專利名稱：利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種和良種繁育領(lǐng)域，更具體涉及一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法，該方法適用于異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系高純度雜交種制備，可降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提高雜種產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
十字花科主要作物有用于收籽榨油的油菜(包括甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜和埃塞俄比亞芥)及白菜、甘藍(lán)類多種蔬菜。油菜油除了作為優(yōu)質(zhì)食用油之外，還是生物柴油的理想原料，因而油菜成為世界范圍內(nèi)的重要大田作物。十字花科蔬菜中白菜和甘藍(lán)類有多種，白菜類包括大白菜、小白菜、紅菜薹、菜心等，甘藍(lán)類則有結(jié)球甘藍(lán)、青花菜、包心菜、苤藍(lán)等，是人類膳食中的主要蔬菜，其中多種甘藍(lán)類蔬菜還具有保健功能，如抗癌等。隨著耕地資源的日趨減少及全球人口的不斷增加，提高作物產(chǎn)量成為滿足人類對(duì)日益增長(zhǎng)的作物產(chǎn)品需求的唯一途徑。而利用雜種優(yōu)勢(shì)提高產(chǎn)量則是作物高產(chǎn)育種的主要方法。雜種優(yōu)勢(shì)是指遺傳背景不同的親本雜交產(chǎn)生的F1代，在生活力、生長(zhǎng)勢(shì)、適應(yīng)性、抗逆性和豐產(chǎn)性等方面比雙親更強(qiáng)的一種普遍的生物學(xué)現(xiàn)象。自20世紀(jì)30年代在玉米中應(yīng)用獲得高產(chǎn)以來(lái)，雜種優(yōu)勢(shì)在農(nóng)作物生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用并取得了顯著的增產(chǎn)效果。油菜產(chǎn)量性狀的雜種優(yōu)勢(shì)顯著，F(xiàn)1代雜種產(chǎn)量可以超過(guò)其中親值的30％-60％(Sernyk and Stefansson，1983.Heterosis in summer rape(Brassica napusL.)Can J Plant Sci 63，407-413；傅廷棟，1995.雜交油菜的育種與利用，武漢湖北科學(xué)技術(shù)出版社)。目前，雜交油菜的推廣面積已占油菜生產(chǎn)總面積的60％以上。油菜品種進(jìn)一步改良的目標(biāo)就是在優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用雜種優(yōu)勢(shì)充分發(fā)揮其產(chǎn)量潛力。
細(xì)胞質(zhì)雄性不育是生產(chǎn)油菜雜交種的主要授粉控制系統(tǒng)。目前中國(guó)生產(chǎn)上使用的雜油菜有70％左右為細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜種，基本上是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)1972年從引進(jìn)品種“波里馬”中發(fā)現(xiàn)的波里馬不育細(xì)胞質(zhì)(Pol CMS)配制的Pol CMS的育性易受溫度影響，低溫下產(chǎn)生微量花粉，不育株可以自我繁殖，導(dǎo)致配制雜交種時(shí)一定比例的不育株存在，使雜種純度下降，其中的不育株結(jié)實(shí)率低，影響雜交種產(chǎn)量潛力的發(fā)揮，增加雜交油菜利用的風(fēng)險(xiǎn)性。其他存在于中國(guó)的雄性不育細(xì)胞質(zhì)有陜2A CMS、MI CMS、Nca CMS等，這些不育細(xì)胞質(zhì)均是在蕓薹屬栽培種中經(jīng)自然變異或種間雜交鑒定出來(lái)的，屬于同源雄性不育胞質(zhì)，均有育性不夠穩(wěn)定的缺點(diǎn)，應(yīng)用時(shí)存在雜種純度難以保證的問(wèn)題，且其完全保持系和完全恢復(fù)系都不容易篩選，大多數(shù)油菜品種都是不恢不保的類型(李殿榮.甘藍(lán)型油菜三系選育初報(bào).陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1980，(1)26-29；傅壽仲，戚存扣，唐繼紅.甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系MI CMS的選育.作物學(xué)報(bào)，1989，17(2)151-156.劉貴華，蔡明，盛曉燕.甘藍(lán)型油菜NCa雄性不育材料的選育及其在甘藍(lán)型油菜中的恢保關(guān)系.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997，30(3)61-65)。十字花科蔬菜中雜種優(yōu)勢(shì)的利用也非常廣泛，雜交種已占80％以上，但缺乏很好的授粉控制系統(tǒng)，生產(chǎn)雜交種主要利用自交不親和系，僅少數(shù)雜交種利用雄性不育系。國(guó)外通過(guò)轉(zhuǎn)移蘿卜不育細(xì)胞質(zhì)得到的育性較為穩(wěn)定的蘿卜質(zhì)雄性不育材料(Bannerot H，Boulidard L，Cauderon Y and Tempe J.Transfer of cytoplasmic male sterility from Raphanussativus to Brassica oleracea.Proc.Eucarpia Meeting Cruciferae1974，52-54)，但在利用過(guò)程中出現(xiàn)恢復(fù)系難找、恢復(fù)基因與不良品質(zhì)性狀連鎖的問(wèn)題，使得該不育系的育種利用進(jìn)程緩慢(Delourme R.，F(xiàn)oisset N.，Horvais R.，Barret P.，ChampagneG.，Cheung W.Y.，Landry B.S.，Renard M.Characterisation of the radish introgressioncarrying the Rfo restorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility inrapeseed(Brassica napus L.).1998，Theor Appl Genet 97129-134)。從1974年不育系創(chuàng)建成功，到1999年打破恢復(fù)基因與不良品質(zhì)性狀的連鎖，直至2000年以后才不斷育成雙低雜交油菜品種，實(shí)際應(yīng)用進(jìn)程花了將近30年的時(shí)間(Primard-Brisset C，Poupard JP，Horvais R，Eber F，Pelletier G，Renard M，DelourmeR，A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed(Brassica napus L.).Theor Appl Genet.2005；111(4)736-46)。生產(chǎn)上大面積應(yīng)用單一細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)雜交油菜存在流行性病害發(fā)生的危險(xiǎn)，利用新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)對(duì)保障雜交油菜的可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法，其特點(diǎn)是方法易行，操作性強(qiáng)，鑒定和篩選恢復(fù)材料速度快，恢復(fù)率高，三系配套容易，制種成本低，雜種純度高。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法并使用本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)步驟可實(shí)現(xiàn)上述目的。
一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜交種的方法，它包括以下步驟A、以野芥和油菜栽培種為親本進(jìn)行屬間雜交，獲得可育的含野芥細(xì)胞質(zhì)的屬間雜交后代植株F1；再套袋自交獲得雜交二代F2，或用雙低高產(chǎn)油菜品種為父本，與所獲屬間雜交后代進(jìn)行雜交，獲得回交一代BC1。
B、對(duì)F2及BC1群體的優(yōu)良單株進(jìn)行小孢子培養(yǎng)或連續(xù)3-5次自交純合基因型，獲得性狀較為一致的可育株系。
C、以可育株系為父本，向野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系授粉測(cè)交，獲得測(cè)交一代雜種，種植雜種鑒定育性，如雜種可育則父本株系為恢復(fù)株系，恢復(fù)株系自交繁殖形成群體，即獲得野芥不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)品系。
D、以野芥細(xì)胞質(zhì)不育系為細(xì)胞質(zhì)供體，以十字花科蔬菜白菜、甘藍(lán)等為父本，連續(xù)4-6次回交獲得十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系，以步驟C中選育的野芥不育胞質(zhì)的恢復(fù)品系為恢復(fù)基因供體，與十字花科蔬菜進(jìn)行有性雜交獲得十字花科蔬菜野芥不育細(xì)胞質(zhì)恢復(fù)品系。
E、以油菜或十字花科蔬菜的野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以任何雄性可育的油菜或十字花科蔬菜品種(或品系)為父本，進(jìn)行有性雜交生產(chǎn)F1雜種種子，用于提高F1代的營(yíng)養(yǎng)體產(chǎn)量或種子產(chǎn)量。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜交種的方法，包括以下步驟1、屬間可育雜種的獲得1.1葉肉原生質(zhì)體的分離甘藍(lán)型油菜及野芥的種子經(jīng)表面消毒后(置70％的乙醇1分鐘，1.5％的次氯酸納10分鐘，無(wú)菌水沖洗3次)，接種在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置25℃、16小時(shí)60-80μmol m-2s-1光照條件下生長(zhǎng)。取充分展開的葉片用于原生質(zhì)體的分離。酶解時(shí)在5cm的培養(yǎng)皿中加入3.5ml SCM溶液(0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8)。用解剖刀將葉片劃成羽狀后加1.5ml酶液(0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纖維素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase)，25℃避光酶解14-18個(gè)小時(shí)，輕微晃動(dòng)。
1.2原生質(zhì)體的純化用孔徑為200目或400目的細(xì)胞篩過(guò)慮，加W5(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖)混勻至10ml離心管中，600rmp/min離心5分鐘，棄上清液收集原生質(zhì)體，用5ml蔗糖+MES(0.5M蔗糖，1mM MES)溶液重新懸浮，在上層加入W5，形成界面離心(600rmp/min)10分鐘，用吸管取兩界面之間的原生質(zhì)體帶，再用W5懸浮，離心(600rmp/min)5分鐘。
1.3原生質(zhì)前處理及融合利用5mM的碘乙酸(IOA)處理近緣種原生質(zhì)體20-45分鐘，甘藍(lán)型原生質(zhì)體不做任何前處理，密度均調(diào)至2×106pp/ml。將PEG融合液(15％PEG，60mM CaCl2，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO)成對(duì)滴入培養(yǎng)皿中。將已處理的兩親本原生質(zhì)體等體積混勻，加2-3滴在成對(duì)的PEG融合液中間，兩邊再各加1滴融合液，共培養(yǎng)10min。隨后將共培養(yǎng)后的混和原生質(zhì)體逐步用W5+MES稀釋，劑量分別為0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml，時(shí)間間隔1min，共滴入W5+MES溶液2.5ml，在超凈工作臺(tái)上靜置共培養(yǎng)1.5小時(shí)后，收集原生質(zhì)體于離心管中，用W5洗滌，離心(600ppm/min)5min。再用液體PellB懸浮原生質(zhì)體，將調(diào)整密度為105pp/ml。
1.4原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜種鑒定繁殖在PellB平板上倒一薄層細(xì)胞懸浮液，放上飼養(yǎng)膜，將原生質(zhì)體溶液滴在飼養(yǎng)膜上，吸去清水，密封，暗培養(yǎng)10-15天。待長(zhǎng)成小細(xì)胞團(tuán)后，將細(xì)胞團(tuán)逐個(gè)轉(zhuǎn)至PellC平板上，5-7天后將長(zhǎng)成3-5mm的小愈傷，轉(zhuǎn)入PellE誘導(dǎo)芽。出芽后將幼芽轉(zhuǎn)至PellF中繼續(xù)生長(zhǎng)，當(dāng)幼苗出現(xiàn)2-3片展開的葉片后，轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，得到生根后的再生植株。
2、野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)品系的選育2.1雜種可育株的鑒定和純化將再生植株移栽到溫室或大田，進(jìn)行性狀鑒定，花期觀察育性，選有花粉的可育株套袋自交，獲得雜交二代F2種子，或利用甘藍(lán)型油菜品種的花粉給再生出來(lái)的雜種植株授粉，獲得回交一代BC1種子。種植F2及BC1種子，選擇F2及BC1群體中的可育株，繼續(xù)套袋自交或通過(guò)小孢子培養(yǎng)純合基因型，獲得性狀較為一致的可育株系。
2.2野芥細(xì)胞質(zhì)不育恢復(fù)品系的鑒定以可育株系為父本，給野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育株授粉進(jìn)行測(cè)交，獲得測(cè)交一代雜種，種植雜種鑒定育性，如果雜種的育性可以得到恢復(fù)的，則其父本株系為恢復(fù)株系，恢復(fù)株系自交繁殖成為群體，即育成油菜野芥不育胞質(zhì)的恢復(fù)品系。
3、油菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)性狀向十字花科蔬菜的轉(zhuǎn)育以野芥細(xì)胞質(zhì)不育系為細(xì)胞質(zhì)供體，以十字花科蔬菜白菜、甘藍(lán)等為父本，連續(xù)回交4代以上獲得十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系，以步驟2中選育的野芥不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)品系為恢復(fù)基因供體，與十字花科蔬菜進(jìn)行有性雜交，在雜交種自交后的F2后，選取單株與野芥胞質(zhì)不育單株成對(duì)測(cè)交鑒定恢復(fù)性能，篩選獲得十字花科蔬菜野芥不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)品系?；謴?fù)系的性狀來(lái)源于新疆野芥。
4、野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交種生產(chǎn)4.1不育系的繁殖以油菜或十字花科蔬菜的野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以任何油菜或十字花科蔬菜的可育品種為父本，連續(xù)回交4次，繁殖油菜或十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，形成一對(duì)不育系和保持系，不育系含新疆野芥的細(xì)胞質(zhì)，不育系可用來(lái)生產(chǎn)雜交種，保持系則用來(lái)通過(guò)給不育系授粉，繼續(xù)繁殖不育系。
4.2不育雜交種的生產(chǎn)以步驟4.1中繁殖的不育系為母本，任何油菜或十字花科蔬菜可育品種為父本，按不育系和可育品系4∶2或5∶2或6∶2的行比種植，開花期輔以人工或蜂媒傳粉，終花期砍去父本，收獲不育株行的種子，即生產(chǎn)出不可育的雜交種種子，可以用于雜種蔬菜的生產(chǎn)。
4.3可育雜交種的生產(chǎn)以步驟4.1中繁殖的不育系為母本，步驟2或3中育成的油菜或十字花科蔬菜野芥恢復(fù)品系為父本，按不育系和恢復(fù)系4∶2或5∶2或6∶2的行比種植，開花期輔以人工或蜂媒傳粉，終花期砍去父本，收獲不育株行的種子，即生產(chǎn)出可育的雜交種種子，可以用于雜種油菜和蔬菜的生產(chǎn)。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、恢復(fù)材料鑒定效率高，由于恢復(fù)基因與不育胞質(zhì)是共同進(jìn)化的，恢復(fù)基因通過(guò)屬間雜交轉(zhuǎn)入油菜栽培種中，通過(guò)對(duì)雜種后代的鑒定，很快可獲得恢復(fù)材料，且恢復(fù)材料的育性正常，花粉量大，結(jié)實(shí)性好(請(qǐng)見圖1)。
2、恢復(fù)系選育速度快，由于同時(shí)進(jìn)行測(cè)交和自交，結(jié)合小孢子培養(yǎng)，恢復(fù)系純化快，邊純化邊鑒定，3-5個(gè)世代即2-3年就可獲得純合恢復(fù)系(請(qǐng)見圖2)。
3、三系選育容易，野芥胞質(zhì)不育屬異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育，所有油菜或十字花科白菜、甘藍(lán)類蔬菜都是其保持系，轉(zhuǎn)育不育系和保持系只需進(jìn)行簡(jiǎn)單連續(xù)回交，加上2中陳述的恢復(fù)系選育快，很容易成功選育配套的三系。
4、組合選配靈活，雜交種選育效率高，由于所有油菜或十字花科白菜、甘藍(lán)類蔬菜都是其保持系，一旦一個(gè)恢復(fù)系選育成功，可以與很多油菜或十字花科白菜、甘藍(lán)類蔬菜品系測(cè)配，只要發(fā)現(xiàn)強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合，都能用于生產(chǎn)。
5、雜交種種子純度高，由于野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性穩(wěn)定，恢復(fù)系的恢復(fù)率高，雜種結(jié)實(shí)正常(請(qǐng)見圖3)，配制出的雜交種種子純度高，雜交種生產(chǎn)安全性好。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)系統(tǒng)中PellB、PellC、PellF培養(yǎng)基與Pelletier等(1983)所用相同(Pelletier G P C，Vedel F，Chetrit P，Remy R，Rouselle P，and Renard M.Intergeneric cytoplasm hybridization in Cruciferae by protoplast fusion.MolecularGeneral Genetics，1983，(191)244-250)。MS培養(yǎng)基則是Murashige和Skoog(1962)發(fā)明的(Murashige T and Skoog F，A revised medium for rapid growth andbio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15473-497)。小孢子培養(yǎng)方法依照的是梅德圣等(2007)已發(fā)表的程序進(jìn)行(梅德圣，王漢中，李云昌，胡瓊，李英德，徐育松，油菜小孢子培養(yǎng)影響因素及黃籽油菜雙單倍體群體的構(gòu)建。華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22(1)112-113)


圖1為一種甘藍(lán)型油菜野芥胞質(zhì)不育恢復(fù)品系的育性示意圖，A圖為盛花期花藥散粉情況，其花藥飽滿，花粉量大，雄性育性正常。B圖為不同恢復(fù)單株套袋自交后結(jié)實(shí)情況，角果大小和結(jié)實(shí)均正常。
圖2甘藍(lán)型油菜野芥胞質(zhì)不育恢復(fù)品系的小孢子培養(yǎng)及田間一致性，A圖為小孢子培養(yǎng)成胚情況，可見材料成胚率高，每花蕾成胚可達(dá)100個(gè)以上。B圖為恢復(fù)品系田間生長(zhǎng)情況，其花期性狀整齊一致。
圖3甘藍(lán)型油菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與恢復(fù)系的F1雜種育性表現(xiàn)，A圖為F1植株的開花情況，其花瓣平展，花大，雄蕊正常伸長(zhǎng)，花粉散粉正常。B圖為F1不同單株的結(jié)實(shí)情況，可見結(jié)實(shí)性良好，角果發(fā)育正常。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施實(shí)例1屬間雜交引進(jìn)野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)性狀制備雜交種1、采用植物材料進(jìn)行原生質(zhì)體融合或有性雜交(見實(shí)施實(shí)例2)獲得含野芥細(xì)胞質(zhì)的體細(xì)胞雜種，所用植物材料為甘藍(lán)型油菜雙低品種中雙4號(hào)和新疆野芥資源野油18號(hào)，包括以下步驟A、葉肉原生質(zhì)體的分離甘藍(lán)型油菜品種中雙4號(hào)及野芥野油18號(hào)的種子經(jīng)表面消毒后(置70％的乙醇1分鐘，1.5％的次氯酸納10分鐘，無(wú)菌水沖洗3次)，接種在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置25℃、16小時(shí)60-80μmol m-2s-1光照條件下生長(zhǎng)。取充分展開的葉片用于原生質(zhì)體的分離。酶解時(shí)在5cm的培養(yǎng)皿中加入3.5ml SCM溶液(0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8)。用解剖刀將葉片劃成羽狀后加1.5ml酶液(0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纖維素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase)，25℃避光酶解14-18個(gè)小時(shí)，輕微晃動(dòng)。
B、原生質(zhì)體的純化用孔徑為200目或400目的細(xì)胞篩過(guò)慮，加W5(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖)混勻至10ml離心管中，600rmp/min離心5分鐘，棄上清液收集原生質(zhì)體，用5ml蔗糖+MES(0.5M蔗糖，1mM MES)溶液重新懸浮，在上層加入W5，形成界面離心(600rmp/min)10分鐘，用吸管取兩界面之間的原生質(zhì)體帶，再用W5懸浮，離心(600rmp/min)5分鐘。
C、原生質(zhì)前處理及融合利用5mM的碘乙酸(IOA)處理近緣種原生質(zhì)體20-45分鐘，甘藍(lán)型原生質(zhì)體不做任何前處理，密度均調(diào)至2×106pp/ml。將PEG融合液(15％PEG，60mM CaCl2，90 mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO)成對(duì)滴入培養(yǎng)皿中。將已處理的兩親本原生質(zhì)體等體積混勻，加2-3滴在成對(duì)的融合液中間，兩邊再各加1滴融合液，共培養(yǎng)10min。隨后將上述混和原生質(zhì)體逐步用W5+MES稀釋，劑量分別為0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml，時(shí)間間隔1min，共滴入W5+MES溶液2.5ml，在超凈工作臺(tái)上靜置共培養(yǎng)1.5小時(shí)后，收集原生質(zhì)體于離心管中，用W5洗滌，離心(600ppm/min)5min。再用液體PellB懸浮原生質(zhì)體，將調(diào)整密度為105pp/ml。
D、原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜種鑒定繁殖在PellB平板上倒一薄層細(xì)胞懸浮液，放上飼養(yǎng)膜，將原生質(zhì)體溶液滴在飼養(yǎng)膜上，吸去清水，密封，暗培養(yǎng)10-15天。待長(zhǎng)成小細(xì)胞團(tuán)后，將細(xì)胞團(tuán)逐個(gè)轉(zhuǎn)至PellC平板上，5-7天后將長(zhǎng)成3-5mm的小愈傷，轉(zhuǎn)入PellE誘導(dǎo)芽。出芽后將幼芽轉(zhuǎn)至PellF中繼續(xù)生長(zhǎng)，當(dāng)幼苗出現(xiàn)2-3片展開的葉片后，轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。得到生根后的再生體細(xì)胞雜種植株。
2、野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)品系的選育A、雜種可育株的鑒定和純化將再生植株移栽到溫室或大田，進(jìn)行性狀鑒定，花期觀察育性，選有花粉的可育株套袋自交，獲得F2種子，或利用甘藍(lán)型油菜品種的花粉給再生出來(lái)的雜種植株授粉，獲得回交一代(BC1)種子。種植F2及BC1種子，選擇F2及BC1群體中的可育株，繼續(xù)套袋自交或通過(guò)小孢子培養(yǎng)純合基因型，獲得性狀較為一致的可育株系。
B、野芥胞質(zhì)恢復(fù)品系的鑒定以可育株系為父本，給野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育株授粉進(jìn)行測(cè)交，獲得測(cè)交一代雜種，種植雜種鑒定育性，雜種的育性可以得到恢復(fù)的，則其父本株系為恢復(fù)株系，恢復(fù)株系自交繁殖成為群體，即育成油菜野芥不育胞質(zhì)的恢復(fù)品系。
3、野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)性狀向十字花科蔬菜的轉(zhuǎn)育以野芥細(xì)胞質(zhì)不育系為細(xì)胞質(zhì)供體，以十字花科蔬菜白菜、甘藍(lán)等為父本，連續(xù)回交4代獲得十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系，以步驟2中選育的野芥不育胞質(zhì)的恢復(fù)品系為恢復(fù)基因供體，與十字花科蔬菜進(jìn)行有性雜交，在雜交種自交后的F2后，選取單株與野芥細(xì)胞質(zhì)不育單株成對(duì)測(cè)交鑒定恢復(fù)性能，篩選獲得十字花科蔬菜野芥不育胞質(zhì)恢復(fù)品系?；謴?fù)系的性狀來(lái)源于新疆野芥。
4、野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交種生產(chǎn)A、不育系的繁殖以油菜或十字花科蔬菜的野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以任何油菜或十字花科蔬菜白菜或甘藍(lán)的可育品種為父本，連續(xù)回交4代，繁殖油菜或白菜或甘藍(lán)的野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，形成一對(duì)不育系和保持系，不育系含新疆野芥的細(xì)胞質(zhì)，不育系可用來(lái)生產(chǎn)雜交種，保持系則用來(lái)通過(guò)給不育系授粉，繼續(xù)繁殖不育系。
B、不育雜交種的生產(chǎn)以步驟4.1中繁殖的不育系為母本，以任何油菜品種或十字花科蔬菜白菜或甘藍(lán)的可育品種為父本，按不育系和可育品系4∶2或5∶2或6∶2的行比種植，開花期輔以人工或蜂媒傳粉，終花期砍去父本，收獲不育株行的種子，即生產(chǎn)出不可育的雜交種種子，可以用于雜種蔬菜的生產(chǎn)。
C、可育雜交種的生產(chǎn)以步驟4.1中繁殖的不育系為母本，步驟2或3中育成的油菜或十字花科蔬菜野芥恢復(fù)品系為父本，按不育系和恢復(fù)系4∶2或5∶2或6∶2的行比種植，開花期輔以人工或蜂媒傳粉，終花期砍去父本，收獲不育株行的種子，即生產(chǎn)出可育的雜交種種子，可以用于雜種油菜和蔬菜的生產(chǎn)。
實(shí)施實(shí)例2有性雜交引進(jìn)野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因生產(chǎn)雜交種1.子房培養(yǎng)獲得含野芥細(xì)胞質(zhì)的屬間雜種田間種植野芥野油18及甘藍(lán)型油菜中雙4號(hào)，開花期以野油18為母本，中雙4號(hào)為父本，進(jìn)行人工去雄和授粉，授粉7-10天后，采回開始發(fā)育的角果，經(jīng)表面消毒后，置含0.8％的水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，35-40天后，將角果中的幼胚取出，置MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，萌發(fā)后長(zhǎng)出真葉。
2.屬間雜種的染色體加倍待真葉長(zhǎng)出之后，將幼苗切下，置含0.01％秋水仙堿的MS培養(yǎng)基中處理10天進(jìn)行染色體加倍，隨后轉(zhuǎn)入含0.2mg/l NAA的MS培養(yǎng)基上生根，獲得染色體加倍后的含野芥細(xì)胞質(zhì)的甘藍(lán)型油菜與野芥有性雜交一代F1。
3.雜種鑒定及純合將雜種植株轉(zhuǎn)入田間，根據(jù)形態(tài)性狀鑒定雜種的真實(shí)性。選取染色體加倍成功的雜種植株(植株生長(zhǎng)正常，器官大小也正常，有花粉)，花期套袋自交或利用甘藍(lán)型油菜做父本與之回交，獲得自交二代F2和回交一代BC1種子。種植F2及BC1種子，選擇F2及BC1群體中的可育株，繼續(xù)套袋自交或通過(guò)小孢子培養(yǎng)純合基因型，獲得性狀較為一致的可育株系。
4.油菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)品系的選育同實(shí)施實(shí)例1。
5.油菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育和恢復(fù)性狀向十字花科蔬菜的轉(zhuǎn)育同實(shí)施實(shí)例1。
6.油菜及十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交種生產(chǎn)同實(shí)施實(shí)例1。
權(quán)利要求
1.一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜交種的方法，包括以下步驟A、屬間可育雜種的獲得首先是葉肉原生質(zhì)體的分離甘藍(lán)型油菜及野芥的種子經(jīng)消毒后/置70％的乙醇1分鐘，1.5％的次氯酸納10分鐘，無(wú)菌水沖洗3次，接種在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置25℃、16小時(shí)60-80μmolm-2s-1光照條件下生長(zhǎng)，取展開的葉片用于原生質(zhì)體的分離，酶解時(shí)在5cm的培養(yǎng)皿中加入3.5ml SCM溶液/0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8，用刀將葉片劃成羽狀后加酶液/0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纖維素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase，25℃避光酶解14-18個(gè)小時(shí)，晃動(dòng)；其次是原生質(zhì)體的純化用孔徑為200或400目的細(xì)胞篩過(guò)慮，加W5/154mM NaCl，125mMCaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖混勻至離心管中，離心，棄上清液收集原生質(zhì)體，用蔗糖+MES、0.5M蔗糖，1mM MES溶液重新懸浮，在上層加入W5，離心，取兩界面之間的原生質(zhì)體帶，再用W5懸浮，離心；第三是原生質(zhì)前處理及融合利用5mM的碘乙酸處理近緣種原生質(zhì)體20-45分鐘，密度均調(diào)至2×106pp/ml，將PEG融合液/15％PEG，60mM CaCl2，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO成對(duì)滴入培養(yǎng)皿中，將已處理的兩親本原生質(zhì)體等體積混勻，加2-3滴在成對(duì)的融合液中間，兩邊再各加1滴融合液，共培養(yǎng)，隨后將上述混和原生質(zhì)體用W5+MES稀釋，收集原生質(zhì)體于離心管中，用W5洗滌，離心，再用液體PellB懸浮原生質(zhì)體，將調(diào)整密度為105pp/ml；第四是原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜種鑒定繁殖，在PellB平板上倒一層細(xì)胞懸浮液，放上飼養(yǎng)膜，將原生質(zhì)體溶液滴在飼養(yǎng)膜上，吸去清水，密封，暗培養(yǎng)10-15天，待長(zhǎng)成細(xì)胞團(tuán)后，將細(xì)胞團(tuán)逐個(gè)轉(zhuǎn)至PellC平板上，5-7天后將長(zhǎng)成3-5mm的小愈傷，轉(zhuǎn)入PellE誘導(dǎo)芽，出芽后將幼芽轉(zhuǎn)至PellF中繼續(xù)生長(zhǎng)，當(dāng)幼苗出現(xiàn)葉片后，轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，得到生根后的再生植株；B、油菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)品系的選育首先是雜種可育株的鑒定和純化，將再生植株移栽到溫室或大田，進(jìn)行性狀鑒定，花期觀察育性，選有花粉的育株套袋自交，獲得F2種子，或利用甘藍(lán)型油菜品種的花粉給再生出來(lái)的雜種植株授粉，獲得回交一代/BC1種子，種植F2及BC1種子，選擇F2及BC1群體中的育株，繼續(xù)套袋自交或通過(guò)小孢子培養(yǎng)純合基因型，獲得性狀為一致的育株系；其次是野芥胞質(zhì)恢復(fù)品系的鑒定，以育株系為父本，給野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育株授粉進(jìn)行測(cè)交，獲得測(cè)交一代雜種，種植雜種鑒定育性，雜種的育性得到恢復(fù)的，父本株系為恢復(fù)系，恢復(fù)系自交繁殖成為群體，即育成油菜野芥不育胞質(zhì)的恢復(fù)品系；C、油菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)性狀向十字花科蔬菜的轉(zhuǎn)育是野芥細(xì)胞質(zhì)不育系為細(xì)胞質(zhì)供體，以十字花科蔬菜白菜、甘藍(lán)為父本，連續(xù)回交4代獲得十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系，以步驟B中選育的野芥不育胞質(zhì)的恢復(fù)品系為恢復(fù)基因供體，與十字花科蔬菜進(jìn)行有性雜交，在雜交種自交后的F2后，選取單株與野芥胞質(zhì)不育材料測(cè)交鑒定恢復(fù)性能，篩選獲得十字花科蔬菜野芥不育胞質(zhì)恢復(fù)品系；D、野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交種生產(chǎn)首先是不育系的繁殖，以油菜或十字花科蔬菜的野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以油菜或十字花科蔬菜的品種為父本，連續(xù)回交4代，繁殖油菜或十字花科蔬菜野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，形成一對(duì)不育系和保持系，繼續(xù)繁殖不育系；其次是不育雜交種的生產(chǎn)，以繁殖的不育系為母本，油菜或十字花科蔬菜品種為父本，按不育系和品系4∶2或5∶2或6∶2的行比種植，開花期輔以人工或蜂媒傳粉，終花期砍去父本，收獲不育株行的種子，生產(chǎn)出不育的雜交種種子，用于雜種蔬菜的生產(chǎn)；第三是可育雜交種的生產(chǎn)以本步驟A中繁殖的不育系為母本，按不育系和恢復(fù)系4∶2或5∶2或6∶2的行比種植，開花期輔以人工或蜂媒傳粉，終花期砍去父本，收獲不育株行的種子，生產(chǎn)出的雜交種種子，用于雜種油菜和蔬菜的生產(chǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法，其特征在于所用的不育系含新疆野芥的細(xì)胞質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法，其特征在于所用的恢復(fù)系的恢復(fù)性狀來(lái)源于新疆野芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用野芥不育細(xì)胞質(zhì)制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法，其主要步驟為A.屬間雜種的獲得，首先是葉肉原生質(zhì)體的分離；其次是原生質(zhì)體的純化；第三是原生質(zhì)前處理及融合；第四是原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜種鑒定繁殖；B.野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)品系的選育；C.野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)性狀向十字花科蔬菜的轉(zhuǎn)育；D.野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交生產(chǎn)，即以油菜或十字花科蔬菜的野芥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以雄性可育的油菜或十字花科蔬菜品種為父本，進(jìn)行有性雜交生產(chǎn)F1雜種種子，用于提高油菜F1代的營(yíng)養(yǎng)體產(chǎn)量或種子產(chǎn)量。本發(fā)明方法易行，鑒定和篩選恢復(fù)材料快、恢復(fù)率高，三系配套容易，成本低，制備的雜交種純度高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101044837SQ200710052080
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者胡瓊, 李云昌, 梅德圣, 李英德, 徐育松 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所