專利名稱：：假儉草側(cè)芽誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種假儉草側(cè)芽誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生技術(shù)，屬于植物組織培養(yǎng)范疇，適用于假儉草微繁、體細(xì)胞培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化受體材料的培養(yǎng)技術(shù)。二
背景技術(shù)：
：假儉草(Are/i70c力7oa叩/L'"rw'As(Munro.)Hack.)是禾本科蜈蚣草屬多年生草本植物，也是蜈蚣草屬中唯一可用作草坪草的物種(Boutonetal,1983;Hanna，1995)。它具有強(qiáng)壯的匍匐莖，蔓延力強(qiáng)而迅速，稈斜升，其葉形優(yōu)美,植株低矮，養(yǎng)護(hù)水平低,耐貧瘠，病蟲害少，可廣泛地用于庭院草坪、休憩草坪以及水土保持草坪建設(shè)中(Hansonetal.,1969;Beard'1973)。采用常規(guī)雜交技術(shù)選育新品種，不僅周期長(zhǎng)，工作量大，而且由于受育種材料自身變異的限制，改良幅度有限。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)日趨成熟，可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行人工定向突變體篩選或在分子水平上把目的基因直接導(dǎo)入材料，提高育種效率。開展植物體細(xì)胞突變體篩選和轉(zhuǎn)基因工作的基礎(chǔ)條件之一，是建立高效的植株再生體系。迄今為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)假儉草組織培養(yǎng)獲得再生植株的報(bào)道僅有3篇，都是以假儉草的成熟種子和幼穗為外植體材料，通過愈傷組織的誘導(dǎo)和分化獲得再生植株。Krans等(1985)以成熟種子和幼穗為材料，研究了假儉草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生；馬生健等(2004)和Yoshikazu等(2004)分別以簡(jiǎn)報(bào)和摘要的形式，報(bào)道了以假儉草的種子為材料建立了再生體系。至今尚未見到以假儉草的側(cè)芽為外植體材料建立植株再生體系的報(bào)道。由于草坪草用質(zhì)量越高，通常種子產(chǎn)量越低，草坪草通常為常異花授粉植物，種子異質(zhì)性高，難以作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化工作，而豐富的側(cè)芽是暖季型草坪草重要的形態(tài)特征之一，因此，以側(cè)芽為外植體對(duì)于假儉草等暖季型草評(píng)草再生體系建立、種質(zhì)改良以及新品種產(chǎn)業(yè)化具有獨(dú)特的重要的意義。三、
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明提出的技術(shù)任務(wù)和要解決的技術(shù)問題是要克服現(xiàn)有假儉草離體培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的半透明、濕潤(rùn)、粘性胚性愈傷組織，此類愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中喪失綠苗分化的能力，以及種子異質(zhì)性較高，不宜于用于微繁殖、體細(xì)胞突變體篩選和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化等缺陷。以假儉草豐富的側(cè)芽為外植體材料，通過外源激素調(diào)控獲得顆粒狀愈傷組織，建立起適用于微繁殖、體細(xì)胞突變體篩選和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的植株再生技術(shù)體系。技術(shù)方案假儉草側(cè)芽愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，其特征在于，1)材料選用假儉草帶有側(cè)芽的莖段為外植體材料；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為由MS的大量元素、微量元素和維生素組成的MS培養(yǎng)基，附加蔗糖30g/L，瓊脂7.5g/L;側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基中添加激素BAP2.0mg/L、NAA0.8mg/L;愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基中添加激素2，4-D1.0mg/L、BAP0.1mg/L;綠苗分化培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基中添加激動(dòng)素KT2.0mg/L;試管苗生根培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素NAA0.6mg/L;培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至6.5;3)培養(yǎng)方法田間選取無病蟲害、健壯的嫩莖，去除葉鞘和葉片，經(jīng)沖洗干凈后剪成帶有側(cè)芽約2cm長(zhǎng)的段塊，用0.2%洗衣粉浸泡20min，流水沖洗1h，在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡50s，0.2%升汞消毒15min，再用無菌水沖洗4-5次。經(jīng)表面消毒的莖段先接種到側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，側(cè)芽在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷組織，第28天時(shí)從中選擇黃色、緊密、顆粒狀愈傷組織進(jìn)行繼代增殖，愈傷組織繼代培養(yǎng)2次，然后綠苗分化培養(yǎng)基上，4-5周后再生植株轉(zhuǎn)到試管苗生根培養(yǎng)基中，再生植株在試管苗生根培養(yǎng)基中生根，2周后試管植株移栽到盆缽和田間；在離體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)室溫度為25土rc，愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)在散射光下進(jìn)行，綠苗分化、生長(zhǎng)和生根培養(yǎng)在光照條件下進(jìn)行。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果以側(cè)芽為外植體材料，通過外源激素調(diào)控獲得顆粒狀愈傷組織，建立起植株再生技術(shù)體系。顆粒狀愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中能保持植株再生的能力，適用于微繁殖、體細(xì)胞突變體篩選和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上開展了耐寒體細(xì)胞突變體篩選和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化研究工作，己獲得體細(xì)胞突變體和轉(zhuǎn)基因試管植株。本發(fā)明適用于假儉草微繁、體細(xì)胞培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化。考慮到(1)草坪草坪用質(zhì)量高，通常種子產(chǎn)量越低，甚至種子產(chǎn)量為O，(2)草坪草通常為常異花授粉植物，種子異質(zhì)性高，難以作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化工作，(3)豐富的側(cè)芽是暖季型草坪草重要的形態(tài)特征之一，所以，以側(cè)芽為外植體對(duì)于草坪草再生體系建立、暖季型草坪草改良以及新品種產(chǎn)業(yè)化具有獨(dú)特的重要的應(yīng)用價(jià)值。四圖1從側(cè)芽誘導(dǎo)愈傷組織圖2顆粒狀愈傷組織圖3分化綠苗圖4試管苗圖5試管苗生根圖6移栽植株五具體實(shí)施例方式1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料取帶有側(cè)芽的假儉草莖段為外植體材料。1.2培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS的大量元素、微量元素和維生素組成，添加葡萄糖30g/L，固化劑一瓊脂7.5g/L。MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中最為常用的培養(yǎng)基(MurashigeT，SkoogF.Arevisedmediumfromrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissueculture[J.Physiol,plant,1962,15:473497);側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基添加激素BAP(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)2.0mg/L、NAA(南京生興生物技術(shù)有限公司)0.8mg/L;愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加激素2，4-D(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)1.0mg/L、BAPO.lmg/L;綠苗分化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加激動(dòng)素KT(南京生興生物技術(shù)有限公司)2.0mg/L;試管苗生根培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素NAA(南京生興生物技術(shù)有限公司)0.6mg/L;培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鉀和鹽酸調(diào)整pH值至6.5;1.3培養(yǎng)方法田間選取無病蟲害、健壯的嫩莖，去除葉鞘和葉片，經(jīng)沖洗干凈后剪成帶有側(cè)芽約2cm長(zhǎng)的段塊，用0.2%洗衣粉浸泡201^11，流水沖洗1h，在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡50s，0.2%升汞消毒15min，再用無菌水沖洗4-5次。經(jīng)表面消毒的莖段先接種到側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，10-14d側(cè)芽在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷組織，第28d時(shí)從中選擇黃色、緊密、顆粒狀愈傷組織進(jìn)行繼代增殖，然后轉(zhuǎn)到綠苗分化培養(yǎng)基上再生植株，試管植株生根后移栽到盆缽和田間。在離體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)室溫度為25土rc，愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)在散射光下進(jìn)行，綠苗分化、生長(zhǎng)和生根培養(yǎng)在光照條件下進(jìn)行。2.結(jié)果2.1BAP和NAA對(duì)側(cè)芽生長(zhǎng)的影響側(cè)芽接種到側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，5-6d后開始長(zhǎng)出新葉，15-18d時(shí)側(cè)芽長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期。促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基附加BAP2.0mg/L、NAA0.8mg/L。2.22,4-D和BAP對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和繼代增殖的影響2，4-D和BAP不同濃度的組合對(duì)側(cè)芽誘導(dǎo)愈傷組織有明顯的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示在基本培養(yǎng)基上附加2，4-D0.5~1.0mg/L和BAP0~0.5mg/L，側(cè)芽能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；2，4-D的濃度達(dá)到或超過2.0mg/L時(shí)，未能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織(表l)。在基本培養(yǎng)基附加2，4-D1.0mg/L和BAP0.1mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，12d左右從側(cè)芽的基部誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，其中黃色、致密狀愈傷組織占40%以上，后愈傷組織覆蓋側(cè)芽的基部(圖1)。在基本培養(yǎng)基附加2，4-D1.0mg/L和BAP0.1mg/L的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，黃色、致密愈傷組織大量快速增殖。試驗(yàn)中觀察到莖段的截面、節(jié)、節(jié)間和葉片都未能誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。表l.2，4-D和BAP濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響<table>compelxtableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.3KT和BAP對(duì)愈傷組織分化的影響B(tài)AP濃度在0.5~3.0mg/L之間，愈傷組織未能分化出綠苗。KT2.0mg/L顯著促進(jìn)顆粒狀愈傷組織的增殖，綠苗分化率達(dá)到12.6%，平均每塊愈傷組織產(chǎn)生3.6個(gè)綠芽。KT2.0mg/L的效果顯著好于KT3.0mg/L(表2)。BAP2.0mg/L和NAA0.8mg/L組合有利于顆粒狀愈傷組織分化綠苗和叢生芽的增殖。胚性愈傷組織接種在含有BAP2.0mg/L和NAA0.8mg/L的基本培養(yǎng)基上，2周后小芽伸長(zhǎng)1~1.5cm，4-5周后小芽長(zhǎng)大，通過繼代分化培養(yǎng)可大量增殖綠芽(圖4)。在本試驗(yàn)中愈傷組織繼代培養(yǎng)2次仍可保持植株再生的能力。表2KT和BAP對(duì)愈傷組織分化的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.4試管苗生根和移栽在不附加NAA的對(duì)照生根培養(yǎng)基上試管苗的生根率也達(dá)到96%以上，但是根的質(zhì)量與附加NAA的有顯著的差別。NAA濃度為0.6mg/L時(shí)，試管苗的根數(shù)和根粗均明顯高于對(duì)照，也高于NAA濃度為0.3mg/L和0.9mg/L的相對(duì)應(yīng)值。附加NAA0.6mg/L的培養(yǎng)基為試管苗最佳生根培養(yǎng)基，第6d試管苗開始生根，2周后平均每株生根7.8，根長(zhǎng)0.6cm，根的直徑2.0mm(表3，圖5)試管生根苗先移栽到營(yíng)養(yǎng)缽，2周后再移栽到土盆(圖6)，移栽存活率達(dá)到94%。表3NAA濃度對(duì)試管苗生根和根系發(fā)育的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、假儉草側(cè)芽誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生方法，其特征在于，1)材料選用假儉草帶有側(cè)芽的莖段為外植體材料；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS的大量元素、微量元素和維生素組成，附加蔗糖30g/L，瓊脂7.5g/L；側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加激素BAP2.0mg/L、NAA0.8mg/L；愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加激素2，4-D1.0mg/L、BAP0.1mg/L；綠苗分化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加激動(dòng)素KT2.0mg/L；試管苗生根培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素NAA0.6mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至6.5；3)培養(yǎng)方法田間選取假儉草的嫩莖，去除葉鞘和葉片，經(jīng)沖洗干凈后剪成帶有側(cè)芽2cm長(zhǎng)的段塊，用質(zhì)量比0.2％的洗衣粉浸泡20min，流水沖洗1h，在超凈工作臺(tái)上用75％的乙醇浸泡50s，0.2％升汞消毒15min，再用無菌水沖洗4-5次；經(jīng)表面消毒的莖段先接種到側(cè)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，側(cè)芽在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷組織，第28天時(shí)從中選擇黃色、緊密、顆粒狀愈傷組織進(jìn)行繼代增殖，愈傷組織繼代培養(yǎng)2次，然后移到綠苗分化培養(yǎng)基上，4-5周后再生植株轉(zhuǎn)到試管苗生根培養(yǎng)基中，再生植株在試管苗生根培養(yǎng)基中生根，2周后試管植株移栽到盆缽和田間；在離體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)室溫度為25±1℃，愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)在散射光下進(jìn)行，綠苗分化、生長(zhǎng)和生根培養(yǎng)在光照條件下進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明涉及一種假儉草側(cè)芽誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
。以假儉草的側(cè)芽為外植體材料，接種在附加2，4-D-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、BAP-6-芐基氨基嘌呤0.1mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導(dǎo)頻率達(dá)90％以上。繼代培養(yǎng)2次后轉(zhuǎn)到附加KT-激動(dòng)素2.0mg/L的綠苗分化培養(yǎng)基上，綠苗分化率在12％以上。以側(cè)芽為外植體材料，獲得的黃色、緊密、顆粒狀愈傷組織適用于假儉草微繁、體細(xì)胞培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化。草坪草坪用質(zhì)量高，通常種子產(chǎn)量越低，以側(cè)芽為外植體對(duì)于草坪草再生體系建立、暖季型草坪草改良以及新品種產(chǎn)業(yè)化具有獨(dú)特的重要的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A01H4/00GK101194595SQ20071019131公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月18日優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日發(fā)明者佘建明,劉建秀,袁學(xué)軍申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所