一種高催化活性的d-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用，屬于酶的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開(kāi)了由來(lái)源于梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbolteae）ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（簡(jiǎn)稱DPE酶）作為親本，利用基因突變技術(shù)，將其68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸Ile，獲得單突變體酶Y68I，其催化活性得到提高，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用，屬于酶的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE酶)屬于D-塔格糖3_差向異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱DTE)家族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構(gòu)，是生產(chǎn)稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨(dú)或與其他酶偶聯(lián)合成多種碳水化合物，被廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、食品和制藥等領(lǐng)域。DPE酶可分別催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0003]隨著由過(guò)量高能量食物攝入引發(fā)的一系列慢性病在世界范圍內(nèi)的爆發(fā)，膳食結(jié)構(gòu)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。新型的蔗糖替代品的開(kāi)發(fā)和研究仍是功能性甜味劑領(lǐng)域具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)際意義的當(dāng)務(wù)之急。D-阿洛酮糖是一種稀有糖，具有多種營(yíng)養(yǎng)和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低熱量的甜味劑。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認(rèn)定為GRAS食品，允許用于食品和膳食補(bǔ)充劑中。另外D-阿洛酮糖具有保護(hù)胰腺β-胰島細(xì)胞，減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業(yè)中有很大的應(yīng)用前景。
[0004]雖然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但在其在自然界中含量極少且極難獲得。生物法制備D-阿洛酮糖是近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。高效的生物催化劑的開(kāi)發(fā)對(duì)工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。因此，開(kāi)發(fā)具有高催化活性的DPE酶對(duì)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的梭狀芽孢桿菌iClostridium bolteae) DPE酶可以有效促進(jìn)D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化(Min Jia, et al.2013, Applied Microbiology and Biotechnology,DOI 10.1007/s00253-013-4924-8)o但為獲得更適合的生物催化劑，通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，對(duì)DPE酶進(jìn)行分子改造，進(jìn)一步提高其催化活性和熱穩(wěn)定性，以期得到酶學(xué)性質(zhì)更適合工業(yè)應(yīng)用的DPE酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用，對(duì)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE的突變體酶Y68I，將來(lái)源于梭狀芽孢桿菌bolteae) KTCC BAA-613的D-阿洛酮糖
3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行突變所得的單突變體酶；將原來(lái)DPE基因中第68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸He，命 名為Y68I。
[0007]與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶Y68I的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其尤值降低，左_/尤得到提高。
【權(quán)利要求】
1.一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE的突變體酶Y68I，其特征在于將來(lái)源于梭狀芽孢桿菌(bolteae) ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行突變所得的單突變體酶；將原來(lái)DPE基因中第68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸He，命名為Y68I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DPE的突變體酶Y68I，其特征在于與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶Y68I的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其尤值降低，KJKa得到提聞:
Km mMKcst, s'1kcJKm s4 mM'1 野生菌54.4556.101.031 。 Y68I46.0562.741362
3.—種重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于其中含有權(quán)利要求1所述DPE的突變體酶Y68I基因。
4.一種表達(dá)宿主，其特征在于其被權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求1所述DPE 的突變體酶Y68I的應(yīng)用，其特征在于在化學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/90GK103710330SQ201410001913
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】江波, 沐萬(wàn)孟, 賈敏, 張濤, 黃敏, 周榴明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)