專利名稱：：利用酵母單雜交體系獲取抗凍相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體地說利用酵母單雜交體系從水稻基因表達(dá)文庫中篩選與水稻抗凍相關(guān)的基因，利用農(nóng)桿菌將篩選基因轉(zhuǎn)化到水稻中，使之能在水稻中高效表達(dá)，提高水稻的抗凍能力。
背景技術(shù)：
：低溫是影響植物生長、發(fā)育及其地理分布的重要環(huán)境限制因素之一。大多數(shù)熱帶和亞熱帶植物由于缺乏對低溫的適應(yīng)能力，當(dāng)環(huán)境溫度低于l(TC時(shí)就會受到傷害，嚴(yán)重影響植物的正常生長、發(fā)育甚至造成死亡。分布于溫帶地區(qū)的植物，在溫暖季節(jié)對冰凍的抗性相當(dāng)弱。水稻是主要糧食作物之一，屬喜溫作物。目前水稻從南緯34。的南美洲大西洋沿岸至北緯53。27'的黑龍江漠河、從平原到海拔2700m范圍內(nèi)廣泛栽培，而水稻生長所需的適宜溫度為1518t:至3033'C，因此低溫冷害發(fā)生比較普遍。我國南方早春寒潮入侵，氣溫驟然下降，容易造成水稻幼苗嚴(yán)重的凍害，大部分水稻作物品種的幼苗不能適應(yīng)這種變化無常的不良?xì)夂颦h(huán)境，從而導(dǎo)致水稻幼苗的傷害和死亡。我國每年因低溫冷害使稻谷減產(chǎn)3050億公斤。為了培育耐寒能力較強(qiáng)的品種應(yīng)用于生產(chǎn)，分離和鑒定對抗凍性提高起著關(guān)鍵作用的低溫反應(yīng)基因顯得十分重要。植物在低溫環(huán)境生長一段時(shí)間后，能夠增強(qiáng)抗凍能力，從而耐受隨即發(fā)生的冰凍溫度，這個(gè)適應(yīng)過程稱為低溫馴化。低溫馴化是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。近二十年來，世界各地的科研工作者圍繞在低溫馴化過程中植物發(fā)生的生理生化和分子水平的各種變化進(jìn)行了大量的研究。最新的研究表明至少有300個(gè)低溫反應(yīng)基因參與了低溫馴化進(jìn)程，基因的蛋白產(chǎn)物可分為兩大類一類是直接保護(hù)細(xì)胞免受脅迫傷害的功能蛋白，另一類是調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。直接參與冰凍保護(hù)的功能蛋白包括參與滲透調(diào)節(jié)物合成的關(guān)鍵酶、參與活性氧清除的各種抗氧化酶以及冰凍保護(hù)蛋白。大量實(shí)驗(yàn)證明通過轉(zhuǎn)化脯氨酸合成酶基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的抗凍性。而植物受到低溫和干旱脅迫時(shí)，甜菜堿醛脫氫酶(BADH)活性增強(qiáng)，BADH基因的表達(dá)量增加，從而使甜菜堿大量積累(Himghes1996，試驗(yàn)植物學(xué)報(bào))。低溫脅迫下，參與植物抗氧化的酶含量和活性均發(fā)生變化。對玉米研究表明低溫脅迫下玉米超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等活性改變；糖、抗壞血酸、谷胱甘肽含量也發(fā)生變化。轉(zhuǎn)MnSOD基因玉米，超氧化物歧化酶含量和活性均增強(qiáng)，因而抗寒力明顯增強(qiáng)。經(jīng)低溫脅迫適應(yīng)的玉米其抗氧化系統(tǒng)活力增強(qiáng)，耐低溫脅迫的能力明顯提高，說明低溫對這些酶有一定誘導(dǎo)作用，而低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶一定程度緩解了植物氧化性傷害(Breusegem1999，試驗(yàn)植物學(xué)報(bào))。對甘藍(lán)研究發(fā)現(xiàn)1種約10kD的冷凝蛋白，該冷凝蛋白是1種非特異依賴于Ca2+和Mn2+脂類轉(zhuǎn)移蛋白，可在凍融過程中保護(hù)類囊體活性，該蛋白與Ca2+和Mn2+的螯合能力同植物抗冷能力密切相關(guān)(Huang1995，低溫生物學(xué))。Mohapatm等在苜蓿中已分離到多種冷馴化特異的cDNA，對脫落酸誘導(dǎo)(ABA)、脫水處理誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄累積與冰凍耐受性明顯正相關(guān)(植物生理學(xué)報(bào)1989)。冷馴化能誘導(dǎo)多種COR蛋白基因表達(dá)，如擬南芥在冷馴化過程中能產(chǎn)生COR6.6,COR15a，COR78以及與LEA(Lateembryogenesisabundant)蛋白同源的COR47。Thomashow研究發(fā)現(xiàn)擬南芥受低溫、干旱或ABA處理時(shí)能誘導(dǎo)表達(dá)15kD的COR15a多肽，此多肽在葉綠體的基質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?4kD的成熟多肽COR15am。使COR15am多肽在轉(zhuǎn)基因擬南芥中大量表達(dá)后，葉綠體和原生質(zhì)體的抗凍性提高TC-2"C，并增強(qiáng)原生質(zhì)膜穩(wěn)定性，減輕寒凍損害(植物分子生物學(xué)報(bào)1994)。Imai等將西紅柿Le25基因轉(zhuǎn)入酵母中大量表達(dá)后,顯著提高酵母細(xì)胞耐寒性(試驗(yàn)植物學(xué)報(bào)1995)。對擬南芥中冷誘導(dǎo)基因的啟動子區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，很多基因存在對寒冷及脫水脅迫應(yīng)答的順式調(diào)節(jié)元件CRT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsiveelement)。這些CRT/DRE調(diào)節(jié)元件幾乎都有一個(gè)保守由5個(gè)堿基對組成的核心序列CCGAC。Stockinger等從擬南芥中發(fā)現(xiàn)了與CRT/DRE結(jié)合的冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活化因子CBF1,CBF2和CBF3，這些CBF—起串聯(lián)排列在擬南芥的第四號染色體上，組成一個(gè)小基因家族。CBF基因?yàn)榈蜏卣T導(dǎo)后迅速表達(dá)的基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄激活子控制著包括CRT/DRE調(diào)節(jié)因子基因的表達(dá)(美國自然科學(xué)研究進(jìn)展1997)。JagloOttosen等將CBFl基因?qū)霐M南芥，不需低溫刺激就可誘導(dǎo)一系列COR基因如COR16.6,COR115a，COR147和COR78等的表達(dá)，使未經(jīng)低溫馴化的植株就有較高的抗凍性(科學(xué)1998)。CBF3也可誘導(dǎo)低溫調(diào)節(jié)的耙基因(COR)表達(dá)。擬南芥CBF3基因的過度表達(dá)提高了耐低溫脅迫能力,且導(dǎo)致許多與低溫脅迫有關(guān)的生理生化變化，如脯氨酸和可溶性糖(蔗糖、棉籽糖、葡萄糖和果糖等)含量提高。植物超表達(dá)CBF3可提高脯氨酸生物合成酶(P5CS)的轉(zhuǎn)錄水平,而脯氨酸水平的提高有一部分則是由于P5CS的表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果。CBF3綜合調(diào)節(jié)著與低溫馴化響應(yīng)相關(guān)的多種組分(Glmous2000植物生理學(xué)報(bào))。CBF2與CBF1禾口CBF3有高度相似性,該轉(zhuǎn)錄因子與低溫響應(yīng)元件CCGAC連接，誘導(dǎo)了某些低溫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，提高了植物抗冷性(Hongl997植物生理學(xué)報(bào))。目前有關(guān)CBFs類植物抗凍有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究大部分來自擬南芥，而其它物種的研究報(bào)道不多。對擬南芥CBF家族的功能研究至今仍有一些問題未得到圓滿解決。比如，CBF基因家族的3名成員是否控制相同的基因表達(dá)？這些轉(zhuǎn)錄因子是如何參與低溫誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？各種轉(zhuǎn)錄因子在低溫馴化過程中是如何分工協(xié)作的？通過轉(zhuǎn)基因擬南芥中CBF1、CBF2、CBF3三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的表達(dá)水平及相應(yīng)植株生長發(fā)育的比較,可能對這些問題的解決有所幫助。酵母單雜交體系含有兩個(gè)質(zhì)粒，其中一個(gè)為含物種cDNA庫的酵母表達(dá)質(zhì)粒，用于表達(dá)cDNA與GAL4激活功能域的融合蛋白；另一個(gè)質(zhì)粒將含cis盒的DNA片段(即魚餌)與帶有基本啟動子的lacZ報(bào)告基因相連，構(gòu)建魚餌質(zhì)粒。當(dāng)這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中后，若cDNA庫中有一個(gè)cDNA克隆所編碼的DNA結(jié)合蛋白能識別cis盒的DNA片段，并與之結(jié)合，則融合蛋白中的GAL4激活功能域能激活與魚餌連接的基本啟動子，而使lacZ基因表達(dá)，菌落在X-gal平板上顯現(xiàn)藍(lán)色。本發(fā)明以水稻為研究材料，構(gòu)建一個(gè)含水稻cDNA庫的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPC86(Chevray1992，美國自然科學(xué)研究進(jìn)展)，為了克隆水稻中的抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，首先合成了凍害有關(guān)的順式元件，將它們插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGA-265UPl中(Guarente1983，酶方法學(xué)報(bào))，構(gòu)建魚餌質(zhì)粒，將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母，通過lacZ基因的表達(dá)來篩選轉(zhuǎn)錄因子
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明采用酵母單雜交方法從水稻的基因表達(dá)文庫中尋找與水稻抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。本發(fā)明從凍害誘導(dǎo)相關(guān)基因的啟動子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，篩選它們的共同序列CCGAC，利用化學(xué)合成方法將這些共同序列串聯(lián)在一起，構(gòu)建一個(gè)復(fù)合ACCGACATTACCGACATTACCGACATGGATCCGGGCCC(xiong2004,核酸研究)。本發(fā)明將合成的順式元件通過XhoI和BamHI位點(diǎn)插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGA-265UPl中(Guarente1983，酶方法學(xué)報(bào))，替換其中的CCAAT盒，構(gòu)建用于酵母單雜交篩選的魚餌質(zhì)粒pLGcold。該質(zhì)粒帶有l(wèi)acZ報(bào)告基因、URA選擇標(biāo)記和2u復(fù)制序列。順式元件的DNA片段作為魚餌置于CYCl(Pfeifer1987，細(xì)胞)的基本啟動子上游，調(diào)節(jié)lacZ基因的表達(dá)。本發(fā)明采用SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech公司)構(gòu)建水稻凍害誘導(dǎo)的表達(dá)文庫。取15天苗齡的水稻幼苗，品種為IR36，經(jīng)0。C低溫處理8h后，提取總RNA。以合成的cDNA第一鏈為模板，以GAL45'AAAGTCGACGGATGTTTAATACCACT禾QTAD45,AAAGCGGCCGCTTGATTGGAGACTTGACC為引物，利用LD-PCR進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94。C預(yù)熱lmin;94°C,30s,60。C,30s，72。C,3min。共20個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，苯酚氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30pl水溶解，各加入lplSalI和Notl酶切消化，DNA柱回收試劑回收大于400bp的cDNA。將cDNADNA連接到經(jīng)酶切處理好的pPC86載體(Chevray1992，美國自然科學(xué)研究進(jìn)展)，連接產(chǎn)物利用電擊儀高效轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)中。本發(fā)明采用酵母單雜交方法(Wang1993，自然)從水稻的基因表達(dá)文庫中尋找與水稻抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。將魚餌質(zhì)粒pLGcold轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞EGY48(MATot,his3trplura3-521eu::pLeu2-LexAop6)，轉(zhuǎn)化子在無尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)(Ito1983，細(xì)菌學(xué)雜志)。然后，將50ug含水稻cDNA庫的pPC86質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母細(xì)胞中，在不含尿嘧啶和色氨酸的SC培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而選擇帶有魚餌質(zhì)粒和插入有水稻cDNA的pPC86質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子。3(TC培養(yǎng)48h后，利用硝酸纖維素膜將生長的轉(zhuǎn)化子影印到含有X-gd的平板上進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑取藍(lán)色的酵母菌落。抽提每一個(gè)酵母陽性菌落的DNA，用電擊法將酵母DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC8菌株(氨基酸缺陷型thi-,trp-，ura-,leu-,his-)細(xì)胞中，先在含氨芐青霉素的2YT平板上培養(yǎng)，然后影印到不含色氨酸的M9培養(yǎng)基上培養(yǎng)。由于pPC86質(zhì)粒上帶有編碼TRP合成酶的標(biāo)記基因，因此在不含色氨酸的平板上生長的細(xì)菌含有插入水稻cDNA的pPC86載體。從大腸桿菌MC8菌株中抽提質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)化含有魚餌質(zhì)粒的酵母菌株EGY48，轉(zhuǎn)化子置于X-gal平板上進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑選能重復(fù)變藍(lán)色的酵母菌落。本發(fā)明通過核苷酸序列測定篩選的水稻cDNA的表達(dá)質(zhì)粒，最終獲得水稻中與抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP22。10203070405060AGCAGCAGCAGCAGAATATTAGC8090100140110120130GCATGAAGGGGAAGGGCGGGCCG150160170210180190200AGTGGGTGGCCGAGATCCGCGAG220230240280250260270CGCCGCCCGCGCCTACGACTCC290300310360320330340350CGTTGCCACCGCCGGTGCTCCT370380390430400410420CTCCAACAACTCTTCGTCCACG440450460500470480490ACACGCTGCAGCCGTCGTCGTCA510520530570540550560ACTTTGGGCTGGAGGGCTTCCAG580590600640610620630GGACCTCTCCATCTGCCCCGCC650660670680690本發(fā)明抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP22基因，分別用BamHI和Sacl進(jìn)行雙酶切后，通過T4DNA連接酶將AP22基因與含有雙35S啟動子的pCAMBIA1301(BioForge公司)植物表達(dá)載體連接，酶切鑒定和序列測定獲得了含有目的基因AP22的重組質(zhì)粒pCAMAP22。該表達(dá)載體還包含GUS報(bào)告基因和潮霉素抗性標(biāo)記基因。本發(fā)明利用電擊法將AP22的重組質(zhì)粒pCAMAP22質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，根癌農(nóng)桿菌菌株包括EHA105，LBA4404，GV3101，AGL-1。農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP22基因轉(zhuǎn)化水稻(劉巧全1998，植物生理學(xué)報(bào))、煙草和番茄等植物中(美國專利6323396)，農(nóng)桿菌粘花法轉(zhuǎn)化將抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP22基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中(Cloughl998，植物學(xué)雜志)，然后驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植物提高了對凍害的耐受性。圖1用于篩選抗凍轉(zhuǎn)錄因子基因的酵母魚餌質(zhì)粒的構(gòu)建。圖2利用酵母篩選獲得的陽性克隆。圖3通過序列測定獲得的抗凍轉(zhuǎn)錄因子基因AP22。圖4抗凍轉(zhuǎn)錄因子基因AP22的植物表達(dá)載體。通過酵母單雜交體系獲得抗凍基因具有以下優(yōu)點(diǎn)1.能夠針對性獲得調(diào)控植物抗凍的轉(zhuǎn)錄因子基因。2.抗凍基因來自植物本身，對環(huán)境影響較小。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:凍害應(yīng)答順式元件的全合成及魚餌質(zhì)粒構(gòu)建利用PCR將四個(gè)完全一樣的順式元件串聯(lián)。在串聯(lián)的順式元件5'端加入XhoI酶切位點(diǎn)，3'端加入BamHI位點(diǎn)。串聯(lián)后的順式元件長度為70-100bp。該順式元件序列為ACCCTCGAGCGGATAACAATTTCACACAGGTAC將含順式元件的DNA片段通過XhoI和BamHI位點(diǎn)插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGA-265UPl中，替換其中的CCAAT盒。該質(zhì)粒帶有l(wèi)acZ報(bào)告基因、URA選擇標(biāo)記和2u復(fù)制序列。細(xì)菌lacZ報(bào)告基因由CYC1基本啟動子控制，順式元件的DNA片段作為魚餌置于CYC1的基本啟動子上游，調(diào)節(jié)lacZ基因的表達(dá)。實(shí)施例2:水稻cDNA庫構(gòu)建。取15天苗齡的水稻幼苗，品種為IR36，經(jīng)0'C低溫處理8h后，液氮速凍，放置-70。C冰箱中保存以備提取總RNA。酵母表達(dá)載體質(zhì)粒pPC86購自Invitrogen公司；cDNA建庫試劑盒SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒為Clontech公司產(chǎn)品；DNA柱回收試劑盒購置Amersham公司；試劑RNA抽提試劑盒RNeasyPlantMiniKit為QIAGEN公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和T4DNALigase均購自上海Takara公司。總RNA采用QIAGEN公司的RNeasyPlantMiniKit提取。水稻cDNA的合成及cDNA文庫的構(gòu)建按Clontech公司SMARTcDNALibraryConstructionKit說明書操作進(jìn)行第一鏈合成。以合成的cDNA第一鏈為模板，以GAL45'AAAGTCGACGGATGTTTAATACCACT和TAD45'AAAGCGGCCGCTTGATTGGAGACTTGACC為引物，利用LD-PCR進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱1min;94°C,30s,60°C,30s,72。C,3min。共20個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，苯酚氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀物用30pl水溶解，各加入lplSail和Notl酶切消化，DNA柱回收試劑回收大于400bp的cDNA。將cDNADNA連接到經(jīng)上述酶切處理好的pPC86載體，連接產(chǎn)物利用電擊儀高效轉(zhuǎn)化DH5ct感受態(tài)中。實(shí)施例3:水稻中與凍害應(yīng)答順式元件順式元件DNA結(jié)合蛋白cDNA篩選將魚餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞EGY48(MATa,his3trplura3-52leu::pLeu2-LexAop6)，轉(zhuǎn)化子在無尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上(Alison2000，酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南)培養(yǎng)。制備含魚餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞，每次將50ug含水稻cDNA庫的pPC86質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母細(xì)胞中，在不含尿嘧啶和色氨酸的SC(Alison2000，酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而選擇帶有魚餌質(zhì)粒和插入有水稻cDNA的pPC86質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子。3(TC培養(yǎng)48h后，利用硝酸纖維素膜將生長的轉(zhuǎn)化子影印到含有X-gal的平板上進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑取藍(lán)色的酵母菌落。實(shí)施例4:酵母陽性克隆中帶水稻cDNA的pPC86質(zhì)粒的鑒定為了排除初篩得到的藍(lán)色酵母中存在的假陽性現(xiàn)象，抽提每一個(gè)酵母陽性菌落的DNA，用電擊法將酵母DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC8菌株(氨基酸缺陷型thi-,trp-,um-,leu-,his-)細(xì)胞中，先在含氨芐青霉素的2YT平板上培養(yǎng)，然后影印到不含色氨酸的M9培養(yǎng)基(Atlas1996，微生物培養(yǎng)基手冊)上培養(yǎng)。由于pPC86質(zhì)粒上帶有編碼TRP合成酶的標(biāo)記基因，因此在不含色氨酸的平板上生長的細(xì)菌含有插入水稻cDNA的pPC86載體。從大腸桿菌MC8菌株中抽提質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)化含有魚餌質(zhì)粒的酵母菌株EGY48，轉(zhuǎn)化子置于X-gal平板上進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑選能重復(fù)變藍(lán)色的酵母菌落。帶水稻轉(zhuǎn)錄因子cDNA的核苷酸順序測定，推測氨基酸順序和功能分析。抽提確認(rèn)為陽性菌落的酵母菌株DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，抽提其中的質(zhì)粒(含有插入水稻cDNA的pPC86載體)，利用pPC86載體上的通用引物進(jìn)行序列測定。最終獲得與凍害應(yīng)答順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因AP22。實(shí)施例5:轉(zhuǎn)錄因子基因AP22植物表達(dá)載體構(gòu)建首先通過PCR方法將AP22基因擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱1min;94°C,30s,60°C,30s,72°C,1min。共30個(gè)循環(huán)。并在基因的兩端加入BamHI和SacI酶切位點(diǎn)，PCR結(jié)束后，苯酚氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀。將PCR片段回收，進(jìn)行T/A克隆和序列測定，獲得含有AP22基因片段的質(zhì)粒pAP22。抽提pAP22質(zhì)粒，分別用BamHI和Sacl進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，通過T4DNA連接酶將AP22基因與含有雙35S啟動子的pCAMBIA1301質(zhì)粒連接，酶切鑒定和序列測定獲得了含有目的基因AP22的重組質(zhì)粒pCAMAP22。該表達(dá)載體還包含GUS報(bào)告基因和潮霉素抗性標(biāo)記基因。實(shí)施例6:農(nóng)桿菌培養(yǎng)和植物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105，LBA4404，GV3101，AGL-1菌株。質(zhì)粒pCAMAP22經(jīng)電擊法導(dǎo)人農(nóng)桿菌中。挑取單菌到25mlYEB培養(yǎng)基(50mg/l利福平)培養(yǎng)過夜，取5ml菌液轉(zhuǎn)接到100mlYEB培養(yǎng)基(50mg/l利福平)，培養(yǎng)至OD600=0.7-0.8，菌液冰上放置10min，5000rpm離心10min，4°C，收集菌體，加入100ml無菌雙蒸水清洗兩次。加入4ml10%甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到50ml離心管。5500rpm離心lOmin，4°C。收集菌體，加入500|il10%甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到1.5ml離心管。取感受態(tài)細(xì)胞，加入1^1重組質(zhì)粒pCAMAP22。用去頭的黃槍頭混勻，轉(zhuǎn)到0.1cm電擊杯中。電擊參數(shù)200Q，1.7KV，2.5F，電擊后立即加入800plSOC培養(yǎng)液。培養(yǎng)lh后，取lOO)iil涂抗性板篩選轉(zhuǎn)化子，28。C培養(yǎng)。1.擬南芥粘花法轉(zhuǎn)化含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株單菌落接種在5毫升含對應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中28。C培養(yǎng)2天。將5毫升菌液轉(zhuǎn)到500毫升的液體LB培養(yǎng)基(Atlas1996，微生物培養(yǎng)基手冊)中28。C培養(yǎng)16畫24h(OD=1.5-2.0).液體可以在4。C保存30天。室溫下離心收集菌體，4000g離心10min。用等體積5%的新鮮蔗糖溶液懸浮。加入0.02%的Silwet-77(購于廈門泰京公司)混勻后轉(zhuǎn)移到燒杯中。每個(gè)菌株培養(yǎng)300毫升后用于擬南芥轉(zhuǎn)化，每次轉(zhuǎn)化2-3缽。隔7天后再轉(zhuǎn)化1次。將擬南芥倒置后浸入菌液中IO秒鐘。蓮座和花序都要侵染。侵染后將轉(zhuǎn)化植株菌液空干3-5秒。用保鮮膜將轉(zhuǎn)化植株圈好，平放16-24h。轉(zhuǎn)化后不要放置在高溫和強(qiáng)光下。揭開保鮮膜，保持一定濕度，再生長1個(gè)月后收種子。利用50pg/mL潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株篩選。2.煙草和番茄轉(zhuǎn)化挑選比較飽滿的種子，用75°/。的酒精清洗lmin后，10%次氯酸鈉滅菌10min，種子鋪在MSO培養(yǎng)基(Murashing1962，植物生理學(xué)雜志)28。C培養(yǎng)待發(fā)芽。將煙草幼葉，番茄子葉或下胚軸剪成lcm2，放入MSO+萘乙酸(lug/ml)+6-芐氨基嘌呤(4ug/ml)的培養(yǎng)基中，22。C培養(yǎng)1天。農(nóng)桿菌培養(yǎng)OD0.8-1.0后離心5000g離心8min，去離子水清洗一次，等體積MS培養(yǎng)液懸浮侵染8min后，吸干放置在MSO+萘乙酸(lug/ml)+6-芐氨基嘌呤(4ug/ml)的培養(yǎng)基中，22度共培養(yǎng)3天。然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MSO+3-吲哚乙酸(0.1ug/ml)+反玉米素(2ug/ml)+羧芐青霉素(500ug/ml)+卡那霉素(50ug/ml)培養(yǎng)2-3周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MSO+3-卩引哚乙酸(0.1ug/ml)+反玉米素(21^/1111)+羧芐青霉素(500ug/ml)+卡那霉素(100叫/1111)培養(yǎng)2-3周，最后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+3-吲哚乙酸(0.1ug/ml)培養(yǎng)。3.水稻轉(zhuǎn)化N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，去殼的種子，授粉后12-15天的幼胚，經(jīng)表面消毒后接種到N6D2培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織(N6培養(yǎng)基，水解乳蛋白500mg/L，蔗糖30g/L,2,4-D2mg/L,植物凝膠2.5g/L,pH5.8)(劉巧全1998，植物生理學(xué)報(bào))；培養(yǎng)4-7天后取愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌培養(yǎng)OD0.8-1.0后離心5000g離心8min，DDH20清洗一次，等體積MS培養(yǎng)液懸浮侵染8min后，吸干放置在MSO+萘乙酸(lug/ml)+6-芐氨基嘌呤(4ug/ml)的培養(yǎng)基中，22C共培養(yǎng)3天。然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(羧芐青霉素500ug/ml和潮霉素HAT50ug/ml)，轉(zhuǎn)化后的愈傷在含有和的抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)34代，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(2mg/L激動素)；幼芽長至2mm轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.5mg/L3-吲哚丁酸)。以上培養(yǎng)基中分別加入500mg/L酶水解乳蛋白(CH)，0700mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖3080g/L，瓊脂6g幾。pH5.8。繼代周期為25d。將淡黃色的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，30d左右分化出芽。光照強(qiáng)度150020001x，1214h/d。從獲得的抗性植株中取一部分葉子，侵入含有X-GLUC的染色液中，篩選葉片變藍(lán)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測，提取葉片總DNA，參照《分子克隆》的方法，以AP22基因做引物，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱lmin;94°C，30s,60°C,30s,72°C,1min。共30個(gè)循環(huán)。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測。從分子水平上證明目的基因是否導(dǎo)入。'實(shí)施例7:轉(zhuǎn)錄因子基因AP22轉(zhuǎn)化植物后的抗凍分析將轉(zhuǎn)化植物自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，幼苗生長10-20天，轉(zhuǎn)入2。C培養(yǎng)93h，然后再移置到正常溫度，觀察植物的抗凍效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>水稻抗凍相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，多肽分子大小為26kD。該'U中含有順式元件TACCGACAT結(jié)合域。權(quán)利要求1.一種由復(fù)合順式元件插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGΔ-265UP1中，構(gòu)建酵母單雜交篩選魚餌質(zhì)粒，獲得含有如下核苷酸的抗凍相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因序列10203040506070ATGGAGATGGATATCGGCGAGGGCGAGAGCTGCTGCGGCAGGCGAAAGCAGCAGCAGCAGCAGAATATTAGC8090100110120130140AGCAGCAAGTCACGCAAGTGCTGCCCGCTGCGTCGTTCGCGGAAGGGGTGCATGAAGGGGAAGGGCGGGCCG150160170180190200210GAGAACCAGCGTTGCCCCTTCCGCGGCGTCCGGCAGCGCACCTGGGGCAAGTGGGTGGCCGAGATCCGCGAG220230240250260270280CCCAACCGCGGCGCCCGCCTCTGGCTCGGCACCTTCAACACCGCCCTCGACGCCGCCCGCGCCTACGACTCC290300310320330340350360GCCGCCAGGGCCCTCTACGGCGACTGCGCCCGCCTCAACCTATTGTTGGCCGTTGCCACCGCCGGTGCTCCT370380390400410420430CCTGCTGCTGGTACCCCTTCCGTGGCCACGCCCTGCAGCACCAACGACGACTCCAACAACTCTTCGTCCACG440450460470480490500ACGCATCAGCAGCAGCTGACGACGATGCTGCAGCTGGACGACGACAACTACACGCTGCAGCCGTCGTCGTCA510520530540550560570GATCAAGAGGACTTCGAGACGTACGTCACGCGGCTACCCAAGGCGGAGGACTTTGGGCTGGAGGGCTTCCAG580590600610620630640GAGGTTCCACTCGACGTCCTCGACGAAGCCGGCGGTGGCATCAGCATCTGGGACCTCTCCATCTGCCCCGCC650660670680690GATTTCATGGCCACCGCCGCCACCACCACCGCCAAATCATCTTAA2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子基因序列，其特征在于順式元件序列為ATTACCGACATTACCGACATGGATCCGGGCCC(3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子基因序列，其特征在于將復(fù)合順式元件的DNA片段插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGA-265UPl中，替換其中的CCAAT盒，獲得的該質(zhì)粒含有l(wèi)acZ報(bào)告基因，URA選擇標(biāo)記和2u復(fù)制序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)能與TACCGACAT順式元件結(jié)合。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子基因的用途用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的抗凍能力。全文摘要本發(fā)明涉及利用酵母單雜交體系獲得抗凍相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，該抗凍相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因采用由復(fù)合順式元件插入到大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pLGΔ-265UP1中，構(gòu)造酵母單雜交篩選魚餌質(zhì)粒獲得。它用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的抗凍能力。文檔編號A01H1/00GK101418299SQ200710047379公開日2009年4月29日申請日期2007年10月24日優(yōu)先權(quán)日2007年10月24日發(fā)明者付曉燕,姚泉洪,彭日荷,賢李,熊愛生,田永生,永薛,偉趙,峰高申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院