專利名稱：：一種黃瓜高頻率植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種黃瓜高頻率植株再生方法。
背景技術(shù)：
：黃瓜組織培養(yǎng)技術(shù)的研究起始于上個(gè)世紀(jì)七十年代(CuttsRHA.PlantSciLett,1975,4:189-193)，但真正取得有用結(jié)果的還是在近幾年(陳繼峰，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007,23:114-118)。用于黃瓜組織培養(yǎng)的外植體的種類很多，如子葉、真葉、下胚軸、葉柄、莖尖、根、合子胚等，大多研究都能得到組織培養(yǎng)小苗。盡管黃瓜組織培養(yǎng)的成功經(jīng)驗(yàn)很多，但在某些方面還存在著不少問(wèn)題。首先，黃瓜組織培養(yǎng)具有很強(qiáng)的基因型特異性，植株再生頻率低且不穩(wěn)定，技術(shù)的重復(fù)性差(候愛(ài)菊，朱延明，楊愛(ài)馥，等.園藝學(xué)報(bào)，2003,30:101-103);其次，由于黃瓜再生植株一般要經(jīng)過(guò)愈傷組織的形成、不定芽分化、莖芽伸長(zhǎng)和生根幾個(gè)過(guò)程，因而己有的黃瓜植株再生體系，操作技術(shù)繁瑣，植株再生周期長(zhǎng)(KuijpersAM,BoumanH,KlerkGJ.PlantCellTissOrgCult,1996,1:81-83);第三，多數(shù)研究者傾向通過(guò)體細(xì)胞胚途徑獲得黃瓜再生植株，但體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化成正常植株的頻率低，且無(wú)性系變異大，不利于培育遺傳穩(wěn)定、一致的再生植株(LouH，KakoS.HortiScience,29:906-909)。這些不利因素在一定程度上限制了黃瓜生物工程育種的進(jìn)展。隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，植株快速克隆技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將在黃瓜生物技術(shù)育種中得到廣泛應(yīng)用，這就需要建立一種操作簡(jiǎn)便、周期短、技術(shù)穩(wěn)定的高效植株再生體系，但目前的黃瓜離體再生技術(shù)體系，并不能完全滿足當(dāng)前黃瓜生物技術(shù)研究的需要。因此，建立一種頻率高、周期短、技術(shù)穩(wěn)定，且適用于多個(gè)基因型的離體植株再生體系，是當(dāng)前黃瓜組織培養(yǎng)研究的關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜高頻率植株再生的方法，以滿足黃瓜生物工程育種研究的需要。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種黃瓜高頻率植株再生方法，由下述步驟組成a、選取黃瓜飽滿、無(wú)病蟲(chóng)的種子，用0.1%氯化滎表面消毒，并接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗，選取粗壯的幼苗切除一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)，制備Flamingo-bill外植體；b、將Flamingo-bill外植體接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，使其誘導(dǎo)出不定芽；c、將外植體連同不定芽轉(zhuǎn)入增值培養(yǎng)基，使不定芽的數(shù)量擴(kuò)大3倍，同時(shí)不定芽得以伸長(zhǎng)；d、當(dāng)芽長(zhǎng)到12cm時(shí)從基部切離外植體，接種到生根培養(yǎng)基，使其生根長(zhǎng)成完整植株；e、將具有完整根系的植株移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，使其在自然條件下生長(zhǎng)。在步驟a中，0.1%氯化汞浸泡種子的時(shí)間為810min，消毒后用無(wú)菌水沖洗45次，并用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分。在步驟a中，用于Flamingo-bill外植體制備的幼苗苗齡為23d，苗高34cm，下胚軸直徑35mm。在步驟a中，采用無(wú)菌手術(shù)刀片由上至下將一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)切除，切口深度為下胚軸直徑的1/2，切口斜面長(zhǎng)度為0.4~0.5cm。在步驟b中，外植體接種方式是將其根部斜插入培養(yǎng)基中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基附加0.51.0mg/L6-BA(6-節(jié)基腺嘌呤)、0.51.0mg/LAgN03和30g/LSuc(蔗糖)。在步驟c中，芽增值培養(yǎng)基為附加1.0-1.5mg/L6-BA、0.51.0mg/LAgN03和30g/LSue的MS培養(yǎng)基。在步驟d中，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基附加20g/LSuc。MS培養(yǎng)基瓊脂用量為0.7%，培養(yǎng)基滅菌方式為在12rC下滅菌18min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。所述培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光照強(qiáng)度為50pmoHn《s—、光周期為1214h/d。本發(fā)明所用的Flamingo-bill外植體為一種多組織成分的特殊外植體，它由子葉、下胚軸和根三部分組成，實(shí)際上就是去掉了一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)的植株，其切口部位，即組織培養(yǎng)植株再生部位，為頂端分生組織所在區(qū)域，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度快、分化能力強(qiáng)，本發(fā)明所得到的再生植株就是由這些細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的。Flamingo-bill外植體具有完整植株的特性，其接種方式相當(dāng)于"移栽"，這樣根就可以發(fā)揮物質(zhì)吸收功能，通過(guò)下胚軸把激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送至頂端分生組織細(xì)胞，促使這些細(xì)胞快速生長(zhǎng)、分化成苗。Flamingo-bill外植體這種吸收外源物質(zhì)的方式優(yōu)越于一般外植體的被動(dòng)吸收。本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)1.整個(gè)組織培養(yǎng)過(guò)程只使用了一種植物激素，即6-BA，且濃度較低，即在01.5mg/L之間，不容易誘導(dǎo)體細(xì)胞無(wú)性系產(chǎn)生，且節(jié)約了技術(shù)成本2.植株再生過(guò)程只包括Flamingo-bill外植體的制備、不定芽的誘導(dǎo)和增值、生根、移栽4個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，且操作簡(jiǎn)單，提高了生產(chǎn)效率。3.—個(gè)Flamingo-bill外植體初代培養(yǎng)可產(chǎn)生35個(gè)再生植株，如果再繼代培養(yǎng)一次，又可再生510個(gè)植株，植株再生頻率略高于一般外植體。4.Flamingo-bill外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1015d可誘導(dǎo)出不定芽，3540d后可伸長(zhǎng)到合適高度，在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)57d可再生不定根，形成完整植株。從接種到完整植株形成只需要大約45d，大大縮短了植株再生的時(shí)間。圖1為第一片真葉剛露出的黃瓜幼苗的形狀示意圖2為Flamingo-bill外植體的形狀示意圖3為Flamingo-bill外植體斜切面長(zhǎng)出不定芽的形狀示意圖4為不定芽增值并伸長(zhǎng)的形狀示意圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:本發(fā)明的高頻率黃瓜再生植株的方法，其步驟如下a.以自交系'IL69，為試驗(yàn)材料。自交系'IL69，是從津雜2號(hào)自交后代分離得到，具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、高抗霜霉病、果型長(zhǎng)、有棱等特征。選取無(wú)病蟲(chóng)、飽滿的黃瓜自交系'IL69，種子，用0.1%氯化汞表面消毒8min，消毒后用無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分后，接種到MS培養(yǎng)基，置于26。C恒溫箱培養(yǎng)成苗。MS培養(yǎng)基瓊脂用量為0.7%，培養(yǎng)基滅菌方式為在12rC下滅菌18min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。選取粗壯、剛露出真葉的幼苗，幼苗苗齡為2d，苗高3cm，下胚軸直徑3mm，如圖1所示，用無(wú)菌的手術(shù)刀片從上至下切除一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)，切口深度為下胚軸直徑的1/2，切口斜面長(zhǎng)度為0.5cm，使余下的部分保持完好，即Flamingo-bill外植體，如圖2所示。b.制備好的Flamingo-bill外植體迅速以根部斜插入的方式接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，在26°C、光強(qiáng)50pmobm—V、光周期14h/d條件下培養(yǎng)。lld在外植體斜切面后發(fā)現(xiàn)第一例不定芽，如圖3所示。12d后換一次新鮮培養(yǎng)基，18d后不定芽數(shù)量達(dá)到4個(gè)。c.將外植體連同不定芽從芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中移出，保護(hù)好其根部以免根折斷，再斜插入到芽增值培養(yǎng)基中，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3+30g/LSuc，在25。C、光強(qiáng)50pmol'm^s-1，光周期14h/d條件下培養(yǎng)。并使根部完全在培養(yǎng)基中，調(diào)整外植體的位置以盡量使再生的芽向上生長(zhǎng)。10d后單個(gè)外植體產(chǎn)生芽的數(shù)量達(dá)到約10個(gè)，長(zhǎng)度約1.5cm，如圖4所示。在本步驟中，芽培養(yǎng)到第10d時(shí)，統(tǒng)計(jì)芽長(zhǎng)度和增值率，其中，增值率=芽總數(shù)/外植體總數(shù)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表l。d.當(dāng)芽苗伸長(zhǎng)至2cm時(shí)，用刀將其從基部切下，接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/2MS+20g/LSuc。溫度和光照條件和步驟c一致。5d后芽基部開(kāi)始部分愈傷組織化，7d后大部分植株有白色不定根生成，13d后，絕大部分植株己長(zhǎng)成完整植株。在本步驟中，統(tǒng)計(jì)15d后植株的生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)，其中，生根率=生根株數(shù)/接種的株數(shù)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表l。e.將已生根的植株從培養(yǎng)基中移出，在自來(lái)水下洗去粘附在根上的瓊脂后，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，營(yíng)養(yǎng)土的配方為體積比為1:1的珍珠巖和泥炭土的混合基質(zhì)，使其在自然陰涼處生長(zhǎng)，并將底部鑿有4個(gè)小孔的透明塑料杯倒扣在苗上，以保證一定的濕度，2d后去掉塑料杯。根據(jù)基質(zhì)墑情，每天澆水12次。在本步驟中統(tǒng)計(jì)再生植株的成活率，成活率=成活的株數(shù)/移栽的總株數(shù)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。實(shí)施例2:在本實(shí)施例中，黃瓜材料為自交系'IL69'，取材幼苗苗齡為3d，苗高4cm，下胚軸直徑5mm。培養(yǎng)溫度為24i:、光強(qiáng)50pmoHn—、—1，光周期12h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.6mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例l相同。實(shí)施例3:在本實(shí)施例中，黃瓜材料為自交系'IL69'，取材幼苗苗齡為2d，苗高3.5cm，下胚軸直徑4mm。培養(yǎng)溫度為25。C、光強(qiáng)50^imoHn^s-1，光周期13h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.2mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例1相同。表1實(shí)施例1~3的植株再生情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4:以黃瓜自交系'IL103'為材料，自交系'IL103'是從津春4號(hào)自交后代分離得到，具有生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)、高抗霜霉病、果型中等、無(wú)棱、刺密等特征。取苗齡為2d、苗高3cm、下胚軸直徑4mm幼苗為材料。培養(yǎng)溫度為25X:、光強(qiáng)50^imol'm-2.s"，光周期12h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例1相同。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)施例5:試驗(yàn)材料為'IL103'。幼苗苗齡為3d，苗高4cm，下胚軸直徑5mm。培養(yǎng)溫度為24。C、光強(qiáng)50pmoHr^s"，光周期13h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例1相同。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)施例6:試驗(yàn)材料為'IL103'。幼苗苗齡為2.5d，苗高3.5cm，下胚軸直徑4.5mm。培養(yǎng)溫度為26。C、光強(qiáng)50fimolTn—2^，光周期14h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.8mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSue,芽增值培養(yǎng)基為MS+1.2mg/L6-BA+0.6mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例1相同。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2實(shí)施例4~6的植株再生情況芽誘導(dǎo)激素芽增值激素芽長(zhǎng)度增值生根平均根平均移栽成實(shí)施例6-BA6-BA(cm)率率％K:(cm)根數(shù)活率％41.0mg/L1.5mg/L1.27.8951.84.3900.5mg/L1.0mg/L1.48.31002.14.710060.8mg/L1.2mg/L1.57.5951.73.5100實(shí)施例7:以黃瓜材料為自交系'IL67'為試驗(yàn)材料，自交系'IL67'是從園豐園6號(hào)自交后代分離得到，具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、生育期長(zhǎng)、高抗霜霉病、果型短、無(wú)棱等特征。取苗齡為2d、苗高3cm、下胚軸直徑4mm的幼苗為材料。培養(yǎng)溫度為25°C、光強(qiáng)50pmol'm—2's—1，光周期12h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例1相同。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)施例8:試驗(yàn)材料為'IL67，。幼苗苗齡為3d，苗高4cm,下胚軸直徑5mm。培養(yǎng)溫度為24°C、光強(qiáng)50pmoLm—V1,光周期13h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LAgNO3+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例1相同。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)施例9:試驗(yàn)材料為'IL67'。取材幼苗苗齡為2.5d，苗高3.6cm，下胚軸直徑4.3mm。培養(yǎng)溫度為26。C、光強(qiáng)50pmoHn—V1，光周期14h/d。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.8mg/L6-BA+0.8mg/LAgN03+30g/LSuc，芽增值培養(yǎng)基為MS+1.2mg/L6-BA+0.8mg/LAgN03+30g/LSuc。組織培養(yǎng)操作程序與方法與實(shí)施例l相同。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3實(shí)施例7~9的植株再生情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種黃瓜高頻率植株再生方法，其特征在于由下述步驟組成a、選取黃瓜飽滿、無(wú)病蟲(chóng)的種子，用0.1％氯化汞表面消毒，并接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗，選取粗壯的幼苗切除一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)，制備Flamingo-bill外植體；b、將Flamingo-bill外植體接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，使其誘導(dǎo)出不定芽；c、將外植體連同不定芽轉(zhuǎn)入增值培養(yǎng)基，使不定芽的數(shù)量擴(kuò)大3倍，同時(shí)不定芽得以伸長(zhǎng)；d、當(dāng)芽長(zhǎng)到1～2cm時(shí)從基部切離外植體，接種到生根培養(yǎng)基，使其生根長(zhǎng)成完整植株；e、將具有完整根系的植株移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，使其在自然條件下生長(zhǎng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a中，0.1%氯化汞浸泡種子的時(shí)間為810min，消毒后用無(wú)菌水沖洗45次，并用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟a中，用于Flamingo-bill外植體制備的幼苗苗齡為23d，苗高34cm，下胚軸直徑35mm。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在步驟a中，采用無(wú)菌手術(shù)刀片由上至下將一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)切除，切口深度為下胚軸直徑的1/2，切口斜面長(zhǎng)度為0.40.5cm。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟b中，外植體接種方式是將其根部斜插入培養(yǎng)基中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基附加0.5~1.0mg/L6-BA(6-節(jié)基腺嘌呤)、0.51.0mg/LAgNO3和30g/LSuc(蔗糖)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟c中，芽增值培養(yǎng)基為附加1.0~1.5mg/L6-BA、0.51.0mg/LAgN03和30g/LSue的MS培養(yǎng)基。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟d中，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基附加20g/LSuc。8、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于MS培養(yǎng)基瓊脂用量為0.7%，培養(yǎng)基滅菌方式為在12rC下滅菌18min，培養(yǎng)基的pH值為5.8。9、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為溫度25士rC，光照強(qiáng)度為50,ohn-V1，光周期為12~14h/d。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種黃瓜高頻率植株再生方法，由Flamingo-bill外植體的制備、不定芽的誘導(dǎo)和增值、生根、移栽等步驟組成。本發(fā)明在整個(gè)組織培養(yǎng)過(guò)程只使用了一種植物激素，且濃度較低，不容易誘導(dǎo)體細(xì)胞無(wú)性系產(chǎn)生，且節(jié)約了技術(shù)成本；技術(shù)環(huán)節(jié)少，且操作簡(jiǎn)單，提高了生產(chǎn)效率；從接種到完整植株形成只需要大約45d，大大縮短了植株再生的時(shí)間。文檔編號(hào)A01H4/00GK101449658SQ20071019307公開(kāi)日2009年6月10日申請(qǐng)日期2007年12月6日優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日發(fā)明者周秀艷,李建吾,秦智偉,胡建斌申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)