專利名稱：：一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于遺傳工程和水稻培育領(lǐng)域，具體涉及一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：我國的雜交水稻推廣面積巳達2.2億畝，約占水稻總面積的50%，產(chǎn)量占到水稻總產(chǎn)量的60%。雜交稻每年增產(chǎn)的稻谷可養(yǎng)活大約7500萬人口，為國民經(jīng)濟的發(fā)展做出了巨大的貢獻。雜交稻推廣已有35年，目前面臨進一步發(fā)展的難題。雜交稻的進一步發(fā)展有兩個方向l)發(fā)展一種可以隨機配組的制種技術(shù)，擴大優(yōu)良雜交稻組合的范圍;2)利用水稻亞種間強大的雜種優(yōu)勢挖掘雜交稻的增產(chǎn)潛力。目前在這兩個發(fā)展方向上存在兩個瓶頸因為三系雜交稻不育系和恢復(fù)系的選育受到基因型的制約，無法隨機配組；水稻亞種間雜交存在不育性的障礙，很難在實踐中加以利用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法。本發(fā)明提供了一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法。該方法包括如下步驟(1)將水稻程序性死亡基因反向插入表達載體的多克隆位點處；(2)培養(yǎng)導入(1)所得的重組質(zhì)粒的水稻愈傷組織細胞；(3)誘導(2)所得的水稻愈傷組織細胞光照培養(yǎng)，分化出植株。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，(l)所使用的表達載體可以是各種市售載體，例如，pCAMBIA1304、或者pBY520,pBin438等。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，(1)可以是將水稻程序性死亡基因反向插入pCAMBIA1304載體的35S啟動子下游。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，(2)可以使用基因槍法或者膿桿菌法將重組質(zhì)粒導入水稻愈傷組織細胞。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，(2)中可以先將導入重組質(zhì)粒的水稻愈傷組織細胞進行恢復(fù)培養(yǎng)，然后利用潮霉素進行抗性篩選。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，(3)中可以將(2)所得水稻愈傷組織細胞置于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)20-40天，分化出小植株后轉(zhuǎn)移至生根壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)。水稻程序性死亡基因，即水稻C)^PZX:D基因，genbank登錄號為AY327105長約4.8kb，全長cDNA由8個外顯子組成。正常編碼的cDNA長416bp，編碼128個氨基酸。OsPDCD蛋白質(zhì)氨基酸順序如SEQIDNO2所示，其核苷酸編碼序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明采用水稻程序性死亡基因還包括如SEQIDNO1所示序列的簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.l序列的編碼框23-406位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.1中23-406位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。大多數(shù)基因工程都是將基因的核苷酸編碼序列正向插入載體，而本發(fā)明是將OWDCD反向插入載體。本發(fā)明實施例1中實用的O^PDCZ)反向序列如SEQIDNO3所示。C^PDCZ)的主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為8個外顯子組成的mRNA序列，全長418bp。一般反義基因工程中基因編碼順序的反義順序都選擇在mRNA的5'序列，干擾效率較高。而本發(fā)明選取了C^PDCD的全長mRNA的反義序列，以期達到最大的干擾效果。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，未特別指出的步驟均可以采用常規(guī)技術(shù)。例如，將重組質(zhì)粒導入愈傷組織的方法、對愈傷組織細胞進行抗性篩選、愈傷組織細胞分化培養(yǎng)等。當然，采用本發(fā)明實施例中列舉方法，效果更佳。例如1.選用成熟的水稻種子胚用于愈傷組織誘導。2.成熟種子胚誘導的愈傷組織在第一次繼代培育7-10天后用于基因槍轉(zhuǎn)化處理。3.愈傷組織在潮霉素篩選培育基上的選擇培養(yǎng)分兩次進行，第一次篩選壓為30mg/L潮霉素，時間14-17天，暗培養(yǎng)；第二次篩選壓為30mg/L潮霉素，時間14-17天50mg/L潮霉素，時間8-12天，暗培養(yǎng)。4.采用基因槍導入法，獲得多拷貝轉(zhuǎn)基因無性系以方便選擇對再生的光周期敏感不育株。本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的水稻是一種光敏雄性不育水稻。雄性不育系是指一種雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉無力生活，不能自花授粉結(jié)實，只有依靠外來花粉才能受精結(jié)實。因此，借助這種母水稻作為遺傳工具，通過人工輔助授粉的辦法，就能大量生產(chǎn)雜交種子。光敏不育系既是不育系又是保持系。保持系是指一種正常的水稻品種，它的特殊功能是用它的花粉授給不育系后，所產(chǎn)生后代，仍然是雄性不育的。因此，借助保持系，不育系就能一代一代地繁殖下去。恢復(fù)系是指一種正常的水稻品種，它的特殊功能是用它的花粉授給不育系所產(chǎn)生的雜交種雄性恢復(fù)正常，能自交結(jié)實，如果該雜交種有優(yōu)勢的話，就可用于生產(chǎn)。另一方面，本發(fā)明提供了一種含有水稻程序性死亡基因的重組載體，水稻程序性死亡基因反向插入擴增載體或者表達載體的多克隆位點處。本發(fā)明的重組載體中，所述的表達載體可以是pCAMBIA1304、pBY520，或者pBin438，等等。本發(fā)明中，通常將基因插入載體的多克隆位點處。例如，在實施例1中，將水稻OWDCD基因反向插入BsmFI禾口BstEII酶切位點之間。本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的水稻可用于培育雜交水稻。本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的水稻具有正常的表型，同時又是一種光敏雄性不育水稻，可以擴大優(yōu)良雜交稻組合的范圍，解決了長期制約雜交水稻發(fā)展的瓶頸問題。實驗證明，本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的光敏雄性不育水稻在長日照環(huán)境下可以恢復(fù)結(jié)實。用熒光定量PCR(real-timePCR)分析內(nèi)源OsPDCD在對照中花11和anti-osPDCD轉(zhuǎn)基因植株中的表達量變化，包括①人工氣候箱中，14.5光周期下，不同日均溫度情況；②人工氣候箱中，日均溫度25度下，不同光周期條件下③自然長光照條件下。結(jié)果標明，在不同條件下，轉(zhuǎn)基因不育株內(nèi)源OsPDCD基因的mRNA的表達量均低于對照。這進一步證實，水稻Oy尸DCD基因反向插入對本發(fā)明的生產(chǎn)方法所得的水稻光敏不育特性起到關(guān)鍵作用。本發(fā)明的生產(chǎn)方法在培育雜交水稻方明有以下用途1)利用水稻程序性死亡基因編碼順序或非編碼順序的反義序列構(gòu)建組成性或組織特異性表達載體轉(zhuǎn)化水稻，培育光周期敏感雄性不育/可育兩用系；2)利用水稻程序性死亡基因Os戶DC"編碼順序或非編碼順序的反義序列構(gòu)建組成性或組織特異性表達載體轉(zhuǎn)化水稻，培育光周期敏感雄性不育/可育兩用系用于配制生產(chǎn)雜交水稻；3)利用水稻程序性死亡基因Os尸Z)CD編碼順序或非編碼順序的反義序列構(gòu)建組成性或組織特異性表達載體轉(zhuǎn)化水稻，將培育的光周期敏感雄性不育/可育兩用系用作親本，將該不育特性轉(zhuǎn)移到其它水稻品種并用于雜交稻制種；4)利用植物程序性死亡基因同源基因的反義序列構(gòu)建組成性或組織特異性表達載體轉(zhuǎn)化經(jīng)濟作物或糧食作物，培育光周期敏感雄性不育/可育兩用系；5)利用植物程序性死亡基因Os戶i)Ci)同源基因的反義序列構(gòu)建組成性或組織特異性表達載體轉(zhuǎn)化經(jīng)濟作物或糧食作物，培育光周期敏感雄性不育/可育兩用系用于配制生產(chǎn)雜交種。本發(fā)明提供了一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法。創(chuàng)造性地將基因反向插入水稻表達載體，從而建立了一個可以隨機配組生產(chǎn)雜交水稻的系統(tǒng)，取代目前雖然在生產(chǎn)上應(yīng)用但存在許多問題的自然突變光溫敏兩用系。本發(fā)明的生產(chǎn)方法在培育雜交水稻方面，創(chuàng)建了一種可以隨機配組的制種技術(shù)，擴大優(yōu)良雜交稻組合的范圍。圖1是重組表達載體pCAMBIA1304/anti-osPDCD構(gòu)建示意圖。圖中，osPDCD反向插入35s啟動子下游。圖2是重組表達載體pBY520/anti-osPDCD構(gòu)建示意圖。圖中，osPDCD反向插入35s啟動子下游。圖3是重組表達載體pBin438/anti-osPDCD構(gòu)建示意圖。圖中，osPDCD反向插入35s啟動子下游，位于Bamffl和Sail酶切位點之間。圖4是光敏不育株用于雜交稻制種的培育流程圖。不育系的繁育。反義0^￡>C￡>轉(zhuǎn)基因不育系在短光照(<13hr)下可以結(jié)實。我國海南島冬季光照為ll-12hr，可以滿足轉(zhuǎn)基因不育系花粉轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎囊?。因此在冬季可在海南島繁殖轉(zhuǎn)基因不育系種子。此外，我國長江流域和華南地區(qū)在8中下旬光照長度開始短于13hr。在6月中下旬播種轉(zhuǎn)基因不育系，在孕穗期光照長度正好短于13hr，可以繁殖轉(zhuǎn)基因不育系種子。我國華南和長江流域在在6月中旬之后光照時數(shù)長于13.5hr,4月中下旬至5月中下旬播種轉(zhuǎn)基因不育系，在孕穗期正好遇上光照時數(shù)大于13.5hr，導致花粉不育.選擇生產(chǎn)性狀優(yōu)良的品系與不育系授粉雜交,可用于雜交稻制種。圖5是水稻中花表型圖。圖左轉(zhuǎn)基因中花11不育系單個小穗，可見花藥瘦小不開裂。圖中轉(zhuǎn)基因中花U不育系與對照中花11雜交F1代單個小穗,花藥形態(tài)正常,可開裂散粉,育性正常。圖右對照中花11單個小穗,花藥形態(tài)正常,可開裂散粉,育性正常。圖6是水稻花粉表型圖。其中，左中右分別為中花ll轉(zhuǎn)基因不育系、中花ll轉(zhuǎn)基因不育系與中花ll雜交Fl代、中花11對照。圖右轉(zhuǎn)基因中花ll不育系花粉,碘化鉀染色檢測,花粉不染色,為不育。圖中轉(zhuǎn)基因中花11不育系與對照中花11雜交F1代花粉，碘化鉀染色檢測，花粉染色，為可育。圖右對照中花11花粉，碘化鉀染色檢測,花粉染色,為可育圖7是水稻稻穗表型圖。其中，左中右分別為中花ll轉(zhuǎn)基因不育系、中花11轉(zhuǎn)基因不育系與中花11雜交F1代、中花11對照。(請簡要描述一下對比結(jié)果和意義)。圖左轉(zhuǎn)基因中花11不育系穗枝梗上著生的多個小穗，可見花藥瘦小不開裂。圖中轉(zhuǎn)基因中花11不育系與對照中花11雜交Fl代穗枝梗上著生的多個小穗,花藥形態(tài)正常,花藥開裂散粉，育性正常。圖右對照中花11穗枝梗上著生的多個小穗，花藥形態(tài)正常,開裂散粉，育性正常。圖8是人工氣候箱中花粉育性圖。其中，(a)(b)(c)(d)為人工氣候箱中，轉(zhuǎn)基因植株分別在11.5h，12.5h，13.5h和14.5h光周期下的花粉育性情況。(e)(f)(g)分別為轉(zhuǎn)基因不育系與中花ll,鎮(zhèn)稻88，武粳14的F1代在上海大田長日照情況下花粉育性情況。(h)為對照中花ll的花粉。(a)(b)(c)(d)為人工氣候箱中，轉(zhuǎn)基因植株分別在11.5h，12.5h，13.5h和14.5h光周期下的花粉育性情況.隨著光照時間的延長，碘化鉀染色檢測轉(zhuǎn)基因不育系的花粉染色比率依次降低,直至14.5h光周期下全部不育。(e)(f)(g)分別為轉(zhuǎn)基因不育系與中花ll,鎮(zhèn)稻88，武粳14的F1代在上海大田長日照情況下花粉育性情況。(h)為對照中花11的花粉。轉(zhuǎn)基因不育系與中花11雜交F1代(e)花粉全部恢復(fù)可育，結(jié)實正常.轉(zhuǎn)基因不育系與鎮(zhèn)稻88雜交Fl代(f)雖然約50%花粉恢復(fù)可育,但結(jié)實完全正常.轉(zhuǎn)基因不育系與武粳14雜交Fl代(g)花粉約50%花粉恢復(fù)可育，但結(jié)實完全正常.造成上述三個雜交組合Fl代花粉染色比率差異的原因是，三個親本，中花ll,鎮(zhèn)稻88和武粳14的感光性不同.武粳14為強感光晚稻，鎮(zhèn)稻88為中感光早熟晚粳，中花11為弱感光中粳。圖9是植株表型圖。圖左，反義OsPDCD基因轉(zhuǎn)化粳稻中花ll獲得的轉(zhuǎn)基因植株T3代不育系植株；圖中，反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因不育系與中花ll雜交Fl代；圖右，中花11親本。圖10是穗部結(jié)實表型圖。圖左，反義OsPDCD基因轉(zhuǎn)化粳稻中花ll獲得的轉(zhuǎn)基因植株T3代不育系稻穗，全不育；圖中，反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因不育系與中花11雜交F1代稻穗，正常結(jié)實；圖右，中花ll親本稻穗，正常結(jié)實。圖ll是植株表型圖。圖左，反義OsPDCD基因轉(zhuǎn)化粳稻中花ll獲得的轉(zhuǎn)基因植株T3代不育系植株；圖中，反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因不育系與秈稻9311雜交F1代植株；圖右，9311親本植株。圖12是穗部結(jié)實表型圖。圖左，反義OsPDCD基因轉(zhuǎn)化粳稻中花ll獲得的轉(zhuǎn)基因植株T3代不育系植株稻穗，全不育，不結(jié)實；圖中，反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因不育系與秈稻9311雜交F1代植株稻穗，結(jié)實率70%;圖右，秈稻9311雜交Fl代植株稻穗，結(jié)實率90%。圖13是反義Oy尸Z)CD5表達載體轉(zhuǎn)化水稻的抽穗期示意圖。中花11轉(zhuǎn)基因不育株的抽穗期比中花11對照推遲。反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因中花11植株與對照未轉(zhuǎn)基因中花11比較，轉(zhuǎn)基因中花11植株的生育期推遲。在上海地區(qū)在三個不同的播種期4月14日，4月26日和5月6日播種，反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因中花11較之對照中花11的抽穗期推遲30-50天。圖14是中花11轉(zhuǎn)基因不育株的分蘗力對照圖。左右分別為轉(zhuǎn)基因不育株(左)的中花11和中花11對照(右)?？梢?，轉(zhuǎn)基因不育株的分蘗能力中花11對照增強。反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因中花11植株(圖右)的分蘗力比未轉(zhuǎn)化的對照中花ll更強。圖15是anti-osPDCD5在轉(zhuǎn)基因不育株中的轉(zhuǎn)錄電泳圖。其中，1，2為轉(zhuǎn)基因水稻；control為中花11對照；actin基因為擴增cDNA的對照。反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因中花11植株(泳道1和2)與對照未轉(zhuǎn)基因中花11植株反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因的表達PCR檢測。對照未檢測到反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因的表達，反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因中花11植株(泳道1和2)檢測到反義OsPDCD轉(zhuǎn)基因的表達。具體實施例方式實施例1表達載體pCAMBIA1304/anti-osPDCD的構(gòu)建用帶酶切位點的引物克隆水稻程序性死亡基因OsPDC的全長cDNA,將cDNA和植物表達載體pCAMBIA1304用BsmFI和BstEII酶切后連接，這樣OsPDCD就反插到了35spromoter的下游。OsPDCD的反義序列表達載體pCAMBIA1304/anti-osPDCD5構(gòu)建完成。參考圖1。實施例2愈傷組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化2.1誘導水稻愈傷組織培養(yǎng)基2丄1誘導及繼代培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4-D。2丄2高滲培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4-D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇。2丄3第一輪篩選培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4-D+30mg/L潮霉素。2丄4第二輪篩選培養(yǎng)基MS+2mg/L2，4-D+50mg/L潮霉素。2.1.5分化培養(yǎng)基MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+50mg/L潮霉素。2丄6生根壯苗培養(yǎng)基1/2MS+0.1mg/LNAA注1.以上培養(yǎng)基均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，pH5。82.愈傷誘導、繼代、篩選培養(yǎng)條件為26-28'C暗培養(yǎng)，分化、生根壯苗為26-28'C及16小時光周期。2.2愈傷組織誘導與處理2.2.1取授粉后12-15天的未成熟種子，在無菌條件下，先用70。/。乙醇浸洗10min，轉(zhuǎn)入0。1%升汞浸泡20min，無菌水清洗3次。2.2.2在無菌條件下剝離幼胚，接種于愈傷誘導培養(yǎng)基上，26-28。C暗培養(yǎng)約20天后切芽，繼代一次。2.2.3在繼代培養(yǎng)基中挑選生長旺盛、淡黃色的愈傷約30-50塊(每塊3mm左右)，置于高滲培養(yǎng)基上中央，排成直徑約2.5cm的圓圈內(nèi)，培養(yǎng)約4-5h后用于轉(zhuǎn)化。2.3基因槍轉(zhuǎn)化2.3.1基因槍從寧波新芝科技有限公司購置的高壓氣體基因槍，型號:GJ-1000。2.3.2微粒子彈制備2.3.3稱取60mg鎢粉(直徑約1um)，加入到1.5ml滅菌離心管中，再加入lml無水乙醇，振蕩lmin，于10000rpm離心10s，棄上清，重復(fù)洗一次后，將金粉懸浮于1ml無菌水中現(xiàn)用或-2(TC保存。2.3.4吸取50ul鎢粉懸浮液于1.5ml離心管，依次加入5ugDNA、50ul2.5MCaCl2、20ul0.1M亞精胺，振蕩5分鐘，10000rpm離心20s，棄上清，以140ul無水乙醇漂洗兩次，加入60ul無水乙醇，懸浮待用。2.4轟擊受體材料2.4.1將基因槍放于超凈工作臺上，用70%酒精擦凈真空室，并將可裂膜、載粒膜、金屬擋網(wǎng)(均由寧波新芝科技有限公司供貨)于70%酒精中消毒30分鐘，然后用無菌濾紙吸干或吹凈殘余酒精。2.4.2打開電源開關(guān)，真空泵及氦氣瓶閥。2.4.3將可裂膜裝入固定、旋緊。2.4.4取10ul包被DNA的鵒粉無水乙醇懸浮液，均勻涂布于載粒膜中心，放在超凈臺上吹干。2.4.5將載有微彈的載粒膜及擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置，使有顆粒的一面朝下。2.4.6將培養(yǎng)皿放在托盤上，使愈傷集中于培養(yǎng)皿中央。2.4.7打開氣瓶，調(diào)節(jié)壓力1100Psi。2.4.8抽真空，當真空度達到需要值時，將VAC鍵轉(zhuǎn)到Hold位置。2.4.9轟擊，每皿轟擊2次(第一次轟擊后將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)90度后進行第二次轟擊)，按放氣鍵使真空表讀數(shù)回零，取出樣品，轟擊后于高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。2.5轉(zhuǎn)化愈傷組織篩選2.5.1將打槍后高滲培養(yǎng)基上的愈傷轉(zhuǎn)入不含篩選劑的誘導培養(yǎng)基上恢復(fù)生長5-7天。2.5.2將愈傷轉(zhuǎn)到含30mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，均勻擺放，暗培養(yǎng)14-17天進行第一次抗性篩選。2.5.3將抗性愈傷轉(zhuǎn)入含50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)8-12天進行第二次抗性篩選。實施例3水稻""ri-oy尸DCD基因轉(zhuǎn)化植株的篩選與檢測將篩選后存活的愈傷于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30天。待分化出小植株后，將小植株轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，長大后移入溫室。分別采用PCR擴增和基因組Southern雜交雜法檢測候選的抗性植株，共獲得7含有朋rt-wPiX:Z)的陽性植株。實施例4反義程序性死亡基因o^do)07"-mpzx:d)轉(zhuǎn)基因的表達可產(chǎn)生光周期敏感雄性不育將a"ri-M尸Z)GD基因轉(zhuǎn)化處理的中花11試管苗移栽至溫室，經(jīng)PCR檢測獲得陽性T0代植株7棵，其中4棵部分結(jié)實。Tl代轉(zhuǎn)基因種子于2004年春在上海大田種植，4個株系均為花粉敗育，無結(jié)實。將不育的轉(zhuǎn)基因Tl代植株稻樁于2004年冬在海南島移栽，到2005年春，轉(zhuǎn)基因Tl代不育植株稻樁抽穗，育性恢復(fù)并結(jié)實正常。將轉(zhuǎn)基因T2代種子于2006年春在上海種植，所有轉(zhuǎn)基因T2代植株又全部花粉敗育。2006年冬在海南種植該T2代，花粉可育，植株正常結(jié)實。上述實驗表明，朋ri-o^dcd轉(zhuǎn)化的弱感光品種中花11具有光周期敏感的雄性不育的特征，即在上海夏日長光照下雄性不育，在海南冬季短光照下轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎嵤├?反義程序性死亡基因OyPZ)CD轉(zhuǎn)基因的表達可產(chǎn)生光周期敏感雄性不育的人工氣象箱檢測提供含""rt-o^PDC"的轉(zhuǎn)基因水稻種子，委托浙江杭州水稻所在人工氣象箱中進行溫度和光照時間的不同組合處理，檢測該轉(zhuǎn)基因水稻的雄性不育是由哪個條件引起。結(jié)果如下表1光周期對水稻結(jié)實率的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2光周期與日平均溫度對水稻結(jié)實率的影響_光周期(白力晚上)日平均溫度轉(zhuǎn)朋rt-osPDCT)水稻結(jié)實率對照中花ll水稻結(jié)實率11.5h23°C23.63%48.85%11.5h25°C35.63%51.68%11.5h27°C45.22%60.28%14.5h23°C9.82%67.22%14.5h25°C3.32%47.50%14.5h_^5_0.63%_54.23%可見，flf"rt-o^P"CD轉(zhuǎn)基因水稻主要是受光周期影響的，在長日照條件下(14.5h光照)表現(xiàn)為不育，在短日照條件下(小于13.5h的光照)育性恢復(fù)正常。實施例6朋^o^DCD轉(zhuǎn)基因光周期敏感雄性不育水稻的雜交育性恢復(fù)為了檢測"""-o^P"CD5基因中花11長光照下和其它品種雜交后的育性恢復(fù)情況，選擇了四個粳稻品種中花11(弱感光)，C418(不感光)，鎮(zhèn)稻88(強感光)和武梗14(強感光)，與轉(zhuǎn)基因不育系的T2代雜交。Fl代雜種在上海地區(qū)5月5日播種，8月25日前后抽穗?；ǚ鄣饣浫旧R檢，染色可育花粉比例分別達到87%，95%，58%，51%。將雜種一代套袋自交，檢測自交結(jié)實率。結(jié)果證實，轉(zhuǎn)基因不育株與中花U，C418和武梗14的雜交一代的自交結(jié)實率分別為95%，90%，85%，82%。這表明，在Fl代o^DCD基因劑量減半，對內(nèi)源^PZX:Z)的表達抑制性降低(Real-TimePCR結(jié)果支持)，使得花粉在上海長日照條件下恢復(fù)可育，在光敏感性強的品系中，這種恢復(fù)是一定程度的，而在光弱敏感和不敏感的品系中，花粉幾乎全部可育?？梢姺戳x程序性死亡基因Os尸DCD轉(zhuǎn)基因引起的花粉不育依賴于基因劑量和對內(nèi)源OyPDCD表達量抑制程度。實施例7awri-o^PDCD轉(zhuǎn)基因光周期敏感雄性不育系的其它表型一個在生產(chǎn)上可用的不育性應(yīng)該具有正常的表型。"^/-o^DCD轉(zhuǎn)基因中花ll的苗期和成株期表型是正常的，而且分蘗力更強，葉片由披散變成直立，葉色更深。此外，該轉(zhuǎn)基因品系在長日照條件下抽穗期推后25-35天，但籽粒灌漿速度與對照中花11基本一致，從抽穗到成熟約35-40天。序列表<210〉1〈211〉416〈212〉DNA<213〉水稻〈220〉<221〉CDS〈222〉(23),.(409)〈223〉〈400〉1ggccgcgggaattcgattgaagatggetgacccagagttggaagetateagg52MetAlaAspProGluLeuGluAlalieArg1510cagGin郷卿stgArgArgMetcaagagetaatgGinGluLeuMet15gca_cagcgtAlaGinArg20ggtGlygcgAlagcaAla33tAsn25ccgPro100caaaa_cactgggcaaca_￡Laaggetcaagaagatgcaaagcaggaaget148GinAsnThrGlyGinGinLysAlaGinGluAspAlaLysGinGluAla303540gagGlug犯eggeggGluArgArg45cag3tgstgcttGinMetMetLeu50getcagattAlaGinlieLeutctSer55tctSerg犯GlugetAla196卿Argg犯aggetcGluArgLeu60teccgcatagetSerArglieAla65ttggtc犯aLeuVaJLyscctPro70g已tAsp匕ysgcaAla卿Arg244gggGly75Glua_ccThrgtcValgtgVal肌gLysca_cHiscttLeug恥GlugtgValactThrggcGly125gatAsptctSerageSer110g8CAspgttcttValLeu80gaag犯GluGlu95aaaca_gCysGinctg8g3LeuArg娜cttArgLeugetAlaatelie3CgThrLysgttVal115getAlateaSer100acgThrcagtecGinSer85cttctgLeuLeuattcaglieGinggtGlygagGluaggggaGlyGincgcArg120atatctlieSer90ateaatlieAsn105egg3gCArgSer292g3tg8CAspAsptagctgcatg<210>2<211>128〈212〉PRT〈213〉水稻<400〉2MetAlaAspProGluLeuGluAlalieArgGinArgArgMetGinGlu151015LeuMetAlaGinArgGlyAlaAlaAsnProGinAsnThrGlyGinGin202530LysAlaGinGluAspAlaLysGinGluAlaGluGluArgArgGinMet354045MetLeuAlaGinlieLeuSerSerGluAlaArgGluArgLeuSerArg505560340388416lieAlaLeuValLysProAspLysAlaArgGlyValGluAspValLeu65707580LeuArgAlaAlaGinSerGlyGlylieSerGluLysValSerGluGlu859095ArgLeulieSerLeuLeuGluGinlieAsnThrHisThrSerLysGin100105110ThrLysValThrlieGinArgArgArgSerValLeuGlyAspAspAsp115120125<210>3<211>349<212>DNA<213〉人工合成<400〉3agcttgtcatcgtcgccaaggacgctccggcgcctctgaatcgtaactttcgtctgtttg60ctagtgtgggtattgatttgctccsgaagtgagataagcctttcttcagacaccttttca120gatattccaccggactgagcagctctcagaagaacatcctccacccctcttgctttatca180ggtttgaccaaagctatgcgggagagcctttctctagcttcagaagataaaatctgagca240agcatcatctgccgccgttcctcagcttcctgctttgcatcttcttgagccttttgttgc300ccagtgttttgcggatttgccgcaccacgctgtgccattagctcttgca349權(quán)利要求1、一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將水稻程序性死亡基因反向插入表達載體的多克隆位點處；(2)培養(yǎng)導入(1)所得的重組質(zhì)粒的水稻愈傷組織細胞；(3)誘導(2)所得的水稻愈傷組織細胞光照培養(yǎng)，分化出植株。2、如權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，(l)所使用的表達載體是pCAMBIA1304、pBY520或者pBin438。3、如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，(1)是將水稻程序性死亡基因反向插入pCAMBIA1304載體的35S啟動子下游。4、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，(2)使用基因槍法或者膿桿菌法將重組質(zhì)粒導入水稻愈傷組織細胞。5、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，(2)中先將導入重組質(zhì)粒的水稻愈傷組織細胞進行恢復(fù)培養(yǎng)，然后利用潮霉素進行抗性篩選。6、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，(3)中將(2)所得水稻愈傷組織細胞置于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)20-40天，分化出小植株后轉(zhuǎn)移至生根壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)。7、一種含有水稻程序性死亡基因的重組載體，其特征在于，水稻程序性死亡基因反向插入擴增載體或者表達載體的多克隆位點處。8、如權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于，所述的表達載體是pCAMBIA1304、pBY520或者pBin438。9、權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法在水稻生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于，將該方法所得的水稻用于培育雜交水稻。全文摘要本發(fā)明屬于遺傳工程和水稻培育領(lǐng)域，具體涉及一種光敏雄性不育水稻的生產(chǎn)方法。本發(fā)明創(chuàng)造性地將基因反向插入水稻表達載體，通過將該重組表達載體導入水稻愈傷組織細胞；誘導分化培養(yǎng)出一種光敏雄性不育水稻。本發(fā)明建立了一個可以隨機配組生產(chǎn)雜交水稻的系統(tǒng)，取代目前雖然在生產(chǎn)上應(yīng)用但存在許多問題的自然突變光溫敏兩用系。本發(fā)明的生產(chǎn)方法在培育雜交水稻方面，創(chuàng)建了一種可以隨機配組的制種技術(shù)，擴大優(yōu)良雜交稻組合的范圍。文檔編號A01H1/00GK101434959SQ20081020159公開日2009年5月20日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者楊金水,王玉鋒申請人:復(fù)旦大學