專利名稱：一種奶牛再克隆的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于胚胎生物工程領域，特別是一種奶牛再克隆的方法。
背景技術：
克隆綿羊Dolly的誕生，動物克隆從此進入體細胞克隆時代。緊隨Dolly羊之后，許多實驗室開展體細胞克隆研究，各種克隆動物相繼問世(Baguisi，1999；Wakayama，1998；Kao，1998；Onishi，2000；Shin，2002；Chense，2002；Galli，2003；Woods，2003)。通過體細胞克隆技術，人們可以獲得無數(shù)同質個體，克服了胚胎細胞克隆只能達到有限個體的缺點。目前該技術除了在動物保種繁衍方面的應用之外，已在轉基因方面、胚胎干細胞方面得到了應用，已顯示出誘人的應用前景。
體細胞克隆技術是動物保種重要方法之一。通過體細胞克隆技術進行保種，可以把一個動物的體細胞變成一只動物。如果要保存一個物種，就可以先擬定出保持遺傳穩(wěn)定性的動物個體數(shù)，然后在每一頭動物身上采集成千上萬細胞，進行永久性保存，若需重現(xiàn)一個動物物種或品種時，只需進行同種或異種克隆，就可以獲得這種動物。一個動物的體細胞可以保存在一個小管內，一個品種或一個物種就可以保存在一個小盒內，我國的動物物種也許可以裝在一間大房里，這樣就可以建立一個名副其實的基因庫。Comizzoli等(2000)認為體細胞核移植也為拯救珍稀瀕危動物開辟了一條新的途徑。1998年新西蘭的Wells等(1999)利用這一技術成功地克隆了當?shù)匾活^瀕臨滅種土種牛2000年美國的Lanza等(2000)通過種間核移植的方法用家牛的卵母細胞獲得了種間核移植胚胎，移植到家牛后獲得了妊娠并生出了后代；1999我國陳大元等用兔卵母細胞獲得了種間核移植的大熊貓胚胎，這些結果表明通過體細胞核移植方法增加瀕危動物的數(shù)量是可行的，通過種間核移植方法保護珍稀動物可能在不久的將來會有突破性的進展。
體細胞克隆技術還處于研究階段，體細胞克隆還存在一些問題1)結果不穩(wěn)定，效率低 目前，克隆綿羊只有3％左右的重組胚能發(fā)育為正常后代。在克隆牛的研究過程中，根據(jù)kato等的結果，重組胚的囊胚發(fā)育率最高能達到49％，約有80％的移植胚能發(fā)育為正常胎兒，但胎兒出生后的死亡率達到50％。Cibelli等在克隆牛的生產(chǎn)過程中，重組胚的囊胚率僅為17％，移植后只有14％的囊胚發(fā)育正常后代。克隆小鼠僅在夏威夷大學醫(yī)學院獲得成功，只有2％-3％的重構胚能發(fā)育產(chǎn)仔，仔鼠死亡率也高達40％o以上結果表明體細胞克隆技術僅處于初步研究階段，還需要在其他動物上進一步研究，提高生產(chǎn)效率。
2)后代死亡率高 胎兒出生后的高死亡率也是體細胞克隆面臨的問題之一，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因還不清楚。目前只能從優(yōu)化培養(yǎng)條件及操作程序入手以減少胎兒死亡率。
3)用其它體細胞作供體的探索 目前，用于體細胞克隆的供體細胞種類很有限，其它細胞通過核移植能否成功有待進一步探討。
4)細胞質遺傳問題在小鼠和牛的克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)細胞質的遺傳物質影響克隆后代的表型，如花斑、毛色等，這是由供體細胞線粒體DNA，還是由卵子細胞質中的遺傳物質引起還不清楚。細胞質中的遺傳物質對克隆后代的其它性狀是否產(chǎn)生影響還需要進一步探討.隨著克隆技術的發(fā)展，細胞質中遺傳物質的作用會越來越引起人們的重視。
5)供體細胞的保存和細胞周期的影響 體細胞克隆的最大優(yōu)勢之一是供體細胞可培養(yǎng)傳代及冷凍保存。但在傳代及冷凍過程中，細胞核中遺傳物質的損傷及變異勢必影響克隆胚胎的發(fā)育。同時，供體細胞周期直接影響克隆效率，但對這些問題目前知之甚少，急需加以研究。
用克隆動物的體細胞再次進行克隆，稱為再克隆。在理論上，通過克隆和再克隆，可獲得無限多的克隆動物。再克隆技術與克隆技術基本原理是一致的，但再克隆技術進一步放大克隆效果，延伸克隆的內涵，進行再克隆研究將有助于解決上述問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對上述領域中的缺陷，提供一種奶牛的再克隆方法，使克隆效果再次放大，是提高克隆效率的有效方法之一。
一種奶牛的再克隆方法，包括供體細胞和受體卵母細胞培養(yǎng)，核移植、融合與激活，重構胚的培養(yǎng)和重構胚移植，其特征在于所述受體細胞的培養(yǎng)液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/ml EGF(Epidermal GrowthFactor)；供體細胞的培養(yǎng)液中添加有1LDMEM(干粉)+2.75g NaHCO3+10％FCS+1mmol/LNa-Pyruvate+1mmol/ml L-Glutamine+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.1mmol/Lβ-Mercaptoethanol+10ng/ml EGF。
所述重構胚的培養(yǎng)采用分三階段培養(yǎng)，所述第一階段的培養(yǎng)液為CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin，培育時間0-2天；所述第二階段的培養(yǎng)液第一階段培養(yǎng)液和單層顆粒細胞，培育時間2-5天；第三階段的培養(yǎng)液第二階段培養(yǎng)液加入葡萄糖，其濃度為1mg/ml，培養(yǎng)時間5-9天。
所述激活采用A23187、CHX和CD聯(lián)合激活，激活時間在卵母細胞成熟后25小時進行激活處理。
所述激活處理分三步進行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA，在38.5℃處理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX+3μg/ml CD處理1小時；3.在含10μg/ml CHX的CR1-aa中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
所述重構胚移植到比它晚一天發(fā)情受體牛的子宮內。
本發(fā)明一種奶牛的再克隆方法，供體核是第一代克隆牛的體細胞。再克隆技術的步驟與克隆技術的步驟相同，本發(fā)明為提高克隆效率，首先優(yōu)化了供體細胞和受體細胞的培養(yǎng)條件，添加了一些有效成分，如Cysteine、L-Glutamine、EGF(Epidermal Growth Factor)和β-Mercaptoethanol等。這些成分都能促進細胞生長發(fā)育，可提高細胞質成熟度，增強細胞活力，進而增強重構胚的生命力，有助于提高克隆胚胎妊娠率，降低胎兒的出生死亡率。這些有效成分對細胞具體作用如下Cysteine是構成GSH(谷胱苷肽)的重要成分，GSH可通過氧化-還原作用使卵母細胞免受氧化損失，同時可以清除卵母細胞內的自由基，提高卵母細胞整體發(fā)育水平。GSH的代謝途徑使胞質成熟過程的重要組成部分，不但能促進卵母細胞成熟，對早期胚胎發(fā)育也有促進作用。
添加L-Glutamine能促進各種氨基酸進入細胞膜，它所含的氨基是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，也是能量和碳的來源，可見卵母細胞需要L-Glutamine賴以合成核酸和蛋白質，促進胚胎生長和分裂。
EGF是一種多肽的生長因子。可以大大改善細胞發(fā)育環(huán)境，促進細胞的核、質成熟。
β-Mercaptoethanol也能促進細胞內GSH的合成，提高細胞發(fā)育潛力和耐受力，防止細胞氧化凋亡。
針對重構胚在不同發(fā)育階段對營養(yǎng)需要以及自身特點，采用分階段培養(yǎng)方法來調整其培養(yǎng)液營養(yǎng)成分，這樣更有利于重構胚的生長發(fā)育，同時可提高囊胚的發(fā)育率。在第二階段加入顆粒細胞共培養(yǎng)。與顆粒細胞共培養(yǎng)有助于克服胚胎體外發(fā)育阻斷，因為顆粒細胞能分泌多肽和糖蛋白，起著促有絲分裂刺激因子作用，促進胚胎分裂活動，有效地克服牛胚胎8-16細胞的阻滯，所以在培養(yǎng)后第2天進行了共培養(yǎng)。隨著胚胎發(fā)育，后期代謝越來越旺盛，需要更多能量，葡萄糖是最易被胚胎吸收的能量物質，添加葡萄糖能及時補充胚胎發(fā)育所需能量。所以在第三階段的培養(yǎng)液是在第二階段的基礎上再添加葡萄糖。
本發(fā)明采用A23187、CHX和CD聯(lián)合激活，激活時間為卵母細胞成熟后25小時(卵母細胞開始成熟為0小時)，多數(shù)文獻記載的第一次克隆激活時間采用24小時，本發(fā)明激活延遲1小時，這樣增加供體核暴露在受體卵母胞質的時間，可以使供核與胞質充分相互作用，有助于修正第一次克隆造成核編程的錯誤，所以激活比第一次克隆推遲1小時。
由于再克隆胚胎體外生長發(fā)育動力學與自然懷孕母牛胚胎的不一致，往往表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，為了使受體子宮內膜的發(fā)育與供體克隆胚胎發(fā)育時期相適應，同時給移植到子宮內再克隆胚胎一段恢復時間，選用比供體胚胎晚一些發(fā)情受體牛，二者方能同步正常發(fā)育。經(jīng)過實驗證明，再克隆7天的囊胚移入發(fā)情6天的受體牛子宮內更為合適。
本發(fā)明得到282個重構胚，發(fā)育得到76個囊胚，移植28個囊胚，發(fā)育得到2頭再克隆奶牛，出生的再克隆牛外表和各項生理指標都正常，經(jīng)DNA微衛(wèi)星分析結果表明，兩頭再克隆奶?；蛐团c克隆奶牛的完全相同。
總之，按照本發(fā)明的奶牛再克隆方法，成功獲得再克隆個體，出生死亡率為零，產(chǎn)犢率與第一次克隆基本一致，從整個操作程序來看，本方法應該同樣適用奶牛的第一次克隆。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
實施例11.主要儀器設備、藥品顯微操作儀、電融儀、拉針和磨針儀、CO2培養(yǎng)箱、恒溫臺、視體顯微鏡、水浴鍋、恒溫箱、超凈臺。
所涉及的到的藥品及試劑均為市售產(chǎn)品。
2.牛群根據(jù)實驗的要求，建立一個受體牛群，出生一頭克隆牛約需20頭受體牛。
3.供體細胞的準備從克隆的荷斯坦奶牛牛耳部剪下一小塊組織后，用裝有0.9％生理鹽水的保溫瓶帶回實驗室。在超凈臺內剪下的耳組織，洗滌3次，剪碎、去軟骨，加適量0.25％的胰酶混勻后轉移到培養(yǎng)瓶中4℃冷消化，18-20小時后在37℃熱消化40分鐘，消化好后，加入培養(yǎng)液1L DMEM(干粉)+2.75g NaHCO3+10％FCS(Fetal Calf Serum)+1mmol/L Na-Pyruvate+1mmol/mlL-Glutamine+0.0625gPenicillium+0.05gStreptomycin+0.1mmol/Lβ-Mercaptoethanol+10ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁長滿后，進行傳代。將兩代以前的細胞冷凍保存。
根據(jù)實驗的設計，在用前48小時解凍培養(yǎng)，用0.25％的胰酶37℃消化傳代或收集，收集起來的細胞，用移液器反復吹打，使細胞以單個懸浮，用于核移植。
4.卵母細胞的成熟從屠宰場收集卵巢。用加有雙抗25℃生理鹽水，在3小時之內運至實驗室。用注射器抽取卵巢上2-7mm大的卵泡，在體視解剖鏡下挑選包有完整顆粒細胞的卵母細胞(COCs)用于成熟培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液是由M199+10％FCS(Fetal Calf Serum)+10μg/mlFSH(Follicle-stimulating Hormone)+1μg/ml LH(Luteinizining Hormone)+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor)構成，在38.5℃，5％CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時。用0.2％Hyaluronidase脫去顆粒細胞，在體視顯微鏡下選擇有第一極體的、胞質均勻一致的卵母細胞，置于含有10％血清的Hepes-199液中待用。
5.核移植卵母細胞的去核采用盲吸法。將20枚脫去顆粒細胞的成熟卵母細胞放入操作液滴的一端，操作液滴由Hepes-199，10％血清和7.5ug/ml Cytochalasin B組成，在室溫中預處理5分鐘后，用持卵針吸住一枚卵母細胞，調整極體的位置，使其第一極體位于時鐘2點的位置。用去核針將第一極體及其下部1/4-1/3物質吸出，然后用去核針吸一個直徑為15-20μm的成纖維細胞，并從同一個切口注入到透明帶下，并使供體細胞膜與卵膜緊密接觸。
6.融合和激活用BTX ECM-2001(BTX，San Diego，USA)型細胞電融合儀進行融合，融合液為0.28MMannitol+0.05mM CaCL2.2H2O+0.1mM MgCL2.6H2O+0.5mM Hepes+5mg/ml BSA(BovineSerum Albumin)。將卵母細胞和體細胞的復合體在電融合液中平衡2min，然后移入充滿電融合液兩電極間，用細玻璃針撥動使體細胞與受體的接觸面與電極絲平行，以兩次1.3kv/cm、10μs直流電脈沖誘導融合，融合操作后0.5h觀察融合的情況。
所有融合再克隆胚胎在成熟后25h左右進行激活處理(第一次克隆是在成熟后24小時進行激活處理，卵母細胞開始成熟培養(yǎng)為0h)。激活處理分三步進行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)，在38.5℃處理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX(Cycloheximide)+3μg/ml CD(Cytochalasin D)處理1小時；3.在含10μg/ml CHX(Cycloheximide)的CR1-aa中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
7.共培養(yǎng)顆粒細胞單層的制備用細的玻璃管將成熟液滴中的成熟卵母細胞吸出，將部分顆粒細胞留下，然后換入胚胎發(fā)育液[CR1+1％NEAA(Non-essential Amino Acids)+1％EAA(Essential Amino Acids)+1mmol/mlGlutamine+4mg/ml FAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)]，不久就形成顆粒細胞層，每2天換液一次，這是重構胚的第二階段的共培養(yǎng)液滴。
8.重構胚發(fā)育第一階段(0-2天)重構胚在發(fā)育液CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin中培養(yǎng)發(fā)育。第二階段(2-5天)將發(fā)育2天的重構胚移入共培養(yǎng)的液滴(CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin和顆粒細胞層)中。第三階段(5-9天)在第5天胚胎的培養(yǎng)液內加入葡萄糖，其濃度為1mg/ml。每2天換液一次，第6天后記錄桑椹胚和囊胚的數(shù)量，并進行統(tǒng)計分析。
9.胚胎移植將1枚形態(tài)良好的囊胚移入比它晚一天的發(fā)情受體牛子宮內(比如，第7天的囊胚移植到發(fā)情第6天受體牛子宮內)2個月后，通過B-超和確定懷孕情況。如果沒有合適發(fā)情受體牛，將重構胚冷凍保存，以后在移植。
10.再克隆犢牛出生在妊娠期間，用B-超觀察胎兒發(fā)育情況，在臨產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)胎兒過大或胎位不正，進行剖腹產(chǎn)，如果胎兒發(fā)育正常讓它自然分娩。
本發(fā)明得到282個重構胚，發(fā)育得到76個囊胚，囊胚率為26.9％(76/282)；移植28個囊胚，得到2頭再克隆奶牛，產(chǎn)犢率為7.1％(2/28)，出生的再克隆牛外型和各項生理指標都正常。本發(fā)明方法的囊胚率和出生率都得到了提高，以致克隆效率獲得很大提高。
DNA微衛(wèi)星分析結果表明，兩頭再克隆奶?；蛐团c克隆奶牛的完全相同，表明本發(fā)明奶牛的再克隆方法是可行的。
權利要求
1.一種奶牛的再克隆方法，包括供體細胞培養(yǎng)、受體卵母細胞培養(yǎng)，核移植、融合與激活，重構胚的培養(yǎng)和重構胚移植，其特征在于所述受體卵母細胞的培養(yǎng)液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/ml EGF；供體細胞的培養(yǎng)液中添加有1LDMEM干粉+2.75g NaHCO3+10％FCS+1mmol/L Na-Pyruvate+1mmol/mlL-Glutamine+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.1mmol/L β-Mercaptoethanol+10ng/ml EGF。
2.根據(jù)權利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述重構胚的培養(yǎng)采用分三階段培養(yǎng)，所述第一階段的培養(yǎng)液為CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/mlFAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin，培育時間0-2天；所述第二階段的培養(yǎng)液第一階段培養(yǎng)液和單層顆粒細胞，培育時間2-5天；第三階段的培養(yǎng)液第二階段培養(yǎng)液加入葡萄糖，葡萄糖濃度為1mg/ml，培養(yǎng)時間5-9天。
3.根據(jù)權利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述激活采用A23187、CHX和CD聯(lián)合激活，激活時間在卵母細胞成熟后25小時進行激活處理。
4.根據(jù)權利要求3所述的奶牛的再克隆方法，所述激活處理分三步進行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA，在38.5℃處理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX+3μg/ml CD處理1小時；3.在含10μg/ml CHX的CR1-aa中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
5.根據(jù)權利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述重構胚移植到比它晚一天發(fā)情受體牛的子宮內。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種奶牛的再克隆方法”包括供體細胞和受體卵母細胞培養(yǎng)，核移植、融合與激活，重構胚的培養(yǎng)和重構胚移植，其特征在于所述受體細胞的培養(yǎng)液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L－Glutamine+10ng/ml EGF(Epidermal GrowthFactor)；供體細胞的培養(yǎng)液中添加有1L DMEM(干粉)+2.75g NaHCO
文檔編號A61D19/00GK101050458SQ20071006476
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月26日 優(yōu)先權日2007年3月26日
發(fā)明者張家新, 王海, 張向利, 趙孟彬, 張紅霞, 郭麗麗, 安晶, 王月, 郭敏 申請人:北京錦繡大地農業(yè)股份有限公司