的步驟，所述前體可補(bǔ)充給宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞中天然存在。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞還包含能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明提供生物合成抗壞血酸的方法，該方法包含在抗壞血酸前體存在下，培養(yǎng)包含能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體或本發(fā)明所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞的步驟，所述前體可補(bǔ)充給宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞中天然存在。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞還包含能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的本發(fā)明所述表達(dá)構(gòu)建體。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。優(yōu)選地，植物細(xì)胞是植物的一部分。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)至少一種本發(fā)明所述的多核苷酸，或至少一種本發(fā)明所述的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供植物細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種本發(fā)明所述的表達(dá)構(gòu)建體或至少一種本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體的。在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明所述的植物細(xì)胞的植物。在另一方面，本發(fā)明提供選擇GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗(yàn)用于本發(fā)明所述多核苷酸表達(dá)改變的植物。在另一方面，本發(fā)明提供選擇GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗(yàn)本發(fā)明所述多肽表達(dá)改變的植物。在另一方面，本發(fā)明提供選擇GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗(yàn)本發(fā)明所述多核苷酸表達(dá)改變的植物。在另一方面，本發(fā)明提供選擇GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗(yàn)本發(fā)明所述多肽表達(dá)改變的植物。在另一方面，本發(fā)明提供選擇抗壞血酸含量改變的植物的方法，該方法包含試驗(yàn)本發(fā)明所述多核苷酸或多肽的表達(dá)改變的植物。在另一方面，本發(fā)明提供通過本發(fā)明所述的方法制備出來的植物細(xì)胞或植物。優(yōu)選地，植物經(jīng)遺傳修飾，包括或表達(dá)本發(fā)明所述的多核苷酸或者多肽。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)本發(fā)明所述的方法選擇出來的植物。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)本發(fā)明所述的方法選擇出來的成組植物。優(yōu)選地，該組包括至少2個(gè)，更優(yōu)選至少3個(gè)，更優(yōu)選至少4個(gè)，更優(yōu)選至少5個(gè)，更優(yōu)選至少6個(gè)，更優(yōu)選至少7個(gè)，更優(yōu)選至少8個(gè)，更優(yōu)選至少9個(gè)，更優(yōu)選至少10個(gè)，更優(yōu)選至少11個(gè)，更優(yōu)選至少12個(gè)，更優(yōu)選至少13個(gè)，更優(yōu)選至少14個(gè)，更優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少16個(gè)，更優(yōu)選至少17個(gè)，更優(yōu)選至少18個(gè)，更優(yōu)選至少19個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)植物。在另一方面，本發(fā)明提供制備抗壞血酸的方法，該方法包含從本發(fā)明所述的植物細(xì)胞或植物中提取抗壞血酸。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定作為除草劑(herbicide)候選的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:1至11之中任一個(gè)序列或具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的其變體的多肽接觸；并且b)檢測(cè)所述化合物與所述多肽之間的結(jié)合是存在和/或缺失，其中結(jié)合提示所述化合物是除草劑候選。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定作為候選除草劑的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:1至11之中任一個(gè)序列或具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的其變體的多肽接觸；并且b)評(píng)價(jià)所述化合物對(duì)所述多肽的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定作為候選除草劑的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)序列或其變體的具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的多肽接觸；并且b)檢測(cè)所述化合物與所述多肽之間的結(jié)合是存在和/或缺失，其中結(jié)合提示所述化合物是候選除草劑。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定作為候選除草劑的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35之中任一個(gè)的序列或具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的其變體的多肽接觸；并且b)評(píng)價(jià)所述化合物對(duì)所述多肽的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)本發(fā)明所述的方法鑒定的化合物。在另一方面，本發(fā)明提供確定本發(fā)明所述的化合物是否具有除草劑活性的方法，其包含使植物或植物細(xì)胞與所述的候選除草劑接觸，并檢測(cè)所述植物或植物細(xì)胞的生長或存活的下降，其中所述下降是該化合物的除草劑活性的指征。在另一方面，本發(fā)明提供抗本發(fā)明所述多肽的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供制備L-半乳糖-l-磷酸的方法，所述的方法包含使GDP-L-半乳糖和GDP受體(包括己糖-l-磷酸或磷酸)與包含本發(fā)明所述多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物接觸以獲得L-半乳糖-l-磷酸。在另一方面，本發(fā)明提供制備GDP-半乳糖的方法，所述的方法包含使GDP-甘露糖與包含本發(fā)明所述多核苷酸或本發(fā)明所述多肽的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物接觸以獲得GDP-半乳糖。另外，在本發(fā)明所述的所有方面的具體實(shí)施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶是GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基轉(zhuǎn)移酶。類似地，在本發(fā)明所述的所有方面的可選擇的具體實(shí)施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性是GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基轉(zhuǎn)移酶活性。GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基轉(zhuǎn)移酶不必須地限于使用己糖-l-P作為GDP受體，還可使用其它GDP受體，如磷酸和焦磷酸。優(yōu)選地，其它GDP受體是磷酸。本發(fā)明所述的多核苷酸和多核苷酸的變體可來源于任何物種。多核苷酸和變體還可重組產(chǎn)生，還可是"基因重組"(geneshuffling)方法的產(chǎn)物。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸或變體來源于植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸或變體來源于裸子植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸或變體來源于被子植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，多核苷酸或變體來源于雙子葉(dicotyledonuous)植物物種。31本發(fā)明所述的多肽和多肽的變體可來源于任何物種。多核苷酸和變體還可是重組產(chǎn)生，還可由基因重組方法的產(chǎn)物表達(dá)而來。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的多肽或變體可來源于植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的多肽或變體來源于裸子植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的多肽或變體來源于被子植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的多肽或變體來源于雙子葉植物物種。本發(fā)明所述的植物細(xì)胞和植物，其包括那些其多核苷酸、變體多核苷酸、多肽和變體多肽來自任何物種的植物細(xì)胞和植物。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自裸子植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自被子植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自雙子葉植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自選自下列屬但不限于下列屬的水果物種獼猴桃屬、蘋果屬(Ma/M)、柑橘屬^CzYmy)、草莓屬(Trag"n'a)或越桔屬(Tflcc/"/調(diào))。特別優(yōu)選的水果植物物種是美味獼猴桃(JC^^7/"cfe//dOM)、中華獼猴桃".c/z/"潔^)、毛花獼猴桃".m'a"翻)、軟麥獼猴桃".a，to)、四種獼猴桃物種的雜交品種、蘋果(似fl/^ifowe幼'ca)和三葉海棠(Ma/ww/e6oW//)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自選自下列屬但不限于下列屬的蔬菜物種芥屬(5mw/ca)、番茄屬(丄戸戸Wco")或茄屬(5W朋,)。特別優(yōu)選的蔬菜植物物禾中是番茄(Z^copers/co"^a^"ftwz)和土豆(SWamwn赫ems,)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自單子葉植物物種。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，植物細(xì)胞和植物來自選自下列屬但不限于下列屬的農(nóng)作物物種大豆屬(G(yd"e)，玉蜀黍?qū)?Zea)，大麥屬(Z/oWe"m)或稻屬特別優(yōu)選的農(nóng)作物物種是水稻(Ot加s加/va)，大豆(Gfyc/"ewax)和玉米(Zea附ajKsO。具體實(shí)施例方式在本說明書中引用專利說明書、其它外部文件或其它信息來源的地方，這通常是為討論本發(fā)明的特征提供上下文的目的。除非是特意聲明，否則對(duì)這類外部文件的參考不應(yīng)解釋為以任何權(quán)限承認(rèn)這類文件，或這類信息來源是現(xiàn)有技術(shù)，或形成本領(lǐng)域一般公知常識(shí)的一部分。在本說明書中所使用的術(shù)語"包含"意味"至少由…部分組成"。當(dāng)在本說明書中解釋每個(gè)包括術(shù)語"包含"的陳述時(shí)，其他特征或者那些以該術(shù)語開始的特征也可出現(xiàn)。相關(guān)術(shù)語如"包括"和"含有"的解釋方式相同。本文所使用的術(shù)語"多核苷酸"意味著任意長度的單或雙鏈的脫氧核糖核酸或核糖核酸多聚體，但是優(yōu)選至少是15個(gè)核苷酸，且以非限制性實(shí)施例，包括基因的編碼和非編碼序列、正義和反義序列的互補(bǔ)區(qū)、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、前-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酸酶、重組多肽、分離的和純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成性RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文所提供的多核苷酸序列的"片段"是連續(xù)的核苷酸子序列，其能夠與感興趣的靶向特異地雜交，例如與至少長度為15個(gè)核苷酸的序列雜交。本發(fā)明所述的片段包含本發(fā)明所述的多核苷酸的15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少50核苷酸和最優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸的連續(xù)的核苷酸。多核苷酸序列片段能在反義、基因沉默，三螺旋或核酶技術(shù)中使用，或作為包括在芯片的引物、探針使用，或在本發(fā)明所述的基于多核苷酸的選擇方法中使用。術(shù)語"引物"是指短的通常有自由的3'0H基團(tuán)的多核苷酸，其與模板雜交并用于引發(fā)與靶向互補(bǔ)的多核苷酸的聚合作用。術(shù)語"探針"是指短的多核苷酸，其用于在基于雜交的檢測(cè)中，檢測(cè)與探針互補(bǔ)的多核苷酸序列。探針可由本文所定義的多核苷酸的"片段"組成。多彥微本文所使用的術(shù)語"多肽"包含任意長度的氨基酸鏈，但優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸，包括蛋白質(zhì)全長，其中氨基酸殘基通過共價(jià)肽鍵連接。本發(fā)明所述的多肽可是純化的天然產(chǎn)物，或可部分或全部用重組或合成技術(shù)制備。該術(shù)語可指多肽，多肽的聚合物，如二聚體或其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽的變體或其衍生物。多肽的"片段"是多肽的子序列，其發(fā)揮對(duì)于該多肽的生物活性所需的功能和/或形成該多肽的三維結(jié)構(gòu)。該術(shù)語可指能發(fā)揮上述酶的活性的多肽，多肽的聚合物如二聚體或其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽的變體或其衍生物。本文公開的用于多核苷酸或多肽序列的術(shù)語"分離的"用于指從他們的天然細(xì)胞環(huán)境中提取出來的序列。分離的分子可經(jīng)任何方法或包括生物化學(xué)、重組和合成技術(shù)方法的聯(lián)合使用而獲得。術(shù)語"重組"是指在其天然環(huán)境(context)中從其周圍的序列中提取出來的多核苷酸序列，和/或與在其天然環(huán)境中沒有的序列重組的多核苷酸序列。"重組"多肽序列通過從"重組"的多核苷酸序列翻譯而制備。來源于特定屬或物種的，關(guān)于本發(fā)明所述的多核苷酸或多肽的術(shù)語"來源于"是指與在那個(gè)屬或物種中發(fā)現(xiàn)的天然的多核苷酸或多肽具有相同序列的多核苷酸或多肽。來源于一個(gè)特定屬或物種的多核苷酸或多肽因此可合成或重組制備。,沐如在本文中所使用，術(shù)語"變體"是指區(qū)別于明確地鑒定過的序列的多核苷酸或多肽序列，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基被刪除、取代或添加。變體可是天然出現(xiàn)的等位基因變體，或是非天然出現(xiàn)的變體。變體可來自相同的或來自其它物種，且可包含同源物(homologues)，旁系同源物(paralogues)和直系同源物(orthologues)。在某些具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述多肽變體和多肽變體與本發(fā)明所述多肽或多肽具有相同或相似的生物學(xué)活性。術(shù)語"變體"當(dāng)指多肽時(shí)，該多肽包含所有形式的多肽和本文所定義的多肽。多提辦辦變體多核苷酸序列與本發(fā)明所述的序列優(yōu)選顯示出至少50%，更優(yōu)選至少51%，更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選至少53%，更優(yōu)選至少54%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少56%，更優(yōu)選至少57%，更優(yōu)選至少58%，更優(yōu)選至少59%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少61%，更優(yōu)選至少62%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少64%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少66%，更優(yōu)選至少67%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少69%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少71%，更優(yōu)選至少72%，更優(yōu)選至少73%，更優(yōu)選至少74%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少76%，更優(yōu)選至少77%，更優(yōu)選至少78%，更優(yōu)選至少79%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少81%，更優(yōu)選至少82%，更優(yōu)選至少83%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少86%，更優(yōu)選至少87%,更優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少卯％，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，和最優(yōu)選至少99%的同一性。在本發(fā)明所述多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸位置，優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸位置更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸位置的比較窗口內(nèi)，和最優(yōu)選在全長范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)同一性。能以下列方式確定多核苷酸序列同一性。使用BLASTN(來自BLAST程序組，version2.2.5[Nov2002])，將目標(biāo)多核苷酸序列與候選多核苷酸序列在bl2seq中進(jìn)行比較(bl2seq:TatianaA.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),"Blast2序歹U…一種比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的新工具"，F(xiàn)EMSMicrobiolLett.174:247-250)，可從NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blastA)公開獲得該軟件。使用bl2seq的缺省參數(shù)，除了應(yīng)關(guān)閉過濾低復(fù)雜性(lowcomplexity)部分。可使用下列的unix命令行參數(shù)檢査多核苷酸序列的同一性bl2seq-i核苷酸seql-j核苷酸seq2-FF-pblastn參數(shù)-FF關(guān)閉過濾低復(fù)雜性部分。參數(shù)-p為成對(duì)序列選擇合適的算法。bl2seq程序以行"同一性="中相同核苷酸的數(shù)目和百分?jǐn)?shù)報(bào)告序列同一性。多核苷酸序列同一性還可通過使用全面序列比對(duì)程序(globalsequencealignmentprogram)(例如Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)計(jì)算候選和目的多核苷酸序列之間重疊部分的全長得出。在EMBOSS軟件包的needle程序中發(fā)現(xiàn)Needleman-Wunsch全面比對(duì)算法的完全實(shí)施(Rice，P.Longden,I.禾卩Bleasby,A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,TrendsinGeneticsJune2000,vol16,No6.pp.276-277)，EMBOSS軟件包能從http:〃www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/獲得。歐洲生物信息學(xué)研究所服務(wù)器也提供在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在線進(jìn)行在兩個(gè)序列之間進(jìn)行EMBOSS-needle全面比對(duì)的工具。另夕卜，可使用GAP程序，該程序在無罰分末端空位(penalizingterminalgap)的條件下，計(jì)算兩個(gè)序列優(yōu)化的全面比對(duì)。下列文章描述了GAP:Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235。計(jì)算多核苷酸的％序列同一性的優(yōu)選方法是基于使用ClustalX對(duì)要比較的序列進(jìn)行比對(duì)(Jeanmougin等人，1998,7>e"A說oc/2e附.Sc/.23，403-5.)。本發(fā)明所述的多核苷酸變體還包含那些與一個(gè)或多個(gè)經(jīng)明確鑒定過的序列表現(xiàn)出相似性的變體，所述的經(jīng)明確鑒定過的序列可能保存那些序列的功能等價(jià)性，和那些不能合理地預(yù)測(cè)是隨機(jī)出現(xiàn)的變體。這種序列相對(duì)于多肽的相似性可使用公開可得到的NCBI上的BLAST程序組(version2.2.5[Nov2002])中bl2seq程序確定(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。多核苷酸序列的相似性可使用下列unix命令行參數(shù)檢測(cè)bl2seq-i核苷酸seql-j核苷酸seq2-FF-ptblastx參數(shù)-FF關(guān)閉過濾低復(fù)雜性部分。參數(shù)-p為成對(duì)序列選擇合適的算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列之間的相似性區(qū)域，且對(duì)于每個(gè)這種區(qū)域報(bào)告"E值"，其是一個(gè)人能在含有隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中偶然地預(yù)期見到這種匹配次數(shù)(times)的預(yù)測(cè)數(shù)目。這個(gè)數(shù)據(jù)庫的大小在bl2seq程序中缺省設(shè)置。對(duì)于比1小得多的小E值而言，E值約是這種隨機(jī)匹配的概率。當(dāng)與任何一種經(jīng)明確鑒定過的序列進(jìn)行比較時(shí)，變體多核苷酸序列優(yōu)選顯示其E值小于lx10—6，更優(yōu)選小于lx10—9，更優(yōu)選小于lxl(T12，更優(yōu)選小于lx10—15，更優(yōu)選小于lxl(T18.更優(yōu)選小于lxl0—21，更優(yōu)選小于Ixl0—3Q更優(yōu)選小于lxl0—4().更優(yōu)選小于lxl0—5Q,更優(yōu)選小于1x10—6Q更優(yōu)選小于lxlO—7(),更優(yōu)選小于lxl(T8Q更優(yōu)選小于lxl0^且最優(yōu)選小于Ixl0-1(K)。另外，在嚴(yán)緊條件下，本發(fā)明所述的變體多核苷酸與特定的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交。術(shù)語"在嚴(yán)緊條件下雜交"和與其語法意義相同的術(shù)語是指在限定溫度和鹽濃度的條件下，多核苷酸分子與靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印跡上的靶多核苷酸分子，如Southern印跡或Northern印跡)雜交的能力。在嚴(yán)緊雜交條件下雜交的能力能通過最初在缺乏嚴(yán)緊性的條件下雜交，然后將嚴(yán)緊性增加到所需的嚴(yán)緊性而確定。就長度上在約100個(gè)堿基以上的多核苷酸分子而言，典型的嚴(yán)緊性雜交條件是低于天然雙螺旋的熔解溫度(Tm)，不超過25至30。C(例如10°C)(—般見Sambrook等人Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Ausubel等人，1987,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing)。對(duì)于約100個(gè)堿基以上的多核苷酸分子的Tm能通過公式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+)(Sambrook等人，Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Bolton禾口McCarthy,1962，PNAS84:1390)計(jì)算得出。長度100個(gè)堿基以上多核苷酸典型的嚴(yán)緊性條件是如下的雜交條件以6XSSC，0.2%SDS溶液預(yù)洗；于65°C雜交，6XSSC，0.2%SDS過夜；接著在IXSSC，0.1%SDS于65°C沖洗兩次，每次30分鐘，和在0.2XSSC,0.1%SDS于65。C沖洗兩次，每次30分鐘。就長度在100堿基以下的多核苷酸分子而言，示例性嚴(yán)緊性雜交條件是低于Tm5至10°C。平均而言，長度在100bp以下的多核苷酸分子的Tm約下降(500/寡核苷酸長度)。C。就已知是肽核酸(PNA)的DNA擬似體(Nielsen等人，Science.1991Dec6;254(5037):1497-500)而言，其Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA雜交分子的Tm值，且能使用Giesen等人所述的公式來計(jì)算(Giesen等人，NucleicAcidsRes.1998Nov1;26(21):5004-6)。長度在100堿基以下的DNA-PNA雜交的示例性嚴(yán)緊性雜交條件是低于Tm5至10°C。本發(fā)明所述的變體多核苷酸不僅包含區(qū)別于本發(fā)明所述序列的多核苷酸，還包含作為遺傳密碼的簡并性結(jié)果，編碼與本發(fā)明所述多核苷酸編碼的多肽具有相似活性的多肽的多核苷酸。不改變多肽氨基酸序列的序列改變是"沉默變異"。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，可通過本領(lǐng)域公知技術(shù)改變對(duì)于同一氨基酸的其他密碼子，例如為了在特定宿主生物體中優(yōu)化表達(dá)密碼子。本發(fā)明還包括導(dǎo)致在其編碼的多肽序列上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的保守性取代，而未顯著改變其生物學(xué)活性的多核苷酸序列的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解形成表型沉默的氨基酸取代的方法(見例如Bowie等人，1990，Science247,1306)。由于在其編碼的多肽序列上的沉默變異和保守性取代而產(chǎn)生的變體多核苷酸可使用從NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公開得到的BLAST的程序組(version2.2.5[Nov2002])中的bl2s叫程序(version2.2.5[Nov2002])經(jīng)以前描述過的tblastx算法而確定。本發(fā)明所述的變體多核苷酸作為GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的功能可通過如在實(shí)施例部分所述的例如通過這種序列在細(xì)菌中的表達(dá)，并檢測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的活性而評(píng)價(jià)。變體的功能還可通過其改變植物中的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性或抗壞血酸含量的能力而檢測(cè)，該方法在本文的實(shí)施例部分也做了描述。36本發(fā)明所述的變體多核苷酸作為GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的功能可通過如在實(shí)施例部分所述的例如通過這種序列在細(xì)菌中的表達(dá)，并檢測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的活性而評(píng)價(jià)。變體的功能還可通過其改變植物中的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性或抗壞血酸含量的能力而檢測(cè)，該方法在本文的實(shí)施例部分也做了描述。多厳沐術(shù)語"變體"是指包含天然存在的，重組的和合成產(chǎn)生的多肽的多肽。變體多肽的序列與本發(fā)明所述序列優(yōu)選顯示出至少50%，更優(yōu)選至少51%，更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選至少53%，更優(yōu)選至少54%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少56%，更優(yōu)選至少57%，更優(yōu)選至少58%，更優(yōu)選至少59%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少61%，更優(yōu)選至少62%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少64%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少66%，更優(yōu)選至少67%，更優(yōu)選至少68%，更優(yōu)選至少69%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少71%，更優(yōu)選至少72%，更優(yōu)選至少73%，更優(yōu)選至少74%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少76%,更優(yōu)選至少77%，更優(yōu)選至少78%，更優(yōu)選至少79%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少81%，更優(yōu)選至少82%，更優(yōu)選至少83%，更優(yōu)選至少84%,更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少86%，更優(yōu)選至少87%，更優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%,更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，和最優(yōu)選至少99%的同一性。同一性經(jīng)本發(fā)明所述多肽的至少20個(gè)氨基酸位置，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸位置，更優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸位置，和最優(yōu)選經(jīng)全長的比較窗口而發(fā)現(xiàn)。能通過下列方式確定多肽序列的同一性。將目標(biāo)多肽序列與候選多肽序列使用BLASTP(來自BLAST程序組，version2.2.5[Nov2002])在bl2seq中進(jìn)行比較，可公開從NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih,gov/blast/)得到bl2seq。除應(yīng)關(guān)閉過濾低復(fù)雜性區(qū)域外，使用bl2seq的缺省參數(shù)。多肽序列同一性還可使用全面序列比對(duì)程序計(jì)算候選和目標(biāo)多核苷酸序列之間重疊部分的全長而得出。上文討論過的EMBOSS-needle(從http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/可得到)禾卩GAP(Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235.)也是計(jì)算多肽序列同一性合適的全面序列比對(duì)程序。計(jì)算多肽％序列同一性的優(yōu)選的方法是基于使用CkistalX將待比較序列進(jìn)行比對(duì)(Jeanmougin等人，1998,7>ew&歷oc/e肌Sd.23，403-5.)。本發(fā)明所述的多肽變體還包含那些與一個(gè)或多個(gè)經(jīng)明確鑒定過的序列表現(xiàn)出相似性的變體，所述的經(jīng)明確鑒定過的序列可能保存那些序列的功能等價(jià)性，和那些不能合理地預(yù)測(cè)是隨機(jī)出現(xiàn)的變體。這種序列相對(duì)于多肽的相似性可使用公開可得到的來自NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)BLAST程序組(version2.2.5[Nov2002])的bl2seq程序確定。多肽序列的相似性可使用下列unix命令行參數(shù)檢測(cè)bl2seq—i肽seql-j肽seq2-FF—pblastp當(dāng)與任何一種經(jīng)明確鑒定過的序列進(jìn)行比較時(shí)，變體多肽序列優(yōu)選地顯示出lxlO《以下，更優(yōu)選lxlO"以下，更優(yōu)選lxl(T12以下，更優(yōu)選lxl(T15以下，更優(yōu)選lx10—18以下，更優(yōu)選lxl(T21以下，更優(yōu)選lxlO^以下，更優(yōu)選lxlO"^以下，更優(yōu)選1x10—5()以下，更優(yōu)選lxlO—w以下，更優(yōu)選lxlO^以下，更優(yōu)選lx10—8()以下，更優(yōu)選lxl(T9()以下和最優(yōu)選1x10—1Qe以下的E值。參數(shù)-FF關(guān)閉過濾低復(fù)雜性部分。參數(shù)-p為成對(duì)序列選擇合適的算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列之間的相似性區(qū)域，且對(duì)于每個(gè)這種區(qū)域報(bào)告"E值"，其是，一個(gè)人能在含有隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中偶然地預(yù)期見到這種匹配次數(shù)(times)的預(yù)測(cè)數(shù)目。對(duì)于比1小得多的小E值而言，這約是這種隨機(jī)匹配的概率。本發(fā)明還包括不顯著改變其生物學(xué)活性，保守性取代在所述多肽序列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解形成表型沉默的氨基酸取代的方法(見例如Bowie等人，19卯，Science247,1306)。多肽變體作為GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的功能可通過在本文的實(shí)施例部分描述的方法而評(píng)價(jià)。多肽變體作為GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的功能可通過在本文的實(shí)施例部分描述的方法而評(píng)價(jià)。賴達(dá)體、載沐J真成分術(shù)語"遺傳構(gòu)建體"是指一種多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA，其有插入其中的另一種多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)，如，但不限于cDNA分子。遺傳構(gòu)建體可含有必要的元件，該元件使插入的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄，并且可選地，將轉(zhuǎn)錄本翻譯成多肽。插入的多核苷酸分子可來源于宿主細(xì)胞，或可來源于不同的細(xì)胞或生物體和/或可是重組的多核苷酸。一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，遺傳構(gòu)建體可整合進(jìn)入宿主的染色體DNA中。遺傳構(gòu)建體可連接到載體上。術(shù)語"載體"是指一種多核苷酸分子，其通常是雙鏈DNA，其用于將遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞。載體可能夠在至少一個(gè)另一種宿主系統(tǒng)(如大腸桿菌(￡.co//.))中復(fù)制。術(shù)語"表達(dá)構(gòu)建體"是指一種遺傳構(gòu)建體，其包括使插入的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄的，并且可選地使轉(zhuǎn)錄本翻譯成多肽的必要元件。表達(dá)構(gòu)建體典型地在其5'至3'方向包含a)在宿主細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，在宿主細(xì)胞中可以轉(zhuǎn)化構(gòu)建體，b)待表達(dá)的多核苷酸，和c)在宿主細(xì)胞中有功能的終止子，在宿主細(xì)胞中可以轉(zhuǎn)化構(gòu)建體。術(shù)語"編碼區(qū)"或"開放閱讀框"(ORF)是指基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈，其能夠在合適的調(diào)控序列控制下，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽。通過5'翻譯起始密碼子和3'翻譯終止密碼子的存在來鑒定編碼序列。當(dāng)插入遺傳構(gòu)建體中時(shí)，當(dāng)將其與啟動(dòng)子和終止子序列可操作性地連接時(shí)，能表達(dá)"編碼序列"。"可操作性地連接"意味著將待表達(dá)的序列置于包括啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)控元件、瞬時(shí)調(diào)控元件，增強(qiáng)子，抑制子和終止子的調(diào)控元件的控制之下。術(shù)語"非編碼區(qū)"是指非翻譯序列，其在翻譯起始位點(diǎn)的上游和在翻譯終止位點(diǎn)的下游。這些序列還分別指5'UTR和3'UTR。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄起始和終止和翻譯效率調(diào)控所需的元件。終止子是終止轉(zhuǎn)錄的序列，并且發(fā)現(xiàn)其在翻譯序列的下游的基因3'非翻譯末端。終止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定子，且在某些情況中被發(fā)現(xiàn)具有空間調(diào)控功能。術(shù)語"啟動(dòng)子"是指在編碼區(qū)上游的非轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)控元件，其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子包含順式起始元件，其指明轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和保守盒如TATA盒和與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序。"轉(zhuǎn)基因"是取自一種生物體，并通過轉(zhuǎn)化引入不同生物體中的多核苷酸。轉(zhuǎn)基因可來源于與轉(zhuǎn)基因被引入的生物體相同的物種或不同的物種。"轉(zhuǎn)基因植物"是指通過遺傳操作或轉(zhuǎn)化而含有新的遺傳物質(zhì)的植物。新的遺傳物質(zhì)可來源于與所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物相同的物種或不同的物種。"插入重復(fù)"是重復(fù)的序列，在該重復(fù)序列的第二部分是在互補(bǔ)鏈上，如(5')GATCTA.......TAGATC(3，)(3，)CTAGAT.......ATCTAG(5，)。通讀轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本，其進(jìn)行互補(bǔ)性堿基配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，假如在重復(fù)區(qū)域之間有3-5bp空間的話。術(shù)語本發(fā)明所述的多核苷酸或多肽的術(shù)語"改變表達(dá)"和"表達(dá)改變"旨在包含這種情況修飾與本發(fā)明所述的多核苷酸對(duì)應(yīng)的基因組DNA，以至于改變本發(fā)明所述的多核苷酸或多肽的表達(dá)?；蚪MDNA的修飾可通過遺傳轉(zhuǎn)化或本領(lǐng)域已知引入突變的其他方法。"表達(dá)改變"能與信使RNA和/或產(chǎn)生的多肽的量的增加或減少相關(guān)，且還可由于多核苷酸和所產(chǎn)生多肽的序列改變而導(dǎo)致多肽活性改變。本申請(qǐng)人己經(jīng)鑒定出編碼新型多肽(分別是SEQIDNO:l至7)的新型多核苷酸(SEQIDNO:14至20)，該多肽具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性。本申請(qǐng)人還表明另外已知的但是未經(jīng)鑒定的，具有以前未知活性的序列(分別編碼SEQIDNO:8至11的SEQIDNO:21至24的多核苷酸)，也是GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶序列。本申請(qǐng)人已表明，所有公開的多肽序列(SEQIDNO:1至11)顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本申請(qǐng)人還已經(jīng)鑒定出兩個(gè)共有多肽序列(consensuspolyp印tides叫uence)基序(SEQIDNO:12和13)，這兩種基序在所有的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶序列中都存在。相似地，本申請(qǐng)人已經(jīng)顯示出所有公開的多核苷酸序列(SEQIDNO:14至24)顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本發(fā)明提供遺傳構(gòu)建體、載體和含有該多核苷酸序列的植物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體和載體的植物。本發(fā)明提供相對(duì)于合適的對(duì)照植物，其GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性改變的植物，和相對(duì)于合適的對(duì)照植物，其抗壞血酸含量改變的植物。本發(fā)明提供GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性增加和抗壞血酸含量增加的植物。本發(fā)明還提供制備這種植物的方法和選擇這種植物的方法。本發(fā)明還提供鑒定除草劑化合物的方法，該除草劑化合物抑制本發(fā)明所述的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶多肽的活性。合適的對(duì)照植物包括相同物種的非轉(zhuǎn)化植物或變種或以對(duì)照構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。合適的對(duì)照植物不包括具有突變的植物，所述突變導(dǎo)致的改變?nèi)鏕DP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶含量下降，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性下降或抗壞血酸含量下降。本申請(qǐng)人還鑒定出編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的新型多肽(分別是SEQIDNO:25至27)的新型多核苷酸(SEQIDNO:38至40)。本申請(qǐng)人已表明所有多肽序列(SEQIDNO:25至35)公開的差向異構(gòu)酶顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本申請(qǐng)人還已經(jīng)鑒定出兩個(gè)共有多肽序列基序(SEQIDNO:36和37)，這兩種基序在所有的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶序列中都存在。相似地，本申請(qǐng)人已表明所有公開的差向異構(gòu)酶的多核苷酸序列(SEQIDNO:38至48)顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本發(fā)明提供含有新型多核苷酸序列(SEQIDNO:38至40)或編碼新型多肽序列(SEQIDNO:25至27)的序列的遺傳構(gòu)建體、載體和植物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體和載體的植物。本發(fā)明提供相對(duì)于合適的對(duì)照植物，其GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性改變的植物，和相對(duì)于合適的對(duì)照植物，其抗壞血酸含量改變的植物。本發(fā)明提供GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性增加和抗壞血酸含量增加的植物。本發(fā)明還提供制備這種植物的方法和選擇這種植物的方法。本發(fā)明還提供鑒定除草劑化合物的方法，該除草劑化合物抑制本發(fā)明所述的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽的活性。合適的對(duì)照植物包括相同物種的非轉(zhuǎn)化植物或變種或以對(duì)照構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。此外，本申請(qǐng)人已表明GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶和GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶在植物中的聯(lián)合表達(dá)導(dǎo)致植物中抗壞血酸含量增加，其大于任一種酶單獨(dú)表達(dá)時(shí)的量。此外，本申請(qǐng)人已表明當(dāng)植物細(xì)胞或植物中這兩種酶過表達(dá)時(shí)，存在協(xié)同作用。當(dāng)這兩種酶一同在植物中過表達(dá)時(shí)，抗壞血酸的增加程度大于過表達(dá)一種酶所導(dǎo)致的抗壞血酸的增加程度加上過表達(dá)另一種酶所導(dǎo)致的抗壞血酸的增加程度之和。本發(fā)明提供制備基于這種聯(lián)合表達(dá)的，相對(duì)于對(duì)照植物，抗壞血酸增加的植物的方法。本發(fā)明提供通過這種方法制備的植物。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶序列的植物。分麟縱錄微游膽本發(fā)明所述的多核苷酸分子能通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)來分離。通過舉例的方式，這種多肽能通過使用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離(見Mullis等人，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser,作為參考并入本文)。本發(fā)明所述的多肽能使用引物進(jìn)行擴(kuò)增，該引物如本文所限定，其來源于本發(fā)明所述的多核苷酸序列。分離本發(fā)明所述的多核苷酸的另外方法包括使用全部或部分的具有文中作為雜交探針使用的序列的多肽。能使用標(biāo)記的多核苷酸探針與固定在固相支持物(如硝酸纖維素膜或尼龍膜)上的多核苷酸雜交的技術(shù)來篩選基因組文庫或cDNA文庫。示例性雜交和洗膜條件是于65。C在5.0XSSC，0.5%十二烷基磺酸鈉，IXDenhardt氏溶液中雜交20小時(shí)；在1.0XSSC，P/。(w/v)十二烷基磺酸鈉洗膜(于55°C，洗三次，每次20分鐘)，且可選地在0.5XSSC，l%(w/v)十二烷基磺酸鈉于60°C洗膜一次(20分鐘)?？蛇x的進(jìn)一步洗膜(20分鐘)的方法能在0.1XSSC，l%(w/v)十二烷基磺酸鈉于60°C條件下進(jìn)行。本發(fā)明所述的多核苷酸片段可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備，這些技術(shù)如限制性核酸內(nèi)切酶消化、寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增。在本領(lǐng)域所熟知的方法中可使用部分多核苷酸序列來鑒定相應(yīng)的全長多核苷酸序列。這種方法包括基于PCR的方法、5'RACE(FrohmanMA，1993,MethodsEnzymol.218:340-56)和基于雜交的方法、基于計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫的方法。另外，通過示例性方式，反向PCR可獲得本文公開的多核苷酸序列側(cè)翼的未知序列，該序列起始于基于已知區(qū)域的引物(Triglia等人，1998,M/c/e/c爿c/Aie;y16,8186，通過引用并入本文)。該方法用幾種限制性酶在基因的已知區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生合適的片段。然后將片段通過分子內(nèi)連接環(huán)形化，并作為PCR模板。從已知區(qū)域設(shè)計(jì)分枝引物(Divergentprimer)。為了物理性裝配全長的克隆，能使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。當(dāng)從特定物種制備轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，以序列或來源于該物種的序列轉(zhuǎn)化這種植物可以是有益的。這種益處可緩解關(guān)于物種間交叉轉(zhuǎn)化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體的公眾的擔(dān)心。此外，當(dāng)基因的下調(diào)是所期望的結(jié)果時(shí)，有必要利用與植物中序列相同(或至少高度相似)的序列，對(duì)于該植物，減少表達(dá)是期望的。為了其他原因中的這些原因，期望能在不同的植物物種中鑒定和分離特定基因的直系同源物。可通過所述的方法鑒定變體(包括直系同源物)。鑒定鄉(xiāng)游方法激潘方茲可使用基于PCR的方法鑒定變體多肽((Mullis等人，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser)。通常，引物的多核苷酸序列可以基于編碼相應(yīng)氨基酸序列的保守區(qū)序列，所述的引物用于通過PCR擴(kuò)增本發(fā)明所述多核苷酸分子的變體。另外，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的文庫篩選方法(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。當(dāng)鑒定探針序列的變體時(shí)，雜交和/或洗的嚴(yán)緊性通常相對(duì)于當(dāng)尋找完全序列匹配(exactsequencematch)的嚴(yán)緊性下降。也可通過物理方法鑒定多肽變體，例如，通過使用抗本發(fā)明所述多肽的抗體篩選表達(dá)文庫(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd-ColdSpringHarborPress,1987)或在這種抗體的幫助下從天然來源中鑒定該多肽。基晉,赫灘本發(fā)明所述的變體序列，包括多核苷酸和多肽變體，還可通過基于計(jì)算機(jī)的方法進(jìn)行鑒定，所述的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，該方法使用公共結(jié)構(gòu)域比對(duì)算法和序列相似性査找工具查找序列數(shù)據(jù)庫(公共結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)(見例如NucleicAcidsRes.29:1-10和11-16,2001)，其是在線資源的例子。相似性查找尋回(retrieve)和比對(duì)靶序列以與待分析的序列(即查詢序列(querysequence))進(jìn)行比較。序列比較算法使用分值矩陣(scoringmatrix)賦予每次比對(duì)一個(gè)全面的分值。用于在序列數(shù)據(jù)庫中鑒定變體的示例性程序族是BLAST程序組(version2.2.5[Nov2002])，其包括BLASTN,BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX，這些軟件是公眾可從(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blastA)或從生物技術(shù)信息國家中心(NCBI)，國家醫(yī)學(xué)圖書館(Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894USA.)得到。NCBI服務(wù)器還提供使用這些程序篩選大量公眾可得到的序列數(shù)據(jù)庫的工具。BLASTN將核苷酸查尋序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。BLASTP將氨基酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。BLASTX將以所有閱讀框翻譯的核苷酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。tBLASTN將蛋白質(zhì)查詢序列與以所有閱讀框動(dòng)態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。tBLASTX將核苷酸查詢序列的六種框翻譯產(chǎn)物與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的六種框翻譯產(chǎn)物進(jìn)行比較。BLAST程序可使用缺省參數(shù)或可因需要而改變參數(shù)來改進(jìn)篩選。出版物(Altschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-3402，1997)描述了包括BLASTN，BLASTP和BLASTX的BLAST家族算法的使用。當(dāng)通過BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似的算法產(chǎn)生的查尋序列，通過該査詢序列"命中"(hit)—個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫序列時(shí)，對(duì)命中序列的相似部分進(jìn)行比對(duì)和鑒定。以相似程度和序列重疊的長度的順序排列命中序列。數(shù)據(jù)庫序列的命中序列一般代表與僅僅一部分查尋序列的序列長度的重疊部分。對(duì)于比對(duì)，BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX算法還產(chǎn)生"預(yù)期"值。預(yù)期值(E)提示，當(dāng)查找含有隨機(jī)連續(xù)序列的相同大小的數(shù)據(jù)庫時(shí)，一個(gè)人能"預(yù)期"偶然發(fā)現(xiàn)的命中序列的數(shù)目。預(yù)期值用作顯著性的閾值以確定對(duì)于數(shù)據(jù)庫的命中序列是否提示真實(shí)的相似性。例如，指定多核苷酸的E值是O.l，命中解釋為在被篩選數(shù)據(jù)庫大小的數(shù)據(jù)庫中，在具有相似分值的序列的比對(duì)部分，一個(gè)人可預(yù)期只經(jīng)偶然發(fā)現(xiàn)O.l匹配。對(duì)于在比對(duì)和匹配部分，E值是0.01或更低的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在那個(gè)數(shù)據(jù)庫中偶然發(fā)現(xiàn)匹配的可能性是1%或更低。成組相關(guān)序列的多重序列比對(duì)能用CLUSTALW進(jìn)行(Thompson,J.D.,Higgins:D.G.和Gibson,T丄(1994)CLUSTALW:通過序列加權(quán)(sequenceweighting),位置特異性空位罰分和加權(quán)矩陣選擇改進(jìn)進(jìn)展性多重序列比對(duì)的敏感性。NucleicAcidsResearch,22:4673-4680,http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame,DesmondG.Higgins，JaapHeringa，T-Coffee:Anovelmethodforfast禾卩accuratemultiple序歹llalignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217)或PILEUP，其使用進(jìn)展性成對(duì)比對(duì)(FengandDoolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351)。模式識(shí)別應(yīng)用軟件可用于發(fā)現(xiàn)基序或特征序列。例如，MEME(基序引出的多重Em)在成組序列中發(fā)現(xiàn)的基序或特征序列，且MAST(基序比對(duì)和查尋工具)使用這些基序鑒定查尋序列上的相似或相同基序。MAST結(jié)果以具有合適統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)的一系列比對(duì)和被發(fā)現(xiàn)基序的可視概況提供。MEME和MAST是在加利福尼亞大學(xué)(圣迭哥)開發(fā)出來。PROSITE(Bairoch和Bucher，1994,NucleicAcidsRes.22,3583;Hofmann等人,1999,NucleicAcidsRes.27，215)是一種鑒定從基因組或cDNA序列翻譯過來的未鑒定蛋白質(zhì)功能的方法。PROSITE數(shù)據(jù)庫(www.expasy.org/prosite)含有生物學(xué)重要模式和圖譜，且其設(shè)計(jì)成能以合適的計(jì)算機(jī)工具將新序列分配到已知蛋白質(zhì)家族中或確定序列中存在哪個(gè)已知結(jié)構(gòu)域(Falquet等人，2002，NucleicAcidsRes.30,235)。Proseaxch是能以給定的序列模式或特征來査找SWISS-PROT和EMBL數(shù)據(jù)庫的工具。分庸多詹減本發(fā)明所述的多肽，包括變體多肽，可使用本領(lǐng)域所熟知的肽合成方法制備，如使用固相技術(shù)的直接肽合成(例如Stewart等人，1969,inSolid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,SanFranciscoCalifornia,orautomatedsynthesis,forexamplesusinganAppliedBiosystems431APeptideSynthesizer(FosterCity,California)。多肽的突變形式也可在這種合成過程中制備。本發(fā)明所述多肽和變體多肽也可從天然來源中使用各種本領(lǐng)域所熟知的各種技術(shù)純化而來(例如Deutscher,1990,Ed，MethodsinEnzymology,Vol.182,Gw/tfeto另外，本發(fā)明所述的多肽和變體多肽可在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)并從以下將討論的細(xì)胞中分離出來。劍備/爐沐織沐游膽本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體包含一條或多條本發(fā)明所述的多核苷酸序列和/或編碼本發(fā)明所述多肽的多核苷酸，且可用于轉(zhuǎn)化例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或植物生物體。本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體旨在包括本文所定義的表達(dá)構(gòu)建體。制備和使用遺傳構(gòu)建體和載體的方法是本領(lǐng)域所熟知的(且一般見Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987所述)?？v船多提艦辦銀纖沐游存主銀蕭膽本發(fā)明提供包含本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可來源于例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或植物生物體。在本領(lǐng)域所熟知的方法中，本發(fā)明所述的包含遺傳構(gòu)建體如表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，對(duì)于重組制備本發(fā)明所述的多肽是有用的(例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987)。這些方、法可包含將宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中在適于或有益于表達(dá)本發(fā)明所述多肽的條件下培養(yǎng)。表達(dá)的重組多肽，其可選的可分泌至培養(yǎng)物中，然后可將其從培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或培養(yǎng)的培養(yǎng)基中采用本領(lǐng)域所熟知的方法分離(例如Deutscher，Ed，19卯,MethodsinEnzymology,Vol182,GuidetoProteinPurification)。劍備包舒鍵沐滅伴爐激細(xì)維赫膽本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體的植物細(xì)胞和經(jīng)修飾改變本發(fā)明所述多核苷酸或多肽表達(dá)的植物細(xì)胞。包含這種細(xì)胞的植物還形成本發(fā)明的一個(gè)方面。GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶和/或抗壞血酸含量的改變也可在植物中通過本發(fā)明所述的方法來改變。這些方法可包含本發(fā)明所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，該構(gòu)建體被設(shè)計(jì)成用于在這種植物細(xì)胞或植物中改變調(diào)節(jié)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或抗壞血酸含量的多核苷酸或多肽的表達(dá)。這種方法還包括以本發(fā)明所述的構(gòu)建體和一種或多種其它構(gòu)建體聯(lián)合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，所述其它構(gòu)建體被設(shè)計(jì)用于在這種植物細(xì)胞和植物中改變調(diào)節(jié)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或抗壞血酸含量的一種或多種多核苷酸或多肽的表達(dá)。以多肽轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物及其各部分的方法如文獻(xiàn)所述(Draper等人，1988,PlantGeneticTransformationandGeneExpression.ALaboratoryManual.BlackwellSci.Pub.Oxford,p.365;Potrykus禾口Spangenburg,1995,GeneTransfertoPlants.Springer陽Verlag，Berlin.;禾口Gelvin等人,1993,PlantMolecularBiol.Manual.Kl麗erAcad.Pub.Dordrecht.Areviewoftransgenicplants,includingtransformationtechniques,isprovidedinGalun禾口Breiman,1997,TransgenicPlants.ImperialCollegePress,London.)。潛激遺傳鮮游減可得到多種植物轉(zhuǎn)化策略(例如Birch,1997,AnnRevPlantPhysPlantMolBiol,48，297，HellensRP等人(2000)PlantMolBiol42:819-32,HellensR等人PlantMethl:13)。例如，策略可設(shè)計(jì)成在植物細(xì)胞、器官中和/或在多核苷酸/多肽在是正常表達(dá)的特定發(fā)育階段增加其表達(dá)，或設(shè)計(jì)成在細(xì)胞、組織、器官中和/或在其是不正常表達(dá)的特定發(fā)育階段異位表達(dá)所述多核苷酸/多肽。表達(dá)的多核苷酸/多肽可來源于被轉(zhuǎn)化的植物物種，或可來源于不同的植物物種。轉(zhuǎn)化策略可設(shè)計(jì)成在植物細(xì)胞、器官中或在多核苷酸/多肽是正常表達(dá)的特定的發(fā)育階段減少其表達(dá)。這些策略稱為基因沉默策略。用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因的遺傳構(gòu)建體通常包括驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)克隆的多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子，終止子和可選擇的用于檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因植物中遺傳構(gòu)建體存在的標(biāo)記序列。適合用于本發(fā)明所述的構(gòu)建體的啟動(dòng)子在單子葉植物或雙子葉植物的細(xì)胞、組織或器官中是功能性的，且其包括細(xì)胞特異性、組織特異性或器官特異性的啟動(dòng)子，細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子，瞬時(shí)啟動(dòng)子，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在大多數(shù)植物組織中有活性的組成性啟動(dòng)子和重組啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的選擇取決于所期望的克隆的多核苷酸的時(shí)間和空間表達(dá)。啟動(dòng)子可是那些正常情況下與目的轉(zhuǎn)基因相關(guān)的啟動(dòng)子，或是來源于其它植物、病毒和植物致病性細(xì)菌和真菌的基因的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員不需額外的實(shí)驗(yàn)就能選擇適于在使用遺傳構(gòu)建體來修飾和調(diào)節(jié)植物性狀中使用的啟動(dòng)子，所述的遺傳構(gòu)建體包含本發(fā)明所述的多核苷酸序列。組成性植物啟動(dòng)子的例子包括CaMV35S啟動(dòng)子，膽脂堿合酶(nopalinesynthase)啟動(dòng)子和章魚(肉)堿合酶(octopinesynthase)啟動(dòng)子和玉米的Ubi1啟動(dòng)子。在特定組織中具有活性的響應(yīng)于內(nèi)部的發(fā)育信號(hào)或外部的非生物的或生物的應(yīng)激的植物啟動(dòng)子見科學(xué)文獻(xiàn)所描述，例如，WO02/00894描述了示例性的啟動(dòng)子，通過參考并入本文。在轉(zhuǎn)化遺傳因構(gòu)建體的植物中普遍使用的示例性的終止子包括，例如，花椰菜嵌合體(cauliflowermosaic)病毒(CaMV)35S終止子，根瘤病土壤桿菌"gra&"en'ww,w附e/ac/era)膽脂堿合酶或章魚(肉)堿合酶終止子，玉米玉蜀黍蛋白(Zeawqyszein)基因終止子水稻(Oyzas加Va)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子和土豆(5Wa"wm^6eroswm)PI-II終止子。在植物轉(zhuǎn)化中普遍使用的選擇性的標(biāo)記包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(NPT11)，其賦予植物卡那霉素抗性，aadA基因，其賦予植物大觀霉素(spectinomycin)和鏈霉素抗性，膦絲菌素(phosphinothricin)乙?；D(zhuǎn)移酶(6argene)賦予Ignite(AgrEvo)和巴斯塔(Basta)(煙酸己可堿(Hoechst))抗性，以及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)賦予潮霉素抗性。還注意到包含報(bào)告基因的遺傳構(gòu)建體的用途，遺傳構(gòu)建體包含的報(bào)告基因編碼表達(dá)對(duì)于宿主是外源活性，通常是酶活性，和/或可見信號(hào)(例如熒光素酶、GUS、GFP)的序列，所述的報(bào)告基因可用作在植物和植物組織中進(jìn)行啟動(dòng)子表達(dá)分析。報(bào)告基因的文獻(xiàn)綜述見于Herrera-Estrella等人，1993,Nature303，209，和Schrott，1995,In:GeneTransfertoPlants(Potrykus，T.，Spangenberg.Eds)SpringerVerlag.Berline,pp.325-336。關(guān)于基因沉默策略，人們關(guān)注基因本身或影響編碼多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。"調(diào)節(jié)元件"是在最廣泛的可能的意義上使用，并包括與目的基因接觸的其它基因。設(shè)計(jì)減少或沉默本發(fā)明所述的多核苷酸/多肽表達(dá)的遺傳構(gòu)建體可包括本發(fā)明所述多核苷酸的反義拷貝。在這種構(gòu)建體內(nèi)，多核苷酸被置于與啟動(dòng)子和終止子反義的方向上。"反義"多核苷酸通過使多核苷酸或多核苷酸的片段倒置而獲得，以使產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本與該基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)，例如，5'GATCTA3，(編碼鏈)3'CTAGAT5，(反義鏈)3'CUAGAU5，mRNA5'GAUCUCG3，反義RNA設(shè)計(jì)用于基因沉默的遺傳構(gòu)建體還包括倒置重復(fù)序列。"倒置重復(fù)序列"是其中重復(fù)的第二半部分是在互補(bǔ)鏈上的重復(fù)序列，例如5，-GATCTA.........TAGATC-3'3，-CTAGAT.........ATCTAG-5，形成的轉(zhuǎn)錄本可進(jìn)行互補(bǔ)性堿基配對(duì)以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通常，需要重復(fù)區(qū)域間至少3-5bp的空間來形成莖環(huán)構(gòu)型。另一種沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的轉(zhuǎn)錄本的小反義RNA(Llave等人，2002,Science297,2053)。使用這種與本發(fā)明所述多核苷酸對(duì)應(yīng)的小反義RNA是受關(guān)注的。本文所使用的術(shù)語"遺傳構(gòu)建體"還包括小的反義RNA和影響基因沉默的其它這種多肽。以本文所定義的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化也可通過稱之為正義抑制的過程導(dǎo)致基因沉默(例如Napoli等人,1990,PlantCell2,279;deCarvalhoNiebel等人，1995，PlantCell,7,347)。在某些情況下，正義抑制可包括全部或部分編碼序列過表達(dá)，還可包括基因的非編碼區(qū)的表達(dá)，基因的非編碼區(qū)有如內(nèi)含子或5'或3'非翻譯區(qū)(UTR)。嵌合的部分正義構(gòu)建體能用于協(xié)調(diào)地使多個(gè)基因沉默(Abbott等人,2002,PlantPhysiol.128(3):844-53;Jones等人，1998,Planta204:499-505)。使用這種正義抑制策略來使本發(fā)明所述多核苷酸的表達(dá)沉默也是受到關(guān)注的。插在設(shè)計(jì)用于基因沉默的遺傳構(gòu)建體中的多核苷酸可對(duì)應(yīng)于編碼序列和/或非編碼序列，如啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子和/或5'或3'UTR序列或?qū)?yīng)的基因。其它基因沉默的策略包括顯性抑制(dominantnegative)方法和使用核酶構(gòu)建體(Mclntyre,1996，TransgenicRes,5,257)。轉(zhuǎn)錄前沉默可通過基因本身或其調(diào)節(jié)元件的突變而產(chǎn)生。這種突變可包括點(diǎn)突變，移碼，插入，缺失和取代。下列是能用于遺傳轉(zhuǎn)化下列植物物種的公開遺傳轉(zhuǎn)化規(guī)程的代表性出版物Rice(Alam等人，1999,PlantCellRep.18，572);apple(Yao等人，1995，PlantCellReports14,407-412);maize(USPatentSerialNos.5,177,010和5,981,840);wheat(Ortiz等人，1996，PlantCellRep.15,1996,877);tomato(USPatentSerialNo.5,159,135);potato(Kumar等人，1996PlantJ.9,:821);cassava(Li等人，1996NatBiotechnology14,736);lettuce(Michelmore等人，1987，PlantCellRep.6,439);tobacco(Horsch等人，1985,Science227,1229);cotton(USPatentSerialNos.5,846,797and5,004,863);grasses(USPatentNos.5,187，073and6.020，539);peppermint(Niu等人，1998，PlantCellRep.17,165);citrusplants(Pena等人，1995,PlantSci.104,183);caraway(Krens等人，1997，PlantCellRep,17，39);banana(USPatentSerialNo.5，792,935);soybean(USPatentNos.5，416,011;5，569,834;5,824，877;5,563,04455and5,968，830);pineapple(USPatentSerialNo.5,952,543);poplar(USPatentNo.4，795，855);monocotsingeneral(USPatentNos.5，591,616and6,037，522);brassica(USPatentNos.5,188，958;5,463，174and5,750，871);cereals(USPatentNo.6,074,877);pear(Matsuda等人，2005,PlantCellRep.24(1):45-51);Prunus(Ramesh等人，2006PlantCellRep.25(8):821-8;Song和Sink2005PlantCellRep.2006;25(2):117-23;GonzalezPadilla等人，2003PlantCellRep.22(1):38-45);strawberry(Oosumi等人，2006Planta.223(6):1219-30;Folta等人，2006PlantaApr14;PMID:16614818),rose(Li等人，2003),Rubus(Graham等人，1995MethodsMolBiol.1995;44:129-33),tomato(Dan等人，2006,PlantCellReportsV25:432-441),apple(Yao等人，1995，戶/朋fCe〃14,407~412)和Actinidiaeriantha(Wang等人，2006，PlantCellRep.25,5:425-31)。其它物種的轉(zhuǎn)化也受本發(fā)明的關(guān)注?？稍诳茖W(xué)文獻(xiàn)上得到合適的方法和規(guī)程。可使用本領(lǐng)域已知的幾種進(jìn)一步方法來改變本發(fā)明所述的核苷酸和/或多肽的表達(dá)。這些方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003,MethodsMolBiol,2%,205)，所謂的"Deleta基因"技術(shù)(Li等人，2001，PlantJournal27(3),235)和使用人工轉(zhuǎn)錄因子，如合成鋅指轉(zhuǎn)錄因子(例如Jouvenot等人，2003，GeneTherapy10,513)。此外，靶向特定多肽的抗體或其片段也可在植物中表達(dá)來調(diào)節(jié)那種多肽的活性(Jobling等人，2003,Nat.Biotechnol.,21(1)，35)。還可使用轉(zhuǎn)座子示蹤方法。此夕卜，與本發(fā)明所述多肽相互作用的肽可通過如相顯示(phase-display)(Dyax公司)的技術(shù)來鑒定。這種相互作用的肽可在植物中表達(dá)或應(yīng)用于植物以影響本發(fā)明所述多肽的活性。改變本發(fā)明所述核苷酸和/或多肽表達(dá)的上述方法中每一種方法的使用受到特別關(guān)注。遂激雄減還提供用于選擇GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或抗壞血酸含量改變的植物的方法。這些方法包括測(cè)試用于改變本發(fā)明所述多核苷酸或多肽、植物表達(dá)的植物。這些方法可用在年幼或早期發(fā)育階段，此時(shí)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或抗壞血酸含量的改變可無需容易地檢測(cè)到。多核苷酸的表達(dá)，如信使RNA，經(jīng)常用作相應(yīng)的多肽表達(dá)的提示。檢測(cè)多核苷酸表達(dá)的示例性方法包括但不限于Northern分析，RT-PCR和斑點(diǎn)印跡分析(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。本發(fā)明所述的多核苷酸或部分多核苷酸因此在鑒定植物的方法中用作如本文所定義的探針或引物，所述植物具有改變的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性水平、GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性水平或抗壞血酸的水平。本發(fā)明所述的多核苷酸可用作設(shè)計(jì)用于鑒定這種植物的雜交實(shí)驗(yàn)中的探針，或基于PCR的實(shí)驗(yàn)中的引物。另外，可制備抗本發(fā)明所述多肽的抗體。制備和使用抗體的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(見例如Antibodies,ALaboratoryManual,HarlowALane,Eds,ColdSpringHarbourLaboratory,1998)。這種抗體可在檢測(cè)調(diào)節(jié)植物花朵大小的多肽表達(dá)改變的方法中使用。這些方法可包括ELISA(Kemeny,1991,APracticalGuidetoELISA,NYPergamonPress)和Western分析(Towbin&Gordon,1994,JImmunolMethods,72,313)。這些分析多核苷酸或多肽的表達(dá)和選擇GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性、GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性或抗壞血酸含量改變的植物的方法，在傳統(tǒng)的育種程序中是有用的，所述程序是設(shè)計(jì)用來產(chǎn)生GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性、GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性或抗壞血酸含量改變的變種的。潛激術(shù)語"植物"旨在包括整個(gè)植物，植物的任一部分，植物的繁殖體和后代。術(shù)語"繁殖體"意味可用在生殖或繁殖的(有性生殖或無性生殖的)植物的任一部分，包括種子和插條(cutting)。本發(fā)明所述的植物可是種植的，且是自體受精或與不同植物品系交叉受精，且所產(chǎn)生的具有所期望的表型特征的雜交體可被鑒定。可種植兩代或更多代以確保目標(biāo)表型特征穩(wěn)定維持和繼承。由這些標(biāo)準(zhǔn)育種方法得到的植物也形成本發(fā)明的一方面。植物中GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性，和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性，和/或抗壞血酸含量的改變也可通過本發(fā)明所述的方法來改變。這些方法可包括以本發(fā)明所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，所述構(gòu)建體被設(shè)計(jì)成用于改變?cè)谶@種植物細(xì)胞和植物中調(diào)節(jié)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或抗壞血酸含量的多核苷酸或多肽的表達(dá)。這些方法還包括以本發(fā)明所述的構(gòu)建體和其他構(gòu)建體聯(lián)合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，所述其他構(gòu)建體被設(shè)計(jì)成用于改變?cè)谶@些植物細(xì)胞和植物中調(diào)節(jié)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和/或抗壞血酸含量的一種或多種多核苷酸或多肽的表達(dá)。孺腫微蕭就輛湖膽還提供通過從本發(fā)明所述的植物中提取抗壞血酸，制備抗壞血酸的方法?？扇缦聫闹参镏刑崛】箟难釋⒈鶅鼋M織樣品在Cryomill中在液氮溫度下研碎成精細(xì)的粉末。然后將約200mg冰凍粉末組織用4倍體積的含4mMTCEP(Pierce)的0.5NHC1懸浮，震蕩混合20秒，并在40°C在加熱塊中孵育2小時(shí)。在提取溶液中使用TCEP，因其在酸性條件下是比DTT更有效的還原試劑，確保所有維生素C是抗壞血酸的還原形式。提取物在4。C離心，且將20|aL上清液注射進(jìn)入一個(gè)7.8x300mmAminexHPX-87HHPLC柱(BioRad)內(nèi)。該柱以2.8mMH2S04,0.6mL/min的流速運(yùn)行，且根據(jù)在245nm(滯留時(shí)間9.6min)處的吸收來計(jì)算抗壞血酸的量，將抗壞血酸(SigmaStLouis)用作標(biāo)準(zhǔn)。通過顯示峰在pH5.5被抗壞血酸氧化酶完全降解，驗(yàn)證其為抗壞血酸。該方法可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法為了大規(guī)?？箟难崽崛U(kuò)大規(guī)模。餘輔,遂膽使用本發(fā)明所述的方法，可篩選作為候選除草劑的任何化合物?？赡鼙缓Y選的化合物的例子包括無機(jī)的和有機(jī)的化合物，如，但不限于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸、糖軛合物、低聚糖、月旨、醇、硫醇、醛、烷基化物(alkylator)、碳醚、酰肼、肼、酮、腈、胺類、(烴基)磺酰氯、三嗪、哌嗪(piperizine)、磺胺等。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的方法中篩選化合物庫。合成和篩選化合物庫的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，見例如U.S.專利No.5,463，564;5,574，656;5,684,711;和5,901,069，其內(nèi)容通過參考被并入。鑒定與這種多肽結(jié)合的化合物的方法是已知的，并例如在WO03/077648中有描述。檢測(cè)本發(fā)明所述多肽活性的方法在本文提供的實(shí)施例中有描述。廣義上講，本發(fā)明還在于在本申請(qǐng)說明書中分別或一起提及或所提示的各部分、原理和特征，和任意兩個(gè)或多個(gè)所述部分、原理或特征的任一種或所有組合，以及在本文提及特定整體的地方，所述整體已知是本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域內(nèi)的等同物，這種巳知的等同物被認(rèn)為是作為單獨(dú)列出弓I入本文。參考下列所附附圖可更好地理解本發(fā)明，其中圖1顯示擬南芥序列VTC2與中華獼猴桃"c"m^/a'Hortl6A，序列319998和第二擬南芥U.序列At5g55120的比對(duì)。還比對(duì)了擬南芥屬(Arabidopsis)酶At5gl8200(編碼推定的UDP-葡萄糖-己糖-l-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶(EC-編號(hào)2.7.7.12))和未命名的小鼠蛋白質(zhì)Mm—74150758(該號(hào)碼是GenBank登錄號(hào))。在所有五個(gè)序列中相同的比對(duì)殘基用深灰色顯示，相似的殘基用淺灰顯示。用ClustalX(Jeanmougin等人，1998)伴一些人工調(diào)整比對(duì)序列。在約250氨基酸殘基處鑒定HIT三聯(lián)序列。圖2顯示獼猴桃GDP-甘露糖-l-P脒基轉(zhuǎn)移酶、EST319998(SEQIDNO:1/14)對(duì)GDP-L-半乳糖的反應(yīng)。使用在方法中所述的差向異構(gòu)酶從GDP-D-甘露糖制備GDP-L-半乳糖，且混合物GDP-L-半乳糖的濃度通過HPLC確定。使用連續(xù)的成對(duì)的分析進(jìn)行分析，每次分析使用0.029ug酶。甘露糖-l-P濃度是0.93mM和1.87mMMgCl2。其他條件如文中所述。正方形代表反應(yīng)減去無甘露糖-1-P時(shí)的運(yùn)行背景。三角形代表使用HisTrap純化表達(dá)空PET30a載體的Ecoli提取物(0.006ug)的背景值(時(shí)程319998111006.xls)。圖3顯示酶EST319998(SEQIDNO:1/14)對(duì)于潛在的脒基受體的反應(yīng)。使用連續(xù)的成對(duì)檢測(cè)，以不同的脒基受體的無機(jī)磷酸(正方形)，無機(jī)焦磷酸(圓形)或D-甘露糖-l-P(三角形)濃度進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于底物磷酸、焦磷酸和D-甘露糖-l隱P，vamax值分別是0.12±0.03，0.032±0.002和0.17±0.009nmolsec"ug-1蛋白質(zhì)。KM值分別是4.4士2,0.16士0.05和0.11士0.03mM。檢測(cè)進(jìn)行三次，具有相似的結(jié)果。圖4顯示瞬時(shí)表達(dá)的獼猴桃EST319998(SEQIDNO:1)對(duì)煙草葉中抗壞血酸含量和酶活性的影響。詳見方法部分。白色柱代表葉子中的抗壞血酸濃度(以新鮮重量基礎(chǔ)表示)，黑色柱代表GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性(以g蛋白質(zhì)基礎(chǔ)表示)。Ll，L2和L3代表三個(gè)被注射的頂端的葉子。標(biāo)準(zhǔn)棒(Errorbar)是均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n-3至6)。圖5顯示將D-甘露糖-l-磷酸轉(zhuǎn)化為L-半乳糖-l-磷酸的反應(yīng)。圖6顯示與At4g26850具有顯著相似性的一系列序列的比對(duì)。比對(duì)使用ClustalX(/)進(jìn)行。244893_Ac和319998_Ac是中華獼猴桃的EST,24547_Ae和276582_Ae是毛花獼猴桃的EST,82552_Md是蘋果的EST,315905—Ms是天女花OfWe6oW/〃(野生酸蘋果)的EST,At4g26850是擬南芥的VTC2，和At5g55120也是來自擬南芥的同源物。BT013858—Le是自番茄a(bǔ)yco/7e"/cow^cw/ew加w)進(jìn)入的GenbankDNA的翻譯產(chǎn)物，Osl2g0190000是水稻(水稻)序列。Contig_St是疊連序列(contig)，其由在Genbank中鑒定的95%相同的重疊土豆(So/朋wwft/6emsMWy>(土豆)EST組裝而來。圖7顯示圖6中比對(duì)的序列之間的同一性％。圖8顯示上述比對(duì)的顯示不同物種序列的叢集的無根的序列樹。圖9顯示的多核苷酸編碼序列的比對(duì)(使用ClustalX)，該多核苷酸編碼序列編碼圖6中比對(duì)的多肽序列。圖10顯示圖9中比對(duì)的多核苷酸編碼序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。圖11顯示SEQIDNO:25至35的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶游多肽序列的比對(duì)。所有四條序列中的相同的比對(duì)殘基用深灰顯示，相似的殘基用淺灰顯示。序列用ClustalX(Jeanmougin等人，1998)進(jìn)行比對(duì)。圖12顯示圖1中比對(duì)的序列之間的序列同一性％。圖13顯示SEQIDNO:5至8的差向異構(gòu)酶多核苷酸序列的比對(duì)(使用ClustalX)。圖14顯示SEQIDNO:25至28的差向異構(gòu)酶的多核苷酸序列之間的同一性%。圖15顯示煙草葉子中的抗壞血酸作為注射入葉子中的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(319998)和差向異構(gòu)酶(169164)量的函數(shù)。煙草被瞬時(shí)轉(zhuǎn)化含有任一個(gè)這兩種基因的土壤桿菌屬Ugra6a"e^附入注射前將不同量混合，加入恒定量的含有P19的土壤桿菌屬(jgrak^^^w)，且所有混合物的體積達(dá)到恒定的水平。約8天后檢測(cè)抗壞血酸。差向異構(gòu)酶(A)和轉(zhuǎn)移酶(B)的滴定顯示另一種基因的不同水平。圖16顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)化一系列的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶構(gòu)建體的煙草葉子中抗壞血酸水平。圖17顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)化特定的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的煙草葉子中抗壞血酸水平。圖18顯示在GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶319998轉(zhuǎn)化擬南芥屬64ra6/tto戸/W品系中卡那霉素抗性的分離(segregations種子種植在卡那霉素平板上，且計(jì)算綠色和死亡發(fā)芽種子的數(shù)目。正確=多拷貝，錯(cuò)誤=單拷貝。以粗體書寫的數(shù)值繼續(xù)至第二代(表3)。圖19顯示轉(zhuǎn)化GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶319998的擬南芥屬的第二代品系，其在葉子中顯示高抗壞血酸的發(fā)生率。所有植物經(jīng)選擇均有卡那霉素抗性。在括51號(hào)中的數(shù)目是均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，抗壞血酸(ASC)為mg/100g。圖20顯示轉(zhuǎn)化GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶319998的擬南芥屬64ra6/tfo;w/W的第三代品系，其葉子中顯示高抗壞血酸的發(fā)生率。所有植物經(jīng)選擇均有卡那霉素抗性。在括號(hào)中的數(shù)目是均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，抗壞血酸(ASC)為mg/100g。圖21顯示在選擇的轉(zhuǎn)化GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶319998的擬南芥屬"raWtfo^&J品系中的基因表達(dá)和葉子的抗壞血酸濃度。選定品系中的基因表達(dá)通過qPCR檢測(cè)。圖22顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)化GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶319998的煙草的抗壞血酸水平和基因表達(dá)。使用定性技術(shù)進(jìn)行PCR。圖23顯示￡co/f中表達(dá)的酶的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性。于20°C，在舊的Victor平板讀出器(reader)("舊的"使用0.000254517nmol/F的校正因子將熒光單位轉(zhuǎn)換為納摩爾)中或在新的Victor3("新的"校正因子是2.6565E-05nmol/F)中進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例現(xiàn)在參考下列非限制性實(shí)施例，解釋本發(fā)明。實(shí)施例l:一種來自獼猴桃水果的推定的擬南芥(4mW^/w/sAfl//fl"fl)同源物At4g26850的鑒定使用紐西蘭園藝和食物研究所所有的獼猴桃(J^m'&fl)EST數(shù)據(jù)庫的At4g26850進(jìn)行Blast查找，揭示出在超過132,000個(gè)EST之中與AT4g26850同源的120個(gè)EST。這些EST來源于一系列包括翼瓣、果實(shí)、芽和分生組織和葉子的組織。申請(qǐng)人從中華獼猴桃的幼小果實(shí)文庫中選定EST319998。這兩種擬南芥屬(Jra^Wo/w^)蛋白質(zhì)和獼猴桃蛋白質(zhì)顯示出彼此的71%至75%同一性。序列使用ClustalX(ClustalX(Jeanmougin等人，1998)進(jìn)行比對(duì)，如圖1所示。實(shí)施例2:使用生物信息學(xué)分析揭示At4g26850作為GDP-L-半乳糖-脒基轉(zhuǎn)移酶的推定功能微餘基艘拔重復(fù)運(yùn)行PSIBlast(Altschul等人，1997;Schaffer等人，2001)6+次，進(jìn)一步檢測(cè)被鑒定基因的注解(annotation)。基序查找用MEME(Bailey和Elkan,1994)用一套基因作為選定輸入(At4g26850和HIT成員，包括GalT)進(jìn)行。通過BLASTp査找編碼與未鑒定的擬南芥屬基因At4g26850的預(yù)期蛋白質(zhì)序列相似的蛋白質(zhì)的基因，申請(qǐng)人最初僅發(fā)現(xiàn)了也被注解為與At4g26850相似的其他植物基因。然而，進(jìn)一步在匹配基因列表中的是蛋白質(zhì)的InterproHIT家族(IPR001310)成員，該蛋白被鑒定為核苷酸結(jié)合蛋白質(zhì)和水解酶。該家族包括二腺苷四磷酸(Ap4A)水解酶和GalT(I類D-半乳糖-l-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶)(Brenner,2002)。例如，屬于這個(gè)GalT家族的大鼠基因顯示出1E-37的預(yù)期值，其與At4g26850的超過364個(gè)殘基具有30%的同一性和48%的相似性。盡管GalT亞群(也稱作interproIPR001937)具有相關(guān)基序HXHXQ，然而這些HIT蛋白質(zhì)通常以基序HXHXH為特征(其中X是疏水氨基酸)。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析，已經(jīng)顯示出GalT是HIT蛋白家族成員(Brenner等人，1997)。申請(qǐng)人使用PSI-BLAST(Altschul等人，1997;Schaffer等人，2001)細(xì)化該査找，且被比對(duì)的主要類別是HIT家族成員。例如，重復(fù)6次后，第一個(gè)非植物的比對(duì)序列是人的基因(Genbank34527348)，其具有28%的同一性和47%的相似性(在373個(gè)殘基中)并且預(yù)期值為2E-99。從一系列來自哺乳動(dòng)物物種的基因中發(fā)現(xiàn)相似的比對(duì)，所有這些具有<2E-93的E值，描述二腺苷四磷酸(Ap4A)水解酶和其它HIT家族水解酶。在較低的相似性上，申請(qǐng)人觀察到一組的ATP腺苷酰轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(預(yù)期〉E-70)。在較高的預(yù)期值O1E-10)上，申請(qǐng)人然后發(fā)現(xiàn)具有HIT注解的其它基因。申請(qǐng)人然后使用了一個(gè)選定的HIT組的interproIPR001310成員組，加AT4g26850、At4g26850禾卩EST319998(見表1)，并使用MEME網(wǎng)站httu:〃meme.sdsc.edu(Bailev和Elkan,1994)查找基序。申請(qǐng)人鑒定出六個(gè)顯著的基序，這六個(gè)顯著的基序出現(xiàn)在所有五種植物序列中。出現(xiàn)在四種動(dòng)物序列中的五種這樣的基序和剩余的動(dòng)物序列具有四種基序(見表1)。這顯示這些蛋白質(zhì)是明確相關(guān)的，并屬于HIT超家族。表l.在選定范圍的獼猴桃est319998的同源物中出現(xiàn)的基序<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>基序1包括診斷模式HxHxQ(HxHxH的)(見圖1)。令人感興趣的是，HIT家族的GaIT亞家族也共有這個(gè)HxHxQ模式，盡管不能用這個(gè)序列發(fā)現(xiàn)共同基序。根據(jù)這些生物信息學(xué)分析，似乎可能的是負(fù)責(zé)抗壞血酸突變體FTC2(At4g26850)及其獼猴桃的同源物編碼脒基轉(zhuǎn)移酶。實(shí)施例3:獼猴桃GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶EST319998和擬南芥At4g26850在大腸桿菌(E"http://)中的表達(dá)及鑒定酶活性基像,_^厲好,^游袤這將來自中華獼猴桃幼小果實(shí)的EST319998和At4g26850中的每個(gè)克隆進(jìn)入pET30A(Novagene,USA)中，檢査其在大腸桿菌中的序列和在大腸桿菌中的表達(dá)。N-末端His6標(biāo)簽用于純化該蛋白。平行表達(dá)和純化空載體對(duì)照。這些技術(shù)基本上是以前已有描述的(Laing等人，2004)。在這項(xiàng)工作的大部分內(nèi)容中，在5mLHiTrapQFF柱(GEHealthcare)上進(jìn)一步純化組氨酸(His)蛋白，兩種制備物獲得相同的結(jié)果。結(jié)合酶從來源于美味獼猴桃的枝芽(shootbud)文庫的EST中，帶有麥芽糖結(jié)合蛋白前序列，克隆L-半乳糖脫氫酶(GenBank登錄號(hào)AAOl8639(EST56121),1.5ug/次分析)，并如前所述進(jìn)行分析(Laing等人，2004)。從擬南芥"raWtto戸^(At3g02870,3.1ug/次檢測(cè))中克隆L-半乳糖-l-磷酸磷酸酶，并如前所述進(jìn)行分析(Laing等人，2004)。在用氰胺(hydrogencyanamide)處理3天后，從休眠的獼猴桃(Ue//c/0M)芽中克隆GDP-D-甘露糖3'，5'-差向異構(gòu)酶(198296)，并如所述進(jìn)行分析(Wolucka等人，2001)。前兩種酶就其底物是高度特異性的(Laing等人，2004;Laing等人，2004)。GDP-L-半乳糖(~50%純，如HPLC和LCMS所顯示，其污染有分解產(chǎn)物GDP和L-半乳糖-l-磷酸)和L-半乳糖-l-磷酸購自Glycoteam公司(Hamburg,Germany)。申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，GDP-L-半乳糖是極其酸性不穩(wěn)定的，且申請(qǐng)人未試圖將其進(jìn)一步純化。其他生化試劑購自Sigma公司。體艦.GDP-L-半乳糖-l-磷酸脒基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)在20mMTrisCl,pH8.0,GDP-L-半乳糖中，和lmMD-甘露糖-l-磷酸進(jìn)行的。直接使用來自Glycoteam產(chǎn)品的GDP-L陽半乳糖(在該情況下，由于L-半乳糖-l-磷酸的污染而觀察到高背景)，或者使用利用差向異構(gòu)酶產(chǎn)生的GDP-L-半乳糖。在后一種情況下，0.21mg差向異構(gòu)酶與GDP-D-甘露糖在20mMTrisClpH8，總體積是400uL(見Wolucka等人，2001)條件下于2(TC孵育30分鐘，然后在分析中以1至20稀釋直接使用。加熱至100'C持續(xù)3分鐘10分鐘后終止該分析，或直接與磷酸酶和L-半乳糖脫氫酶結(jié)合以測(cè)定分析期間產(chǎn)物的形成。將加熱終止的檢測(cè)物在冰上冷卻，離心去除沉淀的蛋白質(zhì)和使用上述的結(jié)合酶檢測(cè)的L-半乳糖(也可見(Laing等人,2004))。L-半乳糖的分析與加入的L-半乳糖-l-磷酸在檢測(cè)范圍內(nèi)是線性的。使用空載體對(duì)照進(jìn)行背景分析，其產(chǎn)生與煮沸的酶的對(duì)照相同的結(jié)果。作為另外的檢測(cè)，用LCMS鑒定上述正向反應(yīng)，以及檢測(cè)反向的焦磷酸化酶反應(yīng)，其中GTP(1mM)和L-半乳糖-l-磷酸按照上述方法孵育，且形成隨后的GDP-L-半乳糖。在MS之前，通過HPLC分離GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖。LC-MS使用結(jié)合至EttanTMMDLC(GEHealthcareBio-Sciences)上的適合ESI界面的LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀(lineariontrapmassspectrometer)(ThermoQuest,Fi皿igan，SanJose,CA,USA)。使用維持在40°C的100x2.1mm的Hypercarb柱(ThermoElectron,USA)達(dá)到GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的分離。溶劑是(A)50mM乙酸銨和(B)乙腈，流速是200uL/min。最初的流動(dòng)相，5。/。B持續(xù)3分鐘，然后于11分鐘時(shí)線性傾斜至20%B，持續(xù)5分鐘，然后于19分鐘時(shí)傾斜至70%B，并持續(xù)5分鐘，然后恢復(fù)至最初的條件。GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的截留時(shí)間分別是16.8分鐘和17.5分鐘。在負(fù)性模式下，使用選擇性的反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)方法SRMm/z604〉m/z344，362,424,442和選定的離子監(jiān)測(cè)(SIM)方法SIMm/z604獲得MS數(shù)據(jù)。該SIM方法僅檢測(cè)GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的(M-H)-離子，同時(shí)SRM方法監(jiān)測(cè)通過將這兩種化合物的前體離子(M-H)-片段化而形成的特別的子系離子。這兩種方法通過從其他存在的化合物中過濾掉任何化學(xué)噪音把敏感度增加到最大限度。將ESI電壓、毛細(xì)管溫度、外殼氣體壓力(sheathgaspressure),掃描氣體和輔助氣體分別設(shè)置在-10V、350°C、25psi、3psi和3psi。使用100x2.1mm維持在40°C的Hypercarb柱(ThermoElectron,USA),平等地達(dá)到D-甘露糖-l-磷酸和L-半乳糖-l-磷酸的分離。溶劑是(A)20mM乙酸銨和(B)甲醇，且流速是200uL/min。使用2。/。B的流動(dòng)相，D-甘露糖-l-磷酸和L-半乳糖-l-磷酸的截留時(shí)間分別是4.3min和4.9min。在負(fù)性模式下，使用選擇性反應(yīng)檢測(cè)(SRM)方法SRMm/z259〉m/z79,97和選定的離子監(jiān)測(cè)(SIM)方法SIMm/z259獲得MS數(shù)據(jù)。煙草葉中轉(zhuǎn)移酶的活性通過下列步驟來測(cè)定:在約5倍的體積的TrisClpH8.0,2mMDTT和1mMEDTA中提取液氮研碎的葉子，離心，使用以同樣緩沖液平衡的NAP脫鹽柱使上清脫鹽，并使用上述的結(jié)合檢測(cè)分析該酶。提取物中的蛋白質(zhì)使用BioradBradfordCoumassie分析(Bradford,1976)測(cè)定，BSA用作標(biāo)準(zhǔn)。茲菜申請(qǐng)人將這些基因在pET30載體上在大腸桿菌中表達(dá)，并使用His標(biāo)簽和Ni螯合柱純化蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在SDS凝膠上為55KD，且構(gòu)成約90%的分離蛋白質(zhì)。含有空pET30載體的對(duì)照也以同樣的方式處理。申請(qǐng)人使用兩種檢測(cè)來鑒定該酶，使用兩種來源的底物GDP-L-半乳糖。第一種檢測(cè)使用大腸桿菌表達(dá)的結(jié)合酶L-半乳糖-l-磷酸磷酸酶和L-半乳糖脫氫酶。該磷酸酶對(duì)于L-半乳糖-l-磷酸是高度特異性的，否則僅顯著地將肌醇-l-P脫磷酸(Laing等人，2004)。該脫氫酶對(duì)于L-半乳糖是特異性的，不與D-甘露糖或D-半乳糖或一系列其它糖發(fā)生反應(yīng)(Gatzek等人2002;Laing等人，2004)，除了L-Gulose(古洛糖)。就這后一種底物而言，L-半乳糖脫氫酶表現(xiàn)出約2.5倍高的最大速率和30倍的Km(底物)，導(dǎo)致在有限的底物濃度下，L-古洛糖與L-半乳糖相比約8%的活性。結(jié)果是，我們的結(jié)合檢測(cè)基本上測(cè)定L-半乳糖，且也測(cè)定L-古洛糖。申請(qǐng)人檢測(cè)通過在檢測(cè)中加入結(jié)合酶形成的產(chǎn)物，或者檢測(cè)NADH形成的時(shí)程，或者通過10分鐘后煮沸3分鐘和離心終止該反應(yīng)。在這后一種時(shí)間固定的檢測(cè)中，申請(qǐng)人然后加入結(jié)合酶檢測(cè)L-半乳糖的產(chǎn)生或者使用LCMS檢測(cè)產(chǎn)物。使用LCMS僅用于確認(rèn)結(jié)合酶反應(yīng)的結(jié)果并檢測(cè)反向反應(yīng)。使用LCMS和結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)產(chǎn)物，清楚的是大腸桿菌表達(dá)的猴桃EST319998和At4g26能催化GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)長-半乳糖-l-P。取決于酶的濃度，時(shí)程是線性的，持續(xù)近10分鐘，且反應(yīng)速率與加入的酶在檢測(cè)范圍內(nèi)是線性的(數(shù)據(jù)未顯示)。在煮沸的酶或空載體存在條件下，沒有反應(yīng)出現(xiàn)(圖2)。D-甘露糖-l-P對(duì)于脒基部分比對(duì)于磷酸或焦磷酸是更好的受體，但是在這些底物是生理濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)與這后兩種化合物的反應(yīng)(圖3)。在有GDP-D-甘露糖，無差向異構(gòu)酶時(shí)，或者有兩種底物中一種底物，且無結(jié)合酶時(shí)，未發(fā)現(xiàn)NAD還原活性(數(shù)據(jù)未顯示)。使用從商家購買的GDP-L-半乳糖-l-磷酸進(jìn)行的反應(yīng)具有很高的背景，這是因?yàn)長-半乳糖-l-磷酸的污染，且是在固定的時(shí)程內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。這一底物顯示出比用差向異構(gòu)酶產(chǎn)生的底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的速率稍高。測(cè)定了其它脒基受體，且發(fā)現(xiàn)該酶接受廣范的己糖-l-P底物，盡管D-葡萄糖-6-P僅以最佳受體速率的約25%進(jìn)行反應(yīng)(表2)。反應(yīng)不需要Mg(數(shù)據(jù)未顯示)，盡管由于磷酸酶需要Mg而在結(jié)合檢測(cè)中包括Mg。使用表達(dá)擬南芥屬"ra6Wo^^J序列(At4g26850)的結(jié)合檢測(cè)也顯示出與獼猴桃EST319998具有相似的特性的轉(zhuǎn)移酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。表2.不同糖的磷酸作為脒基受體對(duì)于轉(zhuǎn)移酶活性的影響。使用差向異構(gòu)酶產(chǎn)生的底物進(jìn)行酶的檢測(cè)，且在其它條件下連續(xù)進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)如在方法中描述。N=6.(時(shí)程319998111006.xls)。底物速率nmol/sec/ug蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)誤差%D-甘露糖-lPD-葡萄糖-l-P0.350.036106D-葡萄糖-6-P0.080.00224D-葡萄糖-l-P0.240.0574L-肌醇-l-P0.420.07126D-半乳糖-l-PD-甘露糖-l-P0.380.011130.330.07100使用LC質(zhì)譜確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物是L-半乳糖-l-磷酸(表3)。這包括使用液相層析法分離反應(yīng)產(chǎn)物，該方法從D-甘露糖中分離L-半乳糖，并從GDP-D-甘露糖中分離GDP-L-半乳糖，且產(chǎn)物的同一性通過其分子量確認(rèn)。檢測(cè)到的逆反應(yīng)是極少至無。表3.通過LCMS檢測(cè)轉(zhuǎn)移酶活性。使用固定時(shí)間檢測(cè)，于高或低蛋白質(zhì)濃度和不同受體和底物的組合進(jìn)行活性的檢測(cè)(如表所示)。檢測(cè)通過煮沸終止，且等份使用結(jié)合酶或者通過LCMS測(cè)定。未檢測(cè)nm。底物受體ug蛋白nmol/sec/ug蛋白質(zhì)質(zhì)結(jié)合檢測(cè)LCMSGDPMan/epim甘露糖-l-P0.0570.0120.0094GDPMan/epim無1.140扁380扁31GDPMan/epim無0.0570扁120GDPGal甘露糖-l-P0.0570.017高BGGDPMan/epimPPi1.140細(xì)950細(xì)3GDPMan/印imPPi0.0570.00260.0031GDPManGallP1.14nm0GDPManGallP0.057nm0GTPGallP1.14nm0GTPGallP0.057nm057苷酸，增加植物中產(chǎn)生的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和抗壞血酸膨靴僻含有克隆在pGreen(Hellens等人2000)上的獼猴桃GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(EST319998)基因的土壤桿菌與含有以前描述的(Hellens等人,2005)沉默抑制子P19基因的土壤桿菌"grak"m'謂)混合，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草本塞姆氏(iV/cW/a"a6e"Aa冊(cè)'a"a)。使用在pGreen上僅含有的P19的土壤桿菌(^gra^c^7'MW)進(jìn)行對(duì)照。轉(zhuǎn)化后9天收獲煙葉，并將其凍在液氮中。在無還原劑條件下在偏磷酸中如前所述提取抗壞血酸(Davey等人，2003;RassamandLaing,2005)。當(dāng)以與作為沉默的抑制子P19混合的含有位于載體pGreen上的獼猴桃EST319998的土壤桿菌Ugra6a"ehww)克隆瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙葉時(shí)，能檢測(cè)葉子提取物中的可檢測(cè)活性(圖4A)。發(fā)現(xiàn)在僅單獨(dú)轉(zhuǎn)化P19的煙葉中有極低的活性(是轉(zhuǎn)化的~2%)(圖4)。對(duì)照組中低的酶水平是在抗壞血酸生物合成的L-半乳糖途徑中典型的其它酶的水平(WLaing，未發(fā)表的觀察結(jié)果)。注射土壤桿菌(^ro6""m'讓)的不同年齡的一系列葉子中出現(xiàn)該活性。與對(duì)照葉子相比，同樣轉(zhuǎn)化319998的葉子顯示出抗壞血酸有非常顯著的3倍增加(圖4)。實(shí)施例5:獼猴桃的抗壞血酸途徑基因的基因表達(dá)分析顯示，GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的高表達(dá)與抗壞血酸產(chǎn)生的增加相關(guān)。使用qPCR檢測(cè)獼猴桃的兩個(gè)物種的發(fā)育中果實(shí)的抗壞血酸生物合成的L-半乳糖途徑中的關(guān)鍵步驟基因的基因表達(dá)。美味獼猴桃含IOOmg/100gFW抗壞血酸，且毛花獼猴桃含多IO倍的抗壞血酸。顯示基因表達(dá)顯著增加的唯一步驟，與抗壞血酸的增加平行，該步驟是GDP-L-半乳糖-l-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(表ls)。這支持了在煙葉中這同一基因的過表達(dá)導(dǎo)致抗壞血酸水平增加3倍的觀察結(jié)果。表ls:與看家基因((PPPRSA;表達(dá)設(shè)置到l)相比，開花后4周的Hayward和毛花獼猴桃果實(shí)中的L-半乳糖抗壞血酸的生物合成途徑成員表達(dá)的相對(duì)水平。毛花獼猴美味獼猴桃桃變化倍數(shù)酶底物(Hajwflr力(XZ-^^flJGDP-甘露糖-3'，5'-差向異構(gòu)GDP-甘露糖1.82.41.3酶GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶L-半乳糖-卜磷GDP-L-半乳糖L-半乳糖-l-磷酸L-半乳糖L-半乳糖酸-l,4-內(nèi)L-半乳糖脫氫酶L-半乳糖酸-l,4-內(nèi)酯脫氫酶L-抗壞血酸開花后4周果實(shí)中的L-抗壞血酸(mg/100mg鮮重)脂4.10.7未檢測(cè)10031.2*1.8*1.2*未檢測(cè)10857.62.60.810.9*顯著地區(qū)別于Hayward(p^.05)實(shí)施例6:GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的獼猴桃EST的變體公開的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的獼猴桃EST的幾種變體序列經(jīng)鑒定基本上如實(shí)施例2中所述，其來自Genbank或來自擁有所有權(quán)的HortResearchdeEST數(shù)據(jù)庫獼猴桃和蘋果序列。所有11條蛋白質(zhì)序列通過ClustalX(Jeanmougin等人,1998,r固A5/oc/z泄Sc/.23，403-5.)進(jìn)行比對(duì)，如圖6所示。這些序列都顯示顯著同源的區(qū)域，且包括兩個(gè)完全保守的基序AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)和GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)，這兩條基序經(jīng)比對(duì)序列的視覺檢查而鑒定。當(dāng)序列SEQIDNO:12或13中的任一條序列在blastp(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman，D.J.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool."J.Mol.Biol.215:403-410)中用于查找GenBank的翻譯蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=protein)(3rdMarch2007)時(shí)，除了夷卩些在本發(fā)明序列列表中公開的序列，沒有其它含有完全保守基序的植物序列鑒定出來。因此，這兩條序列基序中任一個(gè)似乎可用于判斷本發(fā)明所述的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶，或者在本發(fā)明所述的方法中使用。所有多肽序列之間的同一性％顯示在圖7中。圖8顯示蘋果和獼猴桃序列叢集在一起，以及水稻和番茄序列是更加分離的無根的樹。序列使用Blastp査找Genbank和HortResearch數(shù)據(jù)庫鑒定，并用ClustalX進(jìn)行比對(duì)，用Treeview進(jìn)行可視化。如圖9所示，每條多核苷酸序列編碼區(qū)的DNA序列也用ClustalX進(jìn)行比對(duì)。所有多核苷酸編碼序列之間的％序列同一性如圖10所示。實(shí)施例7:從獼猴桃和蘋果中鑒定GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶序列申請(qǐng)人在紐西蘭園藝和食品研究所擁有所有權(quán)的獼猴桃和蘋果EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast查找，以鑒定與At5g28840同源的EST。申請(qǐng)人選定三個(gè)序列作為潛在的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的編碼序列，兩個(gè)來自獼猴桃(169164—KUFA:SEQIDNO:38和1998296—KALA:SEQIDNO:39),且一個(gè)來自蘋果(108403—AAOA:SEQIDNO:40)。相應(yīng)的多肽序列分別顯示于SEQIDNO:25、26和27。申請(qǐng)人從公共數(shù)據(jù)庫中還鑒定出其它的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶序列，其具有SEQIDNO:42至48的多核苷酸序列，編碼多肽序列SEQIDNO:29至35。多肽序列使用ClustalX(ClustalX(Jeanmougin等人，1998))比對(duì)，如圖11所示。序列之間的%序列同一性水平見圖12。申請(qǐng)人還鑒定出兩條序列基序(SEQIDNO:36和37)，其在所有經(jīng)比對(duì)的序列中完全保守。實(shí)施例8:獼猴桃的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶序列在大腸桿菌中的表達(dá)和酶活性的鑒定使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將美味獼猴桃的198296—KALA序列(SEQIDNO:39)克隆進(jìn)pET30A(Novagene,USA)，并使其在大腸桿菌中表達(dá)。用N末端Hiss標(biāo)簽純化蛋白質(zhì)。平行表達(dá)和純化空載體對(duì)照。這些技術(shù)基本上如前所述(Laing等人,2004)。His-蛋白質(zhì)在5mLHiTrapQFF柱(GEHealthcare)上脫鹽。方法如實(shí)施例3中所述。酶活性檢測(cè)如文獻(xiàn)所述(Wolucka等人,2001)。0.21mg差向異構(gòu)酶與GDP-D-甘露糖于20。C—同在總體積是400uL的20mMTrisCl，pH8(見Wolucka等人，2001)中孵育30分鐘。通過HPLC分離反應(yīng)產(chǎn)物以鑒定該反應(yīng)產(chǎn)物新合成的GDP-L-半乳糖。通常使用反相柱。碧菜該蛋白質(zhì)在SDS凝膠上出現(xiàn)在50KD位置并組成分離出來的蛋白質(zhì)的約90%。含有空pET30載體的對(duì)照也以同樣方法進(jìn)行處理。實(shí)施例9:通過表達(dá)本發(fā)明所述差向異構(gòu)酶的多核苷酸，增加植物中產(chǎn)生的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性和抗壞血酸淑印層好靴含有克隆在pGreen(Hellens等人，2000)上的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶(169164—KUFA:SEQIDNO:38)和/或GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(EST319998—AcSEQIDNO:14)獼猴桃基因的分離的土壤桿菌培養(yǎng)物與含有以前描述的(Hellens等人,2005)沉默抑制子P19基因的土壤桿菌混合，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草。使用在pGreen上僅含P19的土壤桿菌進(jìn)行對(duì)照。轉(zhuǎn)化后9天收獲煙葉，并將其凍在液氮中。在無還原劑條件下，在偏磷酸中如前所述提取抗壞血酸(Davey等人，2003;Rassam禾口Laing，2005)。當(dāng)以混合了作為沉默抑制子P19的含有載體pGreen上的獼猴桃EST319998的土壤桿菌(^gra^"eWww)克隆瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙葉時(shí)，能檢測(cè)葉子提取物中的可檢測(cè)活性。在僅轉(zhuǎn)化P19的煙葉中發(fā)現(xiàn)極低的活性(是轉(zhuǎn)化的2%)。以含有攜帶差向異構(gòu)酶或P19的pGreen載體的土壤桿菌浸潤葉子，或者以僅含有aceto-syringinone的水注射葉子，對(duì)葉子的抗壞血酸水平?jīng)]有影響。以攜帶轉(zhuǎn)移酶基因的土壤桿菌浸潤煙葉，導(dǎo)致煙葉中抗壞血酸水平升高3倍，如前所示(Laing等人,2007)。然而，以差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶的混合物注射葉子可使抗壞血酸水平另外升高2倍(表2)，共達(dá)到6倍，如下表2所示。表2.分別或一同瞬時(shí)表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(319998)或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶(169164)的基因后，葉子的抗壞血酸水平。在每一種情況下，病毒抑制子蛋白基因P19也與另兩種基因一同表達(dá)。對(duì)照或者單獨(dú)用P19，或者單獨(dú)用乙酰丁香酮(aceto-syringone)土壤桿菌感染試劑(同樣的結(jié)果)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)植物的均值，每株植物取三個(gè)葉子(9次檢測(cè)，除了對(duì)照，其中數(shù)據(jù)代表18次檢測(cè))。平均數(shù)SE抗壞血酸的相對(duì)量34.22.71.0處理對(duì)照差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)移酶差向異構(gòu)酶+轉(zhuǎn)33.32.31.0102.07.43.0194.222.65.7這些實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述差向異構(gòu)酶序列的過表達(dá)能增加植物中抗壞血酸的產(chǎn)生。這一點(diǎn)通過下列結(jié)果證實(shí)由于GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)，植物中抗壞血酸己經(jīng)增加3倍的抗壞血酸水平再增加2倍。實(shí)施例10:通過改變植物中表達(dá)的本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶序列的比例操作抗壞血酸的產(chǎn)生雄享銜好過教通過注射懸浮的含有目的基因的土壤桿菌培養(yǎng)物，使用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)((Hellens等人，2005))轉(zhuǎn)化煙草。GDP-甘露糖差向異構(gòu)酶是來自毛花獼猴桃的EST169164，轉(zhuǎn)移酶是來自中華獼猴桃的EST319998。然后收獲葉子，并檢測(cè)抗壞血酸水平。此外，在一些情況下，還檢測(cè)酶的活性。所用的方法如實(shí)施例9中所述。研究本發(fā)明所述的差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)移酶序列之間的相互作用和協(xié)同作用是通過滴定這兩個(gè)基因，所述基因作為混合物注射進(jìn)入煙草中。在所有的一種與另一種酶的組合中，含有土壤桿菌"grak/"m'ww)懸浮物的轉(zhuǎn)移酶(EST319998)和差向異構(gòu)酶(169164)的體積不等，其從0加0.01、O.l和lmL。在所有情況中還加入P19以避免基因沉默。結(jié)果(圖15)顯示，在缺乏轉(zhuǎn)移酶的條件下，增加差向異構(gòu)酶的水平對(duì)葉子中的抗壞血酸沒有影響。然而，在轉(zhuǎn)移酶存在條件下，抗壞血酸以飽和曲線響應(yīng)差向異構(gòu)酶的增加。在另一方面，由于在存在不同量的差向異構(gòu)酶的條件下轉(zhuǎn)移酶是增加的，不能達(dá)到飽和。該數(shù)據(jù)表明，這兩個(gè)基因協(xié)同作用，但是，相對(duì)于差向異構(gòu)酶，需要更大體積的轉(zhuǎn)移酶來使葉子的抗壞血酸達(dá)到最大濃度。在該實(shí)驗(yàn)中，申請(qǐng)人觀察到在所用的兩種酶達(dá)到最大量時(shí)葉子的抗壞血酸增加7.5倍。將一個(gè)簡單的雙曲線模型擬合到這些數(shù)據(jù)上，預(yù)測(cè)在轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶達(dá)到飽和時(shí)葉子的抗壞血酸增加9倍。實(shí)施例11:聯(lián)合表達(dá)本發(fā)明所述的差向異構(gòu)酶序列和本發(fā)明所述的各種轉(zhuǎn)移酶序列使植物中的抗壞血酸的產(chǎn)生增加檢測(cè)在獼猴桃差向異構(gòu)酶(169164)存在條件下，以獼猴桃(319998一Ac)、番茄(BT013858_Lc)和蘋果(82552—Md)的GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化(通過實(shí)施例8所述的方法)的煙葉中的抗壞血酸的產(chǎn)生。獼猴桃319998的轉(zhuǎn)化也在三種不同的載體構(gòu)建體/土壤桿菌菌株結(jié)合體(combination)中進(jìn)行。結(jié)果如圖16所示。對(duì)于所有顯示的物種，轉(zhuǎn)移酶增加葉子中的抗壞血酸水平，且加入差向異構(gòu)酶以協(xié)同方式進(jìn)一步增加抗壞血酸。EST319998通常是達(dá)到上述作用的最有效的基因。所有三種不同的載體和土壤桿菌克隆相似地起作用。申請(qǐng)人:還檢測(cè)了319998的兩種專門的構(gòu)建體。第一種是克隆進(jìn)入提供雙丙氨膦(bialaphos)抗性的pGreenII022962-SK中的319998轉(zhuǎn)移酶(HellensRP，EdwardsEA,LeylandNR,BeanS,MullineauxPM(2000)pGreen:aversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantMol.Biol.42:819-32)。這個(gè)構(gòu)建體能用于在同一植物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶雙轉(zhuǎn)化的植物，但是具有兩種不同的選擇標(biāo)記，其用于選擇這兩種基因。圖17的結(jié)果顯示，該構(gòu)建體是完全功能性的。該實(shí)驗(yàn)還比較了獼猴桃(169164)和蘋果(108403)的差向異構(gòu)酶，表明這兩種酶可有效地與轉(zhuǎn)移酶協(xié)同地增加抗壞血酸。為了使植物來源的蛋白質(zhì)純化更容易，第二種構(gòu)建體包括在pGreen的31998轉(zhuǎn)移酶序列基因前部的His標(biāo)簽。當(dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入煙葉中時(shí)，該構(gòu)建體對(duì)于增加葉子中的抗壞血酸是有活性的(圖17)。實(shí)施例12:在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)移酶序列，增加抗壞血酸的產(chǎn)生。申請(qǐng)人產(chǎn)生用含有pGreen中的轉(zhuǎn)移酶319998(CloughSJ和BentAF，1998.62Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana)的土壤桿菌用floraldipping方法轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植物(PlantJ16:735-7430)。收集種子并選擇卡那霉素抗性品系?；厥?4個(gè)卡那霉素抗性品系，其中19個(gè)試驗(yàn)了卡那霉素抗性分離比率。該數(shù)據(jù)見圖18。在該數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，選擇下列品系進(jìn)行進(jìn)一步研究2、6、8、16、21、34、37、40、41、43、44，其中3種僅含有一個(gè)插入片段。在第二代，每種品系有多達(dá)12株植物從卡那霉素平板上挑選出來，使其在溫室中生長至標(biāo)準(zhǔn)大小的完整葉瓣，并進(jìn)行抗壞血酸檢測(cè)(圖19)。在卡那霉素抗性基礎(chǔ)上挑選的11個(gè)品系中的9個(gè)表現(xiàn)出顯著的抗壞血酸增加。增加的抗壞血酸達(dá)到超過4倍于擬南芥葉子中正常的抗壞血酸水平。一些植物相對(duì)于對(duì)照植物(例如品系8和16)顯示出減少的抗壞血酸，這提示出現(xiàn)基因沉默。在該品系內(nèi)，這些品系具有高和低的抗壞血酸植物的混合物。將從第二代中選擇的植物進(jìn)行下一代培養(yǎng)。在存在選擇標(biāo)記的條件下，通過將其培養(yǎng)在卡那霉素平板上對(duì)這些植物進(jìn)行檢査，其顯示是卡那霉素抗性的。申請(qǐng)人還觀察到了其葉子中抗壞血酸是對(duì)照水平的4倍以上的植物(圖20)，但是還觀察到在有高抗壞血酸子代的品系之中，總有一些植物具有高和低的抗壞血酸，盡管所有植物來源于高抗壞血酸的卡那霉素抗性親本。再之，這提示基因沉默的出現(xiàn)。當(dāng)抗壞血酸水平下降到未轉(zhuǎn)化植物葉子的抗壞血酸以下的時(shí)候，這尤其是這種情況，也提示了內(nèi)源性基因也被沉默了。當(dāng)319998與擬南芥64ra6Wo;^;^序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)完全序列同一性的區(qū)域(數(shù)據(jù)未顯示)。這可能是見到的明顯基因沉默的原因。申請(qǐng)人檢查了第三代植物的319998基因表達(dá)(圖21)。在每一種情況下，相對(duì)對(duì)照具有高抗壞血酸的植物也顯示出319998表達(dá)增強(qiáng)。在一種情況下，具有低抗壞血酸的植物(在這個(gè)品系中沒有植物具有高抗壞血酸)也顯示出319998高表達(dá)。這可解釋為意味著在這個(gè)品系的基因沉默期間，出現(xiàn)一些基因的表達(dá)，如經(jīng)我們的qPCR方法檢測(cè)的那樣。實(shí)施例13:轉(zhuǎn)基因煙草中本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)導(dǎo)致抗壞血酸含量增加以319998轉(zhuǎn)化煙草，并選擇卡那霉素抗性品系。這些植物被轉(zhuǎn)移到土壤中生長直至長出幾片葉子。檢測(cè)這些葉子中的抗壞血酸和基因表達(dá)(圖22)許多品系顯示基因表達(dá)，且兩個(gè)品系還顯示出葉子中抗壞血酸顯著增加60%。煙草(Nicotianatabacum)"Samsun"用攜帶含有EST319998的pHex載體的根癌土壤桿菌"gra6a"e〃'wmftwje/ade朋)株GV101轉(zhuǎn)化。所用的方法如Guerineau等人(1990)所述，除了用卡那霉素取代比率為100mg丄-l的磺酰胺選擇性試劑。實(shí)施例14:本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶序列在大腸桿菌中的表達(dá)和酶活性的驗(yàn)證。各種轉(zhuǎn)移酶基因被克隆進(jìn)入pET30載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。帶有His-Trap標(biāo)簽的蛋白質(zhì)被表達(dá)、提取，通過金屬離子層析法純化，用G25柱脫鹽。用結(jié)合檢測(cè)進(jìn)行活性檢測(cè)，其中使用GDP-D-甘露糖/GDP-L-半乳糖混合物(通過將EST198296表達(dá)的GDP-甘露糖差向異構(gòu)酶蛋白質(zhì)與GDP-甘露糖混合產(chǎn)生)作為底物進(jìn)行檢測(cè)。該底物混合物與要檢測(cè)的轉(zhuǎn)移酶孵育，伴有過量的結(jié)合酶(更多的差向異構(gòu)酶，L-半乳糖磷酸酶，L-半乳糖脫氫酶)和50mM雙丙烯酰胺三羥甲基氨基甲烷丙垸(Bistrispropane)pH7.5,0.5mMNAD和2.5mMMgCl2。檢測(cè)隨時(shí)間和加入轉(zhuǎn)移酶的量呈線性。檢測(cè)活性是在0.1至0.7nmol/mg蛋白質(zhì)/sec范圍內(nèi)(圖23)。檢測(cè)的所有表達(dá)的基因顯示轉(zhuǎn)移酶活性。此外，表達(dá)EST198296和108403的大腸桿菌也顯示差向異構(gòu)酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)，如通過HPLC和直接結(jié)合檢測(cè)所檢測(cè)到的。不能將本發(fā)明的范圍限于上述實(shí)施例。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，許多變化是可能的，其沒有脫離本發(fā)明的范圍。參考文獻(xiàn)AgiusF,Gonzalez-LamotheR，CaballeroJL,Munoz-BlancoJ，BotellaMA,ValpuestaV(2003)EngineeringincreasedvitaminClevelsinplantsbyoverexpressionofaD-galacturonicacidreductase.NatBiotechnol21:177-181.AltschulSF,MaddenTL,SchafferAA,ZhangJ,ZhangZ，MillerW,LipmanDJ(1997)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes25:3389-3402.BaileyTL，ElkanC(1994)Fittingamixturemodelbyexpectationmaximizationtodiscovermotifsinbiopolymers.InProceedingsoftheSecondInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AAAIPress,MenloPark,California,pp28-36.BartoliCGGuiametJJ,KiddleG,PastoriGM,DiCagnoR，TheodoulouFL，F(xiàn)oyerCH(2005)Ascorbatecontentofwheatleavesisnotdeterminedbymaximall-galactono-l,4-lactonedehydrogenase(GalLDH)activityunderdroughtstress.Plant,CellandEnvironment28:1073-1081.BradfordM(1976)Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipalofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry72:248-254.BrennerC(2002)Hint,Fhit,andGalT:Function,Structure,Evolution,andMechanismofThreeBranchesoftheHistidineTriadSuperfamilyofNucleotideHydrolasesandTransferases.Biochemistry41:9003-9014.BrennerC，GarrisonP,GilmourJ,PeisachD，RingeD，PetskoGA,LowensteinJM(1997)CrystalstructuresofHINTdemonstratethathistidinetriadproteinsareGalT-relatednucleotide-bindingproteins.NatStructBiol4:231-238.ChenZ,YoungTE，LingJ,ChangSC,GallieDR(2003)IncreasingvitaminCcontentofplantsthroughenhancedascorbaterecycling.ProcNatlAcadSci100:3525-3530.ConklinPL(1998)VitaminC:anewpathwayforanoldantioxidant.TrendsPlantSci3:329-330.ConklinPL,GatzekS,WheelerGL，DowdleJ，RaymondMJ,RolinskiS,IsupovM,LittlechildJA，SmirnoffN(2006)ArabidopsisthalianaVTC4EncodesL-Galactose-l-PPhosphatase,aPlantAscorbicAcidBiosyntheticEnzyme.J.Biol.Chem.281:15662-15670.ConklinPL,NorrisSR，WheelerGL，WilliamsEH,SmirnoffN,LastRL(1999)GeneticevidencefortheroleofGDP-mannoseinplantascorbicacid(vitaminbiosynthesis.ProcNatlAcadSciUSA96:4198-4203.ConklinPL，SaraccoSA，NorrisSR,LastRL(2000)IdentificationofAscorbicAcid-DeficientArabidopsisthalianaMutants.Genetics154:847-856.DaveyMW,DekempeneerE,KeulemansJ(2003)Rocket-poweredhigh-performanceliquidchromatographicanalysisofplantascorbateandglutathione.AnalyticalBiochemistry316:74-81.FergusonAR,MacRaeEA(1992)VitaminCinActinidia..ActaHorticulture297:48"87.GatzekS,WheelerGL，SmirnoffN(2002)Antisensesuppressionof1-galactosedehydrogenaseinArabidopsisthalianaprovidesevidenceforitsroleinascorbatesynthesisandrevealslightmodulated1-galactosesynthesis.PlantJournal30:541-553.GuerineauF，BrooksL,MeadowsJ,LucyA,RobinsonC,MullineauxP(1990)Sulfonamideresistancegeneforplanttransformation.PlantMolecularBiology15:127-136HellensR，AllanA,FrielE，BolithoK,GraftonK,TempletonM，KamnairetnamS,GleaveA,LaingW(2005)Transientexpressionvectorsforfunctionalgenomics,quantificationofpromoteractivityandRNAsilencinginplants.PlantMethods1:13.HellensRP,EdwardsEA,LeylandNR,BeanS,MullineauxPM(2000)pGreen:aversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantMolBiol42:819-832.HoldenHM,RaymentI,ThodenJB(2003)StructureandFunctionofEnzymesoftheLeloirPathwayforGalactoseMetabolism.J.Biol.Chem.278:43885-43888.ImaiT,KaritaS,ShiratoriQHattoriM,NunomeT,ObaK,HiraiM(1998)L-galactono-gamma-lactonedehydrogenasefromsweetpotato:PurificationandcDNAsequenceanalysis.PlantandCellPhysiology39:1350-1358.IshikawaT，DowdleJ，SmirnoffN(2006)Progressinmanipulatingascorbicacidbiosynthesisandaccumulationinplants.PhysiologiaPlantarum126:343-355.JanderQNorrisSR，RounsleySD,BushDF,LevinIM,LastRL(2002)ArabidopsisMap-BasedCloninginthePost-GenomeEra.PlantPhysiol.129:440-450.JeanmouginF,ThompsonJD,GouyM，HigginsDQGibsonTJ(1998)MultiplesequencealignmentwithClustalX.TrendsBiochemSci23:403-405.KellerR,RenzFS,KossmannJ(1999)AntisenseinhibitionoftheGDP-mannosepyrophosphorylasereducestheascorbatecontentintransgenicplantsleadingtodevelopmentalchangesduringsenescence.PlantJ19:131-141.LaingWA,BarracloughD,BulleyS，CooneyJ,WrightM，MacraeE(2004)AspecificL-Galactose-1-Phosphatephosphataseonthepathtoascorbatebiosynthesis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA)101:16976-16981.LaingWA,FrearsonN，BulleyS,MacCraeE(2004)KiwifruitL-Galactosedehydrogenase;molecular,biochemicalandphysiologicalaspectsoftheenzyme.FunctionalPlantBiology31:1015-1025.Laing,^V.A.,^Vright,M.，Cooney,J.&Bulley,S.(2007)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA)104:9534-9..LorenceA，ChevoneBI,MendesP，NesslerCL(2004)myoinositolOxygenaseOffersaPossibleEntryPointintoPlantAscorbateBiosynthesis.PlantPhysiol.134:1200-1205.PiroQZuppaA，DalessandroQNorthcoteDH(1993)Glucomannansynthesisinpeaepicotyls:themannoseandglucosetransferases.Planta190:206-220.RadzioJA,LorenceA,ChevoneBI,NesslerCL(2003)L-Gulono-l,4-lactoneoxidaseex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-D-甘露糖差向異構(gòu)酶。30、根據(jù)權(quán)利要求29所述的分離的多核苷酸或其變體，其中該變體包含序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。31、根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的分離的多核苷酸或其變體，其中該變體包含序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。32、根據(jù)權(quán)利要求29至31所述的分離的多核苷酸或其變體，其中該變體包含與SEQIDNO:25至27中任一序列具有至少91%同一性的序列。33、一種分離的多核苷酸，其編碼包含選自SEQIDNO:25至27中任一序列的多肽。34、一種具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的分離的多肽，其包含與SEQIDNO:25至27的氨基酸序列具有至少91%同一性的序列。35、根據(jù)權(quán)利要求34所述的分離的多肽，其包含選自SEQIDNO:25至27中任一個(gè)的氨基酸序列。36、一種分離的多核苷酸，其包含a)—種多核苷酸，其包含權(quán)利要求22至26、29至33和36中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的長度至少為15個(gè)核苷酸的片段；b)—種多核苷酸，其包含本發(fā)明所述多核苷酸的長度至少為15個(gè)核苷酸的互補(bǔ)鏈；或者d)—種多核苷酸，其包含能與本發(fā)明所述多核苷酸雜交的長度至少為15個(gè)核苷酸的序列。37、一種遺傳構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求22至26、29至33和36中任一項(xiàng)所述的至少一種多核苷酸。38、一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求22至26、29至33和36中任一項(xiàng)所述的至少一種多核苷酸。39、一種RNAi構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求22至26、29至33和36中任一項(xiàng)所述的至少一種多核苷酸。40、一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)所述的至少一種構(gòu)建體。41、一種遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求22至26、29至33和36中任一項(xiàng)所述的至少一種多核苷酸，或權(quán)利要求27、28、34和35中任一項(xiàng)所述的至少一種多肽。42、根據(jù)權(quán)利要求41所述的遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其表達(dá)編碼GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸；和編碼GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸。43、一種制備GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶多肽的方法，該方法包含培養(yǎng)能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶多肽的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體。44、一種制備GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的酶產(chǎn)物的方法，其包括在酶的底物存在條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包括權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體，能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶多肽，酶的底物可以補(bǔ)充至宿主細(xì)胞中或天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)。45、一種制備GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽的方法，其包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體，能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽。46、一種制備GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的酶產(chǎn)物的方法，其包括在酶的底物存在條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包括權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體，能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶多肽，酶的底物可以補(bǔ)充至宿主細(xì)胞中或天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)。47、一種生物合成抗壞血酸的方法，其包括在抗壞血酸前體存在條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體，能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶，抗壞血酸前體可補(bǔ)充至宿主細(xì)胞中或天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)。48、根據(jù)權(quán)利47所述的方法，其中能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的宿主細(xì)胞還包含權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體。49、一種生物合成抗壞血酸的方法，其包括以下步驟在抗壞血酸前體存在條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含能表達(dá)GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體，抗壞血酸前體可以補(bǔ)充至宿主細(xì)胞中或天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)。50、根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中能表達(dá)GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞還包含權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體。51、一種遺傳修飾的植物細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求22至26、29至33和36中任一項(xiàng)所述的至少一種多核苷酸，或權(quán)利要求27、28、34和35中任一項(xiàng)所述的至少一種多肽。52、一種植物細(xì)胞，其包含至少一種權(quán)利要求38所述的表達(dá)構(gòu)建體，或至少一種權(quán)利要求37所述的遺傳構(gòu)建體。53、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含權(quán)利要求51或52所述的植物細(xì)胞的植物。54、一種選擇GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性或者抗壞血酸含量改變的植物的方法，其包括檢測(cè)植物的權(quán)利要求22至26和36中任一項(xiàng)所述多核苷酸表達(dá)的改變，或權(quán)利要求27或28所述的多肽表達(dá)的改變。55、一種選擇GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性或者抗壞血酸含量改變的植物的方法，其包含檢測(cè)植物的權(quán)利要求29至33中任一項(xiàng)所述的多核苷酸表達(dá)的改變或權(quán)利要求34或35所述的多肽表達(dá)的改變。56、一種通過權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法制備的植物細(xì)胞或植物。57、一種或一組通過權(quán)利要求54或55所述的方法選擇的植物。58、一種制備抗壞血酸的方法，其包括從權(quán)利要求51、52、56或者57中任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞或植物中提取抗壞血酸。59、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:1至11中任一個(gè)序列的多肽或其具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的變體接觸，且b)檢測(cè)所述化合物與所述多肽之間結(jié)合的存在和/或缺失；其中結(jié)合提示所述的化合物是候選除草劑。60、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述化合物與包含選自SEQIDNO:1至11中任一個(gè)序列的多肽或其具有GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的變體接觸，且b)評(píng)價(jià)該化合物對(duì)多肽的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。61、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35中任一個(gè)序列的多肽或其具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的變體接觸，且b)檢測(cè)所述化合物與所述多肽之間結(jié)合的存在和/或缺失；其中結(jié)合提示所述的化合物是候選除草劑。62、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35中任一個(gè)序列的多肽或其具有GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的變體接觸，且b)評(píng)價(jià)該化合物對(duì)多肽的GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。63、一種抗權(quán)利要求27、28、34和35中任一項(xiàng)所述的多肽的抗體。64、一種制備L-半乳糖-l-磷酸的方法，其包含將GDP-L-半乳糖和GDP受體與包含本發(fā)明所述多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物接觸獲得L-半乳糖-l-磷酸，其中所述GDP受體包括己糖-l-磷酸或磷酸。65、一種制備GDP-半乳糖的方法，包括將GDP-甘露糖與包含本發(fā)明所述多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物接觸或與本發(fā)明所述的多肽接觸獲得GDP-半乳糖。全文摘要本發(fā)明提供調(diào)節(jié)植物中的GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性；和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性；和/或抗壞血酸含量的組合物和方法。本發(fā)明提供具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶活性的植物和植物細(xì)胞。本發(fā)明提供具有增加抗壞血酸含量的植物和植物細(xì)胞，這種增加是由于GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)；GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的過表達(dá)；或特別是GDP-L-半乳糖脒基轉(zhuǎn)移酶和GDP-D-甘露糖差向異構(gòu)酶的組合過表達(dá)。文檔編號(hào)A01N61/00GK101687907SQ200880011227公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日發(fā)明者S·M·W·布利,W·A·萊恩申請(qǐng)人:新西蘭植物和食品研究院有限公司