一種d-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶的68位和109位雙突變體酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的68位和109位雙突變體酶及其應(yīng)用，屬于酶的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了由來源于梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbolteae）ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（簡稱DPE酶）作為親本，利用基因突變技術(shù)，將其68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分別替換為異亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，獲得突變體酶Y68I/G109P，其熱穩(wěn)定性和催化活性均得到提高，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】一種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的68位和109位雙突變體酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開一種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的68位和109位雙突變體酶及其應(yīng)用，屬于酶的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE酶)屬于D-塔格糖3_差向異構(gòu)酶(簡稱DTE)家族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構(gòu)，是生產(chǎn)稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨或與其他酶偶聯(lián)合成多種碳水化合物，被廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、食品和制藥等領(lǐng)域。DPE酶可分別催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0003]隨著由過量高能量食物攝入引發(fā)的一系列慢性病在世界范圍內(nèi)的爆發(fā)，膳食結(jié)構(gòu)越來越受到人們的關(guān)注。新型的蔗糖替代品的開發(fā)和研究仍是功能性甜味劑領(lǐng)域具有重要經(jīng)濟(jì)價值和實際意義的當(dāng)務(wù)之急。D-阿洛酮糖是一種稀有糖，具有多種營養(yǎng)和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低熱量的甜味劑。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認(rèn)定為GRAS食品，允許用于食品和膳食補(bǔ)充劑中。另外D-阿洛酮糖具有保護(hù)胰腺β-胰島細(xì)胞，減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業(yè)中有很大的應(yīng)用前景。
[0004]雖然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但其在自然界中含量極少且極難獲得。生物法制備D-阿洛酮糖是近年來的一個研究熱點。良好的生物催化劑的開發(fā)對工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。耐熱酶具有多種優(yōu)點 ，如轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)速度快，污染少，底物粘度低等。因此，開發(fā)具有良好熱穩(wěn)定性的DPE酶對D-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。
[0005]由于來源于野生菌株未經(jīng)改造的DPE酶在熱穩(wěn)定性、催化活性等方面存在一定的局限性，限制了其應(yīng)用范圍。本實驗室開發(fā)的梭狀芽孢桿菌bolteae)
酶可以有效促進(jìn)D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化(Min Jia, et al.2013, AppliedMicrobiology and Biotechnology, DOI 10.1007/s00253-013-4924-8)。但為獲得更適合的生物催化劑，通過定點突變的方法，對DPE酶進(jìn)行分子改造，進(jìn)一步提高其催化活性和熱穩(wěn)定性，以期得到酶學(xué)性質(zhì)更適合工業(yè)應(yīng)用的DPE酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的68位和109位雙突變體酶及其應(yīng)用，對D-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種功能改善的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE的突變體酶Y68I/G109P，將來源于梭狀芽孢桿菌boIteaeH BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行突變所得的突變體酶；將原來DPE基因中的68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分別替換為異亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，命名為Y68I/G109P。
[0008]與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶Y68I/G109P的熱穩(wěn)定性獲得提高，以在55°C下的半衰期t5(l來表示熱穩(wěn)定性，DPE的突變體酶Y68I/G109P的半衰期為78.3min,是野生型DPE酶的1.8倍；所述DPE的突變體酶Y68I/G109P的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其乙值-低，<at/ny到提高;__
【權(quán)利要求】
1.一種功能改善的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE的突變體酶Y68I/G109P，其特征在于將來源于梭狀芽孢桿菌bolteae) ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行突變所得的突變體酶；將原來DPE基因中的68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分別替換為異亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，命名為Y68I/G109P。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DPE的突變體酶Y68I/G109P，其特征在于與野生型DPE酶相t匕，所述DPE的突變體酶Y68I/G109P的熱穩(wěn)定性獲得提高，以在55°C下的半衰期t5(l來表示熱穩(wěn)定性，DPE的突變體酶Y68I/G109P的半衰期為78.3min,是野生型DPE酶的1.8倍；所述DPE的突變體酶Y68I/G109P的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其值降低，<at/fm得到提聞;

3.—種重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于其中含有權(quán)利要求1所述DPE的突變體酶Υ68Ι/G109P基因。
4.一種表達(dá)宿主，其特征在于其被權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求1所述DPE的突變體酶Y68I/G109P的應(yīng)用，其特征在于在化學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/145GK103849612SQ201410001843
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】江波, 沐萬孟, 賈敏, 張濤, 黃敏, 周榴明 申請人:江南大學(xué)