專利名稱：與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳標(biāo)記及其利用，所述遺傳標(biāo)記存在于以麥類為代表的禾本科植物、特別是大麥的基因組DNA中，而且與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)、賦予赤霉病抵抗性的基因)連鎖。
背景技術(shù)：
已知大麥的赤霉病不僅使大麥的品質(zhì)、收獲量降低，還是產(chǎn)生對人體有害的脫氧瓜萎鐮菌醇等霉毒的重大病害?，F(xiàn)在，其感染在全世界范圍內(nèi)增加，因此人們強(qiáng)烈希望培育出赤霉病抵抗性品種。
大麥的赤霉病是以Fusarium graminearum(禾谷鐮孢菌)、F.roseum(粉紅鐮孢菌)、F.culmorum(黃色鐮孢菌)等常見的腐生菌為起因而引起的病害。該病原菌在不完全世代中腐生地寄生在禾本科雜草、稻草、麥稈、地下有機(jī)物等中，一旦溫度和晝長等條件具備，就會(huì)形成子囊殼。如果所述子囊殼在水中潤濕后膨脹·開裂，則子囊孢子飛散而感染大麥等麥類。對麥類的感染在開花期前后的較短期間內(nèi)發(fā)生，在病穗中形成的分生孢子成為第2感染源而進(jìn)一步擴(kuò)大感染。此外，由于分生孢子含有粘物質(zhì)，因此通過雨露形成懸浮液而擴(kuò)散，進(jìn)一步擴(kuò)大感染。已知大麥赤霉病的感染機(jī)制是通過殘留在穎中的花藥殘骸或退化的組織引起最初的感染，菌絲成長后侵入殼粒內(nèi)，或者通過從穎伸出的花藥而侵入等，無論怎樣花藥都與其感染大為相關(guān)。
此外，在大麥中存在對赤霉病具有抵抗性的品種。對所述大麥的赤霉病抵抗性品種的抵抗性機(jī)制進(jìn)行了研究，提示與條性·穗長·出穗時(shí)期·穗軸節(jié)間長等性狀相關(guān)(例如，參照非專利文獻(xiàn)1～5)。此外，據(jù)稱大麥沒有對赤霉病的免疫抵抗性，較少基因是與其抵抗性相關(guān)的數(shù)量性狀(例如，參照非專利文獻(xiàn)6)。
然而，以往農(nóng)作物優(yōu)良品種的育種必須將具有目標(biāo)性狀的品種及野生品種等進(jìn)行雜交，實(shí)際培養(yǎng)多個(gè)個(gè)體后選拔出具有目標(biāo)性狀的個(gè)體，將該目標(biāo)性狀遺傳性地固定下來。因此，必需要廣闊的田地、大量的人力及相當(dāng)?shù)哪暝?。例如，以赤霉病抵抗性為目?biāo)性狀時(shí)，必須通過栽培選拔對象集團(tuán)、對每個(gè)個(gè)體評價(jià)赤霉病抵抗性，由此特別指定出待選拔的個(gè)體。此外，如果目標(biāo)性狀是易受栽培環(huán)境因素影響的性狀，則難以判定選拔個(gè)體所表現(xiàn)的目標(biāo)性狀是否是基因的表現(xiàn)型。
因此，近年來為了縮短育種期間、縮減勞動(dòng)力和田地面積、實(shí)現(xiàn)有用基因的準(zhǔn)確選拔，開始使用通過以遺傳標(biāo)記作為指標(biāo)的選拔的育種法。在使用這樣的遺傳標(biāo)記的育種中，根據(jù)標(biāo)記的基因型能夠在幼苗階段進(jìn)行選拔，也易于確認(rèn)目標(biāo)性狀的有無。因此，只要利用遺傳標(biāo)記就可以實(shí)現(xiàn)有效的育種。接著，為了實(shí)現(xiàn)利用了遺傳標(biāo)記的育種，必須開發(fā)出與目標(biāo)性狀密切連鎖的遺傳標(biāo)記。
然而，在農(nóng)業(yè)上重要的性狀的大部分在雜種后代中常常顯示出連續(xù)的變異。由于這樣的性狀可以通過用重量或長度等量的尺度來測定而被稱為數(shù)量性狀。數(shù)量性狀一般不是單一主動(dòng)基因支配的性狀，而常常是通過多個(gè)基因的作用來決定的。在農(nóng)作物的育種中作為改良對象的性狀的多數(shù)常常是如收獲量、品質(zhì)·味道等這樣的數(shù)量性狀。
將支配這樣的數(shù)量性狀的基因在染色體上所占的遺傳位置稱為QTL(Quantitative Trait Loci，數(shù)量性狀基因位點(diǎn))。作為推定QTL的方法，使用利用存在于QTL附近的遺傳標(biāo)記的QTL解析。從二十世紀(jì)八十年代后半期遺傳標(biāo)記問世以來，利用遺傳標(biāo)記制作詳細(xì)的連鎖圖大為發(fā)展，根據(jù)該連鎖圖在很多生物中得以進(jìn)行QTL解析。
如上所述，可以說與目標(biāo)性狀連鎖的遺傳標(biāo)記的開發(fā)能夠通過根據(jù)可覆蓋全部染色體的詳細(xì)的連鎖圖進(jìn)行準(zhǔn)確度高的QTL解析而實(shí)現(xiàn)，可以利用所得到的遺傳標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)高效的育種。
作為與上述遺傳標(biāo)記相關(guān)的技術(shù)，以大麥為例，本發(fā)明人等提案如下
1)與給大麥賦予鋁耐性的基因相連鎖的遺傳標(biāo)記及其利用相關(guān)的技術(shù)(參照專利文獻(xiàn)1)；2)與用于在小麥背景中檢測源自大麥染色體的核酸標(biāo)記的新型的引物對(參照專利文獻(xiàn)2)及其利用相關(guān)的技術(shù)等。
Steffen BJ.1988.“Fusarium head blight of barleyepidemics，impact，andbreeding for resistance.”NBAA Tech Quart 35177-184. Stuchlakova E and Sip V.1996.“Resistance of Czech and Slovak winterwheat varieties to Fusarium head blight.”Genet a Slecht Praha(Genetics andplant Breeding)3279-94. 部田英雄、日浦運(yùn)治，1962，“對于赤霉病的抵抗性的品種間差異、關(guān)于大麥耐病性的研究第13報(bào)”農(nóng)學(xué)研究49177-187[非專利文獻(xiàn)4]武田和義、部田英雄，1989，“大麥中的赤霉病測定法的開發(fā)和耐病性品種的檢索”育種學(xué)雜志39[非專利文獻(xiàn)5]Zhu，H.，L.Gilchrist，P.Hayes，A.Kleinhofs，D.Kudruna，Z.Liu，L.Porm，B.Steffenson，T.Toojinda，P.Vivar.1999.“Does function follow form？Principal QTLs for Fusarium head bright(FHB)resistance are coincident withQTLs for inflorescence trits and plant height in a doubled-haploide populaionof barley.”Theor Appl Genet 991221-1232. 崛真雄，1985，“小麥和大麥赤霉病的發(fā)生生態(tài)和防除法”農(nóng)業(yè)和園藝60431-436[專利文獻(xiàn)1]特開2002-291474號公報(bào)(2002(平成14)年10月8日公開) 特開2003-111593號公報(bào)(2003(平成15)年4月15日公開)雖然對大麥的赤霉病抵抗性品種的抵抗性機(jī)制進(jìn)行了研究，但是對于與大麥的赤霉病抵抗性相關(guān)的基因和抵抗性的詳細(xì)機(jī)理尚未明確。
因此，本發(fā)明是鑒于上述課題而完成的，由于發(fā)現(xiàn)存在于大麥基因組DNA中、而且與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的遺傳標(biāo)記，因此其目的在于提供與大麥赤霉病抵抗性相關(guān)的基因的分離、大麥赤霉病抵抗性的機(jī)理闡明、赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的育種以及赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的判定方法等的利用方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述課題，本發(fā)明人等以由對赤霉病的抵抗性大為相異的大麥品種Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng)(以下有時(shí)稱為“RHI集團(tuán)”))作為材料，進(jìn)行了與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析。
其結(jié)果在2H染色體上檢測出2個(gè)、在5H染色體上檢測出1個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。但是在2H染色體中檢測到的QTL中的1個(gè)與公知的條性基因(vrs1)的位置一致，因此提示vrs1基因多種表達(dá)的可能性。因此，著眼于除此以外的與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)了分別與這些QTL連鎖的遺傳標(biāo)記(DNA標(biāo)記等)。
此外，本發(fā)明人等以如下系統(tǒng)(集團(tuán))作為材料，進(jìn)一步進(jìn)行了與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析，所述系統(tǒng)是上述RHI集團(tuán)、由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey 6(患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(以下稱為“RI2集團(tuán)”)、以及由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的雙單倍體系統(tǒng)(以下將雙單倍體系統(tǒng)簡稱為“DH”，將該系統(tǒng)稱為“DHHS集團(tuán)”)。
其結(jié)果為，重新在RHI集團(tuán)中于2H和4H染色體上、在RI2集團(tuán)中于2H、4H和6H染色體上、在DHHS集團(tuán)中于2H、4H和5H染色體上分別檢測出各一個(gè)QTL。而且發(fā)現(xiàn)與該QTL連鎖的遺傳標(biāo)記。
本發(fā)明是基于上述研究而完成的。即本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的、存在于禾本科植物的基因組DNA中的、與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記，其特征為，位于從上述赤霉病抵抗性因子開始0～10厘摩范圍內(nèi)的距離。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，上述禾本科植物可以是麥類。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，上述麥類可以是大麥。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，其特征為，上述基因組DNA是2H染色體。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第一引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第一引物對是具有序列號1所示的堿基序列的引物和具有序列號2所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以位于從上述赤霉病抵抗性因子開始約0厘摩的距離。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第二引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第二引物對是具有序列號3所示的堿基序列的引物和具有序列號4所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以位于從上述赤霉病抵抗性因子開始約0.6厘摩的距離。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以具有序列號8所示的堿基序列或序列號9所示的堿基序列。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第六引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第六引物對是具有序列號22所示的堿基序列的引物和具有序列號23所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第七引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第七引物對是具有序列號24所示的堿基序列的引物和具有序列號25所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第八引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第八引物對是具有序列號26所示的堿基序列的引物和具有序列號27所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，其特征為，上述基因組DNA可以是5H染色體。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第三引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第三引物對是具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號6所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以位于從上述赤霉病抵抗性因子開始約9厘摩的距離。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以具有序列號10所示的堿基序列或序列號11所示的堿基序列。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第四引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第四引物對是具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號7所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以位于從上述赤霉病抵抗性因子開始約9厘摩的距離。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以具有序列號12所示的堿基序列或序列號13所示的堿基序列。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第五引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第五引物對是具有序列號21所示的堿基序列的引物和具有序列號20所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以位于從上述赤霉病抵抗性因子開始約2.2厘摩的距離。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第九引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第九引物對可以是具有序列號28所示的堿基序列的引物和具有序列號29所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，還可以使用第十引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十引物對可以是具有序列號30所示的堿基序列的引物和具有序列號31所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，其特征為，上述基因組DNA可以是4H染色體。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十引物對是具有序列號32所示的堿基序列的引物和具有序列號33所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十二引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十二引物對是具有序列號34所示的堿基序列的引物和具有序列號35所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十三引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十三引物對是具有序列號36所示的堿基序列的引物和具有序列號37所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以使用第十四引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十四引物對是具有序列號38所示的堿基序列的引物和具有序列號39所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以使用第十五引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十五引物對是具有序列號40所示的堿基序列的引物和具有序列號41所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以使用第十六引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十六引物對是具有序列號42所示的堿基序列的引物和具有序列號43所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，其特征為，上述基因組DNA可以是6H染色體。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十七引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十七引物對是具有序列號44所示的堿基序列的引物和具有序列號45所示的堿基序列的引物的組合。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記是用于解決上述課題的，除了上述構(gòu)成之外，可以使用第十八引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十八引物對是具有序列號46所示的堿基序列的引物和具有序列號47所示的堿基序列的引物的組合。
上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記存在于禾本科植物、特別是麥類(大麥)的基因組DNA中，而且與赤霉病抵抗性因子(例如，與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖。即在該遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)之間分離而重組的發(fā)生概率低。所以通過使用上述遺傳標(biāo)記，可以得到含有赤霉病抵抗性因子(例如與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因)的DNA片斷、判定有無赤霉病抵抗性、進(jìn)行赤霉病抵抗性禾本科植物(以大麥為代表的麥類)的判定等。
另一方面，本發(fā)明所述的DNA片斷的分離方法包括使用上述任意一種本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記分離目的DNA片斷的工序。由于上述遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子(例如，與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，因此如果以上述DNA為目標(biāo)進(jìn)行克隆，就可以容易地分離出作為目的的DNA片斷。
另一方面，本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，包括在植物的基因組DNA中導(dǎo)入通過上述本發(fā)明所述的DNA片斷的分離方法而得到的含有上述赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的工序。
本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，所述植物可以是禾本科植物。
本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，所述禾本科植物可以是麥類。
本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，所述麥類可以是大麥。
上述任何一種赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，包括在植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中導(dǎo)入含有上述赤霉病抵抗性因子(例如與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的工序。含有赤霉病抵抗性因子(例如與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷具有賦予對赤霉病的抵抗性的特性，因此可以賦予對赤霉病具有患病性的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))以抵抗性或者增強(qiáng)抵抗性。
另一方面，本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物，其是通過上述任意一種本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法而得到的。
上述本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物是通過上述赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法而得到的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))。所以可以防止因赤霉導(dǎo)致的病害，可以實(shí)現(xiàn)該植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))收獲量的提高、品質(zhì)的提高等。
另一方面，本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的判定方法，其特征為，包括檢測上述任意一種本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的工序。
上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子(例如與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，通過檢測該遺傳標(biāo)記，可以容易且高概率地判定試驗(yàn)對象植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))是否是赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))。此外，上述判定方法能夠在幼苗階段進(jìn)行判斷，無需花費(fèi)勞力，可以進(jìn)行迅速的判定。
另一方面，本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的判定試劑盒，其是為了進(jìn)行上述赤霉病抵抗性植物的判定方法而使用的。
通過將為了進(jìn)行上述赤霉病抵抗性植物的判定方法而必需的試劑、酶類試劑盒化，可以構(gòu)成赤霉病抵抗性植物的判定試劑盒。由此，通過該赤霉病抵抗性植物的判定試劑盒，可以發(fā)揮更簡便地判定(辨別)赤霉病抵抗性植物的作用。
另一方面，本發(fā)明所述的基因檢測器具，其特征為，固定有上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記中的至少一個(gè)或更多個(gè)。
對于上述本發(fā)明所述的基因檢測器具，使其與由試驗(yàn)對象植物制成的探針反應(yīng)，通過檢測此時(shí)發(fā)出的信號，可以容易且同時(shí)檢測多個(gè)本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記。因此，該遺傳基因檢測器具可以作為本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性的裝置使用，例如發(fā)揮可以容易地進(jìn)行赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物)的判定的作用。
另一方面，本發(fā)明所述的引物組，其是為了檢測上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記而使用的引物組，其特征為，至少包含2個(gè)或更多個(gè)具有序列號1～7和序列號20～47中的任意一種所示的堿基序列的引物。
通過上述本發(fā)明所述的引物對，可以通過PCR等擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記。因此，通過檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，發(fā)揮可以容易地進(jìn)行例如赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定的作用。
本發(fā)明的其他目的、特征及優(yōu)點(diǎn)通過如下所示的記載可充分明確。本發(fā)明的好處在下面的說明中明確。


圖1(a)是表示2H染色體上的DNA標(biāo)記(MM314、FM677)和2H-2因子的位置關(guān)系圖。
圖1(b)是表示5H染色體上的DNA標(biāo)記(FM426、MM1057)和5H-1因子的位置關(guān)系圖。
圖2(a)是表示抵抗性型(Harbin2)的FM677的全堿基序列(序列號8)圖。
圖2(b)是表示患病性型(Turkey6)的FM677的全堿基序列(序列號9)圖。
圖2(c)是表示抵抗性型(Russia6)的FM426的全堿基序列(序列號10)圖。
圖2(d)是表示患病性型(H.E.S.4)的FM426的全堿基序列(序列號11)圖。
圖3(a)是表示對大麥的2H染色體進(jìn)行與大麥的赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析(CIM)的結(jié)果圖。
圖3(b)是表示對大麥的5H染色體進(jìn)行與大麥的赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析(CIM)的結(jié)果圖。
圖4是表示實(shí)施例2中的PCR反應(yīng)條件的圖。
圖5(a)是使用序列號1和2所記載的引物，將源自Russia6、H.E.S.4及RI系統(tǒng)的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR時(shí)得到PCR產(chǎn)物，對其進(jìn)行電泳的結(jié)果的照片圖。
圖5(b)是使用序列號5和7所記載的引物，將源自Russia6、H.E.S.4及RI系統(tǒng)的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR時(shí)得到PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步進(jìn)行HhaI消化，對所得之物進(jìn)行電泳的結(jié)果的照片圖。
圖6是表示以DNA標(biāo)記為指標(biāo)判斷是否是赤霉病抵抗性大麥的結(jié)果與赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)的關(guān)系的柱形圖。
圖7是表示對遺傳標(biāo)記“MM1057”進(jìn)行AFLP解析后進(jìn)行多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖8是表示在實(shí)施例5中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“MMtgaEatc128”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖9是表示在實(shí)施例6中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“FMgcgEatc530”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖10是表示在實(shí)施例7中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“FXLRRfor_XLRRrev119”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖11是表示在實(shí)施例8中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“FmacgEcgt288”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖12是表示在實(shí)施例9中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“HVM67”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖13是表示在實(shí)施例10中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“FMataEagc408”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖14是表示在實(shí)施例11中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“HVM11”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖15是表示在實(shí)施例12中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“Bmag125”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖16是表示在實(shí)施例13中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“k04002”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖17是表示在實(shí)施例14中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“k05042”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖18是表示在實(shí)施例15中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“k03289”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖19是表示在實(shí)施例16中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“HvLOX”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖20是表示在實(shí)施例17中進(jìn)行遺傳標(biāo)記“k00835”的多態(tài)性檢測的結(jié)果的電泳圖。
圖21是表示遺傳標(biāo)記“k05042”中的春名二條與H602之間的SNP和SNP周圍的堿基序列的圖。
圖22是表示遺傳標(biāo)記“k03289”中的春名二條與H602之間的SNP和SNP周圍的堿基序列的圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)圖1～7說明本發(fā)明的一種實(shí)施方式，如下所述，但本發(fā)明并不限于此。
本發(fā)明涉及與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記(例如DNA標(biāo)記)及其利用的一個(gè)例子。下面分別對其進(jìn)行說明。
1.本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記存在于禾本科植物(麥類(例如大麥))的基因組DNA中，與赤霉病抵抗性因子連鎖。
在本發(fā)明中，麥類是指如大麥、小麥、黑麥、黑小麥等。
<1-1.赤霉病和赤霉病抵抗性因子>
“赤霉病”是指如上所述的鏈孢菌屬菌類感染到麥類中而引起的病害。該赤霉病不僅引起充實(shí)不良·減產(chǎn)，而且產(chǎn)生霉毒(例如脫氧瓜萎鐮菌醇)，如果將發(fā)病的麥子食用或用作飼料就會(huì)引起中毒癥狀的重大病害。
大麥中存在對于所述赤霉病顯示有抵抗性的品種。雖然赤霉病抵抗性的詳細(xì)機(jī)理尚未明確，但是通過以往研究提示其與條性·穗長·出穗時(shí)期·穗軸節(jié)間長等性狀相關(guān)。而且大麥沒有對赤霉病的免疫抵抗性，據(jù)稱較少基因是與其抵抗性相關(guān)的數(shù)量性狀。這樣，在本發(fā)明中，將存在于大麥基因組DNA中的、具有賦予對赤霉病的抵抗性的特性的基因或者與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)稱為“赤霉病抵抗性因子”。
作為赤霉病抵抗性因子的檢索方法，優(yōu)選QTL解析。如上所述，本發(fā)明人等為了檢索該赤霉病抵抗性因子，進(jìn)行與大麥赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析。具體如下。材料使用由對赤霉病的抵抗性大為不同的大麥品種Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交育種而得到的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))而進(jìn)行。此外，赤霉病抵抗性的評價(jià)方法用改變“切穗檢測法”(參照非專利文獻(xiàn)4)的0(抵抗性)～10(患病性)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價(jià)。此外，在解析算法中使用simple interval mapping(SIM)和composite interval mapping(CIM)，在解析軟件中分別使用MAPMAKER/QTL和QTL Cartographer進(jìn)行。
所述QTL解析的結(jié)果為，在大麥的2H染色體上檢測出2個(gè)、在5H染色體上檢測出1個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。在大麥的2H染色體中檢測到的QTL中的1個(gè)與公知的條性基因(vrs1)的位置一致，因此提示vrs1基因多種表達(dá)的可能性。該結(jié)果支持目前存在的對赤霉病的抵抗性與條性相關(guān)的結(jié)果。然而，上述vrs1基因存在于除QTL以外的基因位點(diǎn)上，其對于赤霉病抵抗性因子是未知的，認(rèn)為存在除條性基因以外的赤霉病抵抗性因子。在此，將特別是存在于大麥2H染色體上的、與vrs1基因位置不同的基因位點(diǎn)上的赤霉病抵抗性因子命名為“2H-2因子”，位于大麥的5H染色體上的將其命名為“5H-1因子”。另外，將存在于大麥2H染色體上的與vrs1基因位置一致的赤霉病抵抗性因子簡稱為“2H-1因子”。
<1-2.遺傳標(biāo)記>
發(fā)明人等根據(jù)制成的高密度連鎖圖的信息，檢索位于上述赤霉病抵抗性因子2H-2因子、5H-1因子的基因位點(diǎn)附近的遺傳標(biāo)記，特別是與上述赤霉病抵抗因子密切連鎖的遺傳標(biāo)記，即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記。此外，進(jìn)行該遺傳標(biāo)記的克隆后進(jìn)行STS化，由該信息設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各個(gè)遺傳標(biāo)記的引物。
更具體而言，發(fā)現(xiàn)了作為與2H-2因子連鎖的遺傳標(biāo)記的MM314、FM677。
MM314是使用第一引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，其位于從2H-2因子開始約0厘摩(以下表示為cM)的距離，即位于與2H-2因子幾乎重疊的位置，所述第一引物對是具有示為AGAGATCCCTGCTCAGCTTG(序列號1)的堿基序列的引物和具有示為TCGTATTAAGGCCGCATAGG(序列號2)的堿基序列的引物的組合。
FM677是使用第二引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，其位于從2H-2因子開始約0.6cM的距離，所述第二引物對是具有示為GCACGTAGCGTTCAACATCA(序列號3)的堿基序列的引物和具有示為AACTTTTCCCAACCCTTTCC(序列號4)的堿基序列的引物的組合。
在使用第二引物對進(jìn)行擴(kuò)增的FM677中，存在對赤霉病的抵抗性型和患病性型，堿基序列分別示于序列號8和序列號9中。
另一方面，發(fā)現(xiàn)了作為與5H-1因子連鎖的遺傳標(biāo)記的FM426、MM1057。
FM426是使用第三引物對或第四引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，其位于從5H-1因子開始約9cM的距離，所述第三引物對是具有示為CCGTGTGTCGTCTAGGTCAA(序列號5)的堿基序列的引物和具有示為CAACTTTGGTGGGACGTAGG(序列號6)的堿基序列的引物的組合，而所述第四引物對是具有示為CCGTGTGTCGTCTAGGTCAA(序列號5)的堿基序列的引物和具有示為GTTTTCGCCATCACTCTTCC(序列號7)的堿基序列的引物的組合。
在使用上述第三引物對進(jìn)行擴(kuò)增的FM426中，存在對赤霉病的抵抗性型和患病性型，堿基序列分別示于序列號10和序列號11中。
在使用上述第四引物對進(jìn)行擴(kuò)增的FM426中，存在對赤霉病的抵抗性型和患病性型，堿基序列分別示于序列號12和序列號13中。
MM1057位于從5H-1因子開始約2.2cM的距離。
上述遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子)的位置關(guān)系示于圖1中。圖1(a)表示在2H染色體上的遺傳標(biāo)記和2H-2因子的位置關(guān)系，圖1(b)表示在5H染色體上的遺傳標(biāo)記和5H-1因子的位置關(guān)系。另外，圖中左側(cè)表示染色體上的短臂(5’端)，右側(cè)表示長臂(3’端)。此外，將從2H-2因子或5H-1因子位點(diǎn)到位于短臂側(cè)的遺傳標(biāo)記的位置用負(fù)值表示，到位于長臂側(cè)的遺傳標(biāo)記的位置用正值表示。
由圖1(a)可知，MM314位于與2H-2因子幾乎重疊的位置(約0cM)，F(xiàn)M677位于長臂側(cè)相對于2H-2因子約0.6cM的位置。另一方面，由圖1(b)可知，F(xiàn)M426位于短臂側(cè)相對于5H-1因子約9cM的位置(約-9cM)，MM1057位于長臂側(cè)相對于5H-1因子約2.2cM的位置。
在此，對摩(M)進(jìn)行說明。1摩(M)是指每1次減數(shù)分裂引起平均1次交叉的染色體上的距離單位。例如，2.2cM表示在赤霉病抵抗性因子與遺傳標(biāo)記之間平均每個(gè)染色單體發(fā)生1000分之22次交換。即，此時(shí)表示約2.2％的重組率。
擴(kuò)增時(shí)作為模板使用的基因組DNA可以用以往公知的方法從大麥植物體中提取。具體而言，可以舉出優(yōu)選的例子，即用于從植物體提取基因組DNA的普通方法(參照Murray，M.G.and W.F.Thompson(1980)，Nucleic Acids Res.84321-4325.等)。此外，上述基因組DNA還可以使用根、莖、葉、生殖器官等構(gòu)成大麥植物體的任意組織來進(jìn)行提取。根據(jù)情況，也可以從大麥的愈傷組織中提取。上述生殖器官還包括花器官(含有雄性·雌性生殖器官)及種子?；蚪MDNA的提取使用如大麥的發(fā)芽期的葉來進(jìn)行。其理由可以舉出如下各點(diǎn)，即組織的磨碎較容易、多糖類等雜質(zhì)的混合比例較少、而且可以在短時(shí)間內(nèi)從種子培育成。
以大麥的基因組DNA為模板，使用上述引物的組合來擴(kuò)增的方法，可以采用以往公知的DNA擴(kuò)增法。一般使用PCR法(聚合酶鏈反應(yīng)法)或其改變法。使用PCR法或其改變法時(shí)的反應(yīng)條件沒有特別的限定，可以在與通常相同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。
通過使用本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，可以分離含有赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子)的DNA片斷，通過使用上述DNA片斷，可以用于與大麥赤霉病抵抗性相關(guān)的基因和赤霉病抵抗性機(jī)制的闡明中。此外，通過將上述DNA片斷導(dǎo)入植物(例如以大麥為代表的麥類)的基因組DNA中，可以生產(chǎn)(育種)赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)。
此外，由于上述遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子)連鎖，因此通過檢測在作為試驗(yàn)對象的植物(例如以大麥為代表的麥類)的基因組DNA中的該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，就可以判定該植物(例如以大麥為代表的麥類)是否具有赤霉病抵抗性因子。同樣地，由于與赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子)連鎖，因此通過檢測在作為試驗(yàn)對象的植物(例如以大麥為代表的麥類)的基因組DNA中的該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，可以判定該植物(例如以大麥為代表的麥類)是否是赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)。此外，如果將能夠擴(kuò)增上述遺傳標(biāo)記的引物或固定有上述遺傳標(biāo)記的DNA微陣列試劑盒化，則可以提供植物(例如以大麥為代表的麥類)有無赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒以及赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判定試劑盒。
如上所述，明確本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記可以用于各種用途中。在后面對上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記用途之一例進(jìn)行詳細(xì)說明。
2.本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的利用<2-1.含有本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的分離方法>
如上所述，本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677)與赤霉病抵抗性因子中的2H-2因子連鎖。另一方面，本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(FM426、MM1057)與赤霉病抵抗性因子中的5H-1因子連鎖。因此，通過使用MM314、FM677的遺傳標(biāo)記，可以分離含有2H-2因子的DNA片斷，通過使用FM426、MM1057的遺傳標(biāo)記，可以分離含有5H-1因子的DNA片斷。
使用本發(fā)明的遺傳標(biāo)記來分離含有赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的方法沒有特別的限定，例如可以舉出如下的方法。
對于大麥而言，已制成1種基因組DNA的BAC文庫，現(xiàn)在多個(gè)BAC文庫在開發(fā)中。因此，使用這種BAC文庫，依照以往公知的定位克隆方法，用其赤霉病抵抗性因子和與該因子連鎖的本發(fā)明的遺傳標(biāo)記鑒定含有該標(biāo)記的BAC克隆，由此制成BAC的疊連序列來確定堿基序列，從而最終可以到達(dá)赤霉病抵抗性因子。
另外，分離以上述方法為代表的含有赤霉病抵抗性因子的DNA片斷時(shí)，選擇位于相對于作為目的的赤霉病抵抗性因子盡可能近的遺傳標(biāo)記來使用是優(yōu)選的。這是因?yàn)樵谧鳛槟康牡某嗝共〉挚剐砸蜃雍瓦z傳標(biāo)記之間發(fā)生重組的概率變得更低，能夠更準(zhǔn)確地分離該赤霉病抵抗性因子的緣故。例如，使用MM314(從2H-2因子開始的距離約0cM)、FM677(從2H-2因子開始的距離約0.6cM)分離2H-2因子時(shí)，可以說與FM677相比更優(yōu)選MM314。使用FM426(從5H-1因子開始的距離約9cM)、MM1057(從5H-1因子開始的距離約2.2cM)分離5H-1因子時(shí)，可以說與FM426相比更優(yōu)選MM1057。
<2-2.本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的生產(chǎn)方法以及通過該生產(chǎn)方法得到的赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))>
通過在植物的基因組DNA中導(dǎo)入含有用含有上述本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的分離方法而得到的赤霉病抵抗性因子的DNA片斷，可以生產(chǎn)赤霉病抵抗性植物。此外，特別是通過在禾本科植物的基因組DNA中導(dǎo)入上述DNA片斷，可以生產(chǎn)赤霉病抵抗性禾本科植物。進(jìn)而通過在大麥的基因組DNA中導(dǎo)入上述DNA片斷，可以生產(chǎn)赤霉病抵抗性大麥。
更具體而言，可以通過使用公知的方法(例如土壤桿菌法或基因槍法)導(dǎo)入到植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中，生產(chǎn)赤霉病抵抗性植物。由此，可以得到赤霉病抵抗性品種。例如，在雜志The Plant Journal(1997)11(6)，1369-1376中公開有由Sonia Tingay等人使用Agrobacterium tumefaciens來對大麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法，可以利用該方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)化大麥。
此外，除了大麥以外，導(dǎo)入有含赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的植物沒有特別的限定，例如，可以舉出食用作物、果實(shí)或蔬菜、花·樹、其他含有有效樹木的園藝作物、工藝作物及飼料肥料作物等。另外，在上述的食用作物、園藝作物、工藝作物、飼料肥料作物中分別含有的具體的作物，例如，還詳細(xì)記載于農(nóng)業(yè)大辭典修改第4版(養(yǎng)賢堂，1997年4月30日發(fā)行)的目錄8～16頁中。特別是在麥類(大麥、小麥、黑麥、黑小麥等)植物中赤霉病成為問題，對這樣的植物應(yīng)用本發(fā)明則更為有效。
導(dǎo)入到植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))中的赤霉病抵抗性因子，即使是含有2H-2因子的DNA片斷或含有5H-1因子的DNA片斷中的任意單獨(dú)一者都可以生產(chǎn)出赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))，通過將兩者的DNA片斷(含有2H-2因子的DNA片斷、含有5H-1因子的DNA片斷)導(dǎo)入到同一植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中，可以進(jìn)～步提高對于赤霉病的抵抗性，因此更優(yōu)選。
將存在于2H染色體上的除了2H-2因子之外的赤霉病抵抗性因子2H-1因子(與條性基因vrs1的基因位點(diǎn)一致的赤霉病抵抗性因子)導(dǎo)入到分別單獨(dú)導(dǎo)入有含上述2H-2因子的DNA片斷或含5H-1因子的DNA片斷的植物(例如以大麥為代表的麥類)中，赤霉病抵抗性比單獨(dú)導(dǎo)入時(shí)得到提高。進(jìn)而，將上述2H-1因子導(dǎo)入到導(dǎo)入有含上述2H-2因子的DNA片斷和含5H-1因子的DNA片斷兩者的植物(例如以大麥為代表的麥類)中，赤霉病抵抗性比導(dǎo)入有2種赤霉病抵抗性因子時(shí)進(jìn)一步提高。
本發(fā)明人等使用解析軟件(MAPMAKER/QTL及QTL Cartographer)計(jì)算比較下述情況的大麥的赤霉病抵抗性的效果導(dǎo)入有兩者的DNA片斷的情況以及導(dǎo)入有上述3種赤霉病抵抗性因子的情況，與對于單獨(dú)導(dǎo)入有含上述2H-2因子的DNA片斷或含5H-1因子的DNA片斷中的任意一種DNA片斷時(shí)的情況進(jìn)行比較。以下在表1中示出使用MAPMAKER/QTL進(jìn)行解析所得結(jié)果的一個(gè)例子。


表1表示單獨(dú)導(dǎo)入有含上述2H-2因子的DNA片斷或含5H-1因子的DNA片斷中的任意一種DNA片斷時(shí)的使大麥赤霉病抵抗性提高的效果以及導(dǎo)入有兩者的DNA片斷時(shí)的情況。進(jìn)而，單獨(dú)導(dǎo)入有含2H-1因子的DNA片斷、或者含2H-2因子的DNA片斷、或者含5H-1因子的DNA片斷中的任意一種DNA片斷時(shí)的使大麥赤霉病抵抗性提高的效果，以及全部導(dǎo)入有上述3種DNA片斷時(shí)的情況。
由表1結(jié)果可知，單獨(dú)導(dǎo)入有含上述2H-2因子的DNA片斷時(shí)的使大麥赤霉病抵抗性提高的效果為1.8076，單獨(dú)導(dǎo)入有含5H-1因子的DNA片斷時(shí)的使大麥赤霉病抵抗性提高的效果為1.1733，與此相對，導(dǎo)入有兩者的DNA片斷時(shí)，可見達(dá)到2.7338的顯著的累積效果。進(jìn)而，可知加入2H-1因子，通過導(dǎo)入含有3種赤霉病抵抗性因子的DNA片斷，赤霉病抵抗性顯著提高(單獨(dú)導(dǎo)入含有2H-1因子的DNA片斷時(shí)為1.3234，單獨(dú)導(dǎo)入含有2H-2因子的DNA片斷時(shí)為1.5319，單獨(dú)導(dǎo)入含有5H-1因子的DNA片斷時(shí)為1.6083，導(dǎo)入含有上述3種因子的DNA片斷時(shí)為3.6759)。另外，表1中的“使赤霉病抵抗性提高的效果”的值越大則表示該效果越大。
通過由上述方法得到的本發(fā)明所述的以赤霉病抵抗性大麥為代表的赤霉病抵抗性植物，可以回避以往因赤霉病引起的品質(zhì)·收獲量的降低、食用感染了赤霉病的植物而導(dǎo)致的對人體·家畜的危害，對農(nóng)業(yè)·畜牧業(yè)等極為有效。還可以改善糧食困難的問題。
另外，上述“赤霉病抵抗性植物”、“赤霉病抵抗性禾本科植物”及“赤霉病抵抗性大麥”是指，包括通過賦予對赤霉病完全沒有抵抗性的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))以赤霉病抵抗性而生產(chǎn)的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))以及通過對原來對赤霉病具有抵抗性的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))進(jìn)一步增強(qiáng)赤霉病抵抗性而生產(chǎn)的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))。
<2-3.本發(fā)明所述的與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記的檢測方法>
如上所述，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記，進(jìn)行了該遺傳標(biāo)記擴(kuò)增用引物的設(shè)計(jì)。
具體而言，MM314是使用第一引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第一引物對是具有示為AGAGATCCCTGCTCAGCTTG(序列號1)的堿基序列的引物和具有示為TCGTATTAAGGCCGCATAGG(序列號2)的堿基序列的引物的組合。該遺傳標(biāo)記與2H-2因子連鎖。
FM677是使用第二引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第二引物對是具有示為GCACGTAGCGTTCAACATCA(序列號3)的堿基序列的引物和具有示為AACTTTTCCCAACCCTTTCC(序列號4)的堿基序列的引物的組合。該遺傳標(biāo)記與2H-2因子連鎖。
FM426是使用第三引物對或第四引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第三引物對是具有示為CCGTGTGTCGTCTAGGTCAA(序列號5)的堿基序列的引物和具有示為CAACTTTGGTGGGACGTAGG(序列號6)的堿基序列的引物的組合，而所述第四引物對是具有示為CCGTGTGTCGTCTAGGTCAA(序列號5)的堿基序列的引物和具有示為GTTTTCGCCATCACTCTTCC(序列號7)的堿基序列的引物的組合。該遺傳標(biāo)記與5H-1因子連鎖。
由此，通過使用上述第一引物對～第四引物對中的任意一組進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可以檢測出與赤霉病抵抗性因子(2H-2因子或5H-1因子)連鎖的遺傳標(biāo)記。特別是通過使用第一引物對可以檢測出與2H-2因子連鎖的MM314，通過使用第二引物對可以檢測出與2H-2因子連鎖的FM677。通過使用第三引物對或第四引物對還可以檢測出與5H-1因子連鎖的FM426。
因此，通過使用上述4組引物對中的至少一組可以檢測出上述任一種遺傳標(biāo)記，通過使用第一引物對和/或第二引物對，并且通過使用第三引物對和/或第四引物對，可以檢測出2H-2因子和5H-1因子兩者，因而更優(yōu)選。
通過進(jìn)行與上述赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記的檢測，可以進(jìn)行如下所示的有無赤霉病抵抗性因子的判定和赤霉病抵抗性植物的判定。另外，檢測上述與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記的具體方法在“有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定方法”和“赤霉病抵抗性植物的判定方法”中合并說明。
(2-3-1.有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定方法)有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定方法(以下有時(shí)稱為“本抵抗性因子判定方法”)是如下進(jìn)行的，即在用與上述本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426、MM1057)的檢測方法中檢測到的遺傳標(biāo)記中，對至少1個(gè)遺傳標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測。所述遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子連鎖，因此只要作為試驗(yàn)對象的植物(例如以大麥為代表的麥類)的基因組DNA中存在赤霉病抵抗性型的遺傳標(biāo)記，就可以高概率地判定試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)是否具有赤霉病抵抗性因子。在此，通過檢測MM314或FM677的多態(tài)性可以判定有無2H-2因子，通過檢測FM426或MM1057的多態(tài)性可以檢測5H-1因子。
另外，本抵抗性因子判定方法可以對原來的大麥進(jìn)行，也可以對用藥物制劑等進(jìn)行了變異處理的大麥或通過雜交育種而得到的大麥(植物)進(jìn)行。此外，可以應(yīng)用于上述2-2中說明的導(dǎo)入含有赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子)的DNA片斷而成的大麥和植物。因此，本抵抗性因子判定方法可以廣泛應(yīng)用于植物(例如以大麥為代表的麥類)中。
在此，本抵抗性因子判定方法的判定準(zhǔn)確度(概率)如下。位于從赤霉病抵抗性因子開始2.2cM距離的遺傳標(biāo)記在赤霉病抵抗性因子與遺傳標(biāo)記之間平均每個(gè)染色單體發(fā)生1000分之22次交換。即以約2.2％的概率發(fā)生重組。因此，在該遺傳標(biāo)記中，只要檢測出赤霉病抵抗性型的遺傳標(biāo)記，就可以說以97.8％的概率具有赤霉病抵抗性因子。因此，可以說赤霉病抵抗性因子與遺傳標(biāo)記的距離越近，就可以高概率地判定有無赤霉病抵抗性因子。
因此，根據(jù)上述理由，檢測到多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，只要是上述遺傳標(biāo)記中的任意一種都可以判定有無赤霉病抵抗性因子，但優(yōu)選檢測位于相對于各赤霉病抵抗性因子盡可能近的遺傳標(biāo)記。即用本抵抗性因子判定方法檢測2H-2因子時(shí)，可以說比起FM677(從2H-2因子開始的距離約0.6cM)更優(yōu)選MM314(從2H-2因子開始的距離約0cM)。特別是MM314與2H-2因子幾乎一致，因此只要檢測到該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性就可以幾乎100％概率地進(jìn)行判定。檢測5H-1因子時(shí)，可以說比起FM426(從5H-1因子開始的距離約9cM)更優(yōu)選MM1057(從5H-1因子開始的距離約2.2cM)。
此外，本檢測方法也可以檢測多個(gè)遺傳標(biāo)記的多態(tài)性。特別是為了使判定準(zhǔn)確度(概率)提高，可以選擇具有夾持赤霉病抵抗性因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測。在此，具有夾持2H-2因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記的組合為MM314和FM677(參照圖1(a))。另一方面，具有夾持5H-1因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記的組合為FM426和MM1057(參照圖1(b))。
以FM426和MM1057為例，分別單獨(dú)地檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性時(shí)以及檢測兩者的多態(tài)性時(shí)，對本抵抗性因子判定方法的準(zhǔn)確度(概率)進(jìn)行更具體的說明。FM426位于從5H-1因子開始短臂側(cè)約9cM的位置，單獨(dú)檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性時(shí)的本判定方法的準(zhǔn)確度(概率)為(1-90÷1000)×100＝約91％。另一方面，MM1057位于從5H-1因子開始長臂側(cè)約2.2cM的位置，同樣計(jì)算單獨(dú)地檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性時(shí)的判定本抵抗性因子方法的準(zhǔn)確度(概率)，為97.8％。檢測該2個(gè)遺傳標(biāo)記兩者的多態(tài)性時(shí)，具有(1-(90÷1000)×(22÷1000))×100＝99.802％的高概率，可以判定有無5H-1。因此，在本抵抗性因子判定方法中，優(yōu)選檢測具有夾持上述赤霉病抵抗性因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記來進(jìn)行判定。
在此，在本抵抗性因子判定方法中，遺傳標(biāo)記的檢測可以采用以往公知的DNA擴(kuò)增法。一般可以使用PCR法(聚合酶鏈反應(yīng)法)或其改變法。使用PCR法或其改變法時(shí)的反應(yīng)條件沒有特別的限定，可以在與通常相同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。通過判斷由上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的遺傳標(biāo)記是抵抗性型還是患病性型，可以判定試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)有無赤霉病抵抗性因子。
本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記如上所述，可以通過以下的引物組合進(jìn)行擴(kuò)增。
MM314可以使用第一引物對以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述第一引物對是具有示為AGAGATCCCTGCTCAGCTTG(序列號1)的堿基序列的引物和具有示為TCGTATTAAGGCCGCATAGG(序列號2)的堿基序列的引物的組合。
FM677可以使用第二引物對以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述第二引物對是具有示為GCACGTAGCGTTCAACATCA(序列號3)的堿基序列的引物和具有示為AACTTTTCCCAACCCTTTCC(序列號4)的堿基序列的引物的組合。
FM426可以使用第三引物對或第四引物對以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所述第三引物對是具有示為CCGTGTGTCGTCTAGGTCAA(序列號5)的堿基序列的引物和具有示為CAACTTTGGTGGGACGTAGG(序列號6)的堿基序列的引物的組合，而所述第四引物對是具有示為CCGTGTGTCGTCTAGGTCAA(序列號5)的堿基序列的引物和具有示為GTTTTCGCCATCACTCTTCC(序列號7)的堿基序列的引物的組合。
以下，在表2中示出通過使用上述引物組合的擴(kuò)增反應(yīng)而被擴(kuò)增的DNA片斷長度(擴(kuò)增片斷大小)。


在通過上述引物的組合被擴(kuò)增的DNA片斷上，存在以赤霉病抵抗性大麥品種的Russia6、Harbin2等作為模板時(shí)被擴(kuò)增的抵抗性型(多態(tài)性)以及以赤霉病患病性大麥品種的H.E.S.4、Turkey6等作為模板時(shí)被擴(kuò)增的患病性型(多態(tài)性)。在本抵抗性因子判定方法中，只要檢測出抵抗性型的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426、MM1057)，就可以判斷試驗(yàn)對象植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))具有赤霉病抵抗性因子。另一方面，只要檢測出患病性型的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426、MM1057)，就可以判斷試驗(yàn)對象植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))沒有赤霉病抵抗性因子。
在此，如MM314時(shí)，在兩者之間擴(kuò)增片斷大小存在差別，通過用瓊脂糖凝膠電泳等比較該片斷大小，可以容易地判斷擴(kuò)增后的M314是抵抗性型還是患病性型。即，確認(rèn)為＞524bp的擴(kuò)增片斷時(shí)，可知抵抗性型的MM314被擴(kuò)增，可以判斷試驗(yàn)對象植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))具有赤霉病抵抗性因子。另一方面，確認(rèn)為＞581bp的擴(kuò)增片斷時(shí)，可知患病性型的MM314被擴(kuò)增，可以判斷試驗(yàn)對象植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))沒有赤霉病抵抗性因子。在后述的實(shí)施例2中進(jìn)一步對此進(jìn)行說明。
然而，對于FM677、FM426，由表2可知沒有擴(kuò)增片斷差別，因此用瓊脂糖凝膠電泳等難以判斷被擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記是抵抗性型還是患病性型。在這種情況下，對擴(kuò)增片斷進(jìn)行測序，可以由該堿基序列信息確認(rèn)是抵抗性型還是患病性型來進(jìn)行判斷。或者，也可以由遺傳標(biāo)記的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)信息來判斷擴(kuò)增片斷是抵抗性型還是患病性型。
利用上述堿基序列信息和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)信息，用圖2具體說明判斷擴(kuò)增片斷是抵抗性型還是患病性型的方法。圖2(a)表示抵抗性型(Harbin2)的FM677的全堿基序列(序列號8)，圖2(b)表示患病性型(Turkey6)的FM677的全堿基序列(序列號9)。圖2(c)表示抵抗性型(Russia6)的FM426的全堿基序列(序列號10)，圖2(d)表示患病性型(H.E.S.4)的FM426的全堿基序列(序列號11)。圖2(a)和(b)中的下劃線部分表示上游引物(序列號3)的設(shè)定部分，雙下劃線部分表示下游引物(序列號4的互補(bǔ)序列)的設(shè)定部分。另一方面，圖2(c)和(d)的下劃線部分表示上游引物(序列號5)的設(shè)定部分，雙下劃線部分表示下游引物(序列號6的互補(bǔ)序列)的設(shè)定部分，波形下劃線部分表示下游引物(序列號7的互補(bǔ)序列)的設(shè)定序列。圖2(a)～(d)中的用四邊框符號表示的堿基表示抵抗性型和患病性型之間的堿基序列的不同所在。因此，只要進(jìn)行通過擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷的序列測定，就可以判斷該擴(kuò)增片斷是抵抗性型還是患病性型。
此外，圖2(b)中的虛線部分表示限制性內(nèi)切酶AluI的識別序列，圖2(c)中的虛線部分表示限制性內(nèi)切酶HhaI的識別序列，圖2(d)中的虛線部分表示限制性內(nèi)切酶AciI的識別序列。圖2(b)用箭頭表示的位置表示限制性內(nèi)切酶AluI的切斷位置，圖2(c)用箭頭表示的位置表示限制性內(nèi)切酶HhaI的切斷位置，圖2(d)用箭頭表示的位置表示限制性內(nèi)切酶AciI的切斷位置。由此可知抵抗性型的FM677沒有AluI位點(diǎn)，患病性型的FM677存在1個(gè)AluI位點(diǎn)。另一方面，可知抵抗性型的FM426存在1個(gè)HhaI位點(diǎn)，患病性型的FM426存在1個(gè)AciI位點(diǎn)。
根據(jù)這些信息，對通過使用序列號3和序列號4所示的第二引物對的擴(kuò)增反應(yīng)，即對通過為了檢測FM677而進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)所得擴(kuò)增片斷用AluI消化時(shí)，只要不被切斷而僅檢測出208bp的片斷就可以判斷是抵抗性型的FM677，只要被切斷1處而檢測出118bp和90bp的片斷就可以判斷是患病性型的FM677。
另一方面，對通過使用序列號5和序列號6所示的第三引物對的擴(kuò)增反應(yīng)，即對通過為了檢測FM426而進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)所得擴(kuò)增片斷(335bp)用HhaI消化時(shí)，只要被切斷1處而檢測出194bp和141bp的片斷就可以判斷是抵抗性型的FM426，只要不被切斷而僅檢測出335bp的片斷就可以判斷是患病性型的FM426。
反之，對以同樣的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增片斷用AciI消化時(shí)只要不被切斷而僅檢測出335bp的片斷就可以判斷是抵抗性型的FM426，只要被切斷1處而檢測出196bp和139bp的片斷就可以判斷是患病性型的FM426。
此外，即使使用序列號5和序列號7所示的第四引物對的擴(kuò)增反應(yīng)也可以檢測FM426。對由該擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增片斷(254bp)用HhaI消化時(shí)，只要被切斷1處而檢測出194bp和60bp的片斷就可以判斷是抵抗性型的FM426，只要不被切斷而僅檢測出254bp的片斷就可以判斷是患病性型的FM426。
反之，對以同樣的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增片斷用AciI消化時(shí)只要不被切斷而僅檢測出254bp的片斷就可以判斷是抵抗性型的FM426，只要被切斷1處而檢測出196bp和58bp的片斷就可以判斷是患病性型的FM426。
在后述的實(shí)施例2中對上述情況進(jìn)行更具體的說明。
此外，檢測遺傳標(biāo)記的多態(tài)性的方法，還可以使用AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphisms)分析。以下對本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記MM1057進(jìn)行AFLP分析，對檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行說明。
AFLP分析的順序沒有特別的限定，例如，可以依照文獻(xiàn)(Pieter Vos，Rens Hogers，Marjo Bleeker，Martin Reijans，Theo van de Lee，MirandaHornes，Adrie Frijters，Jerina Pot，Johan Peleman，Martin Kuiper and MarcZabeau.(1995)AFLPa new technique for DNA fingerprinting.Nucleic AsidsResearch.23214407-4414.)的方法或其改變法進(jìn)行。以下示出發(fā)明人等對遺傳標(biāo)記MM1057進(jìn)行AFLP分析的一個(gè)例子。
對50ng的基因組DNA用各1.5U的EcoRI(TAKARABIO公司制)和MseI(NEW ENGLAND Biolabs公司制)在合計(jì)25μl的反應(yīng)體系中于37℃下進(jìn)行雙消化12小時(shí)。在用限制性內(nèi)切酶處理后的DNA上將5μM的EcoRI連接物(堿基序列示于序列號14和序列號15中)及50μM的MseI連接物(堿基序列示于序列號16和序列號17中)用25U的T4連接酶(TAKARABIO公司制)于37℃下進(jìn)行3小時(shí)連接。將上述連接后的DNA片斷用EcoRI通用引物(堿基序列示于序列號18中)和MseI通用引物(堿基序列示于序列號19中)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。在0.06ng/μl的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)溶液中，使用具有序列號20所示的堿基序列的EcoRI的選擇引物和具有序列號21所示的堿基序列的MseI的選擇引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外，將上述具有序列號20所示的堿基序列的EcoRI的選擇引物和具有序列號21所示的堿基序列的MseI的選擇引物的組合特別稱為“第五引物對”。
對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)而得到的DNA片斷進(jìn)行電泳，所得結(jié)果示于圖7中。圖7中帶有“R”的泳道是表示對赤霉病抵抗性大麥品種Russia6進(jìn)行上述AFLP分析所得的結(jié)果圖，同圖中帶有“H”的泳道是表示對赤霉病患病性大麥品種H.E.S.4進(jìn)行上述AFLP分析所得的結(jié)果圖。其他泳道表示對由Russia6和H.E.S.4雜交育種得到的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))進(jìn)行上述AFLP分析得到的結(jié)果。
比較圖7的Russia6的結(jié)果和H.E.S.4的結(jié)果，僅在赤霉病抵抗性大麥品種Russia6中確認(rèn)有約1057bp(用同圖中的箭頭表示)的DNA片斷。即在赤霉病抵抗性品種和赤霉病患病性品種中具有多態(tài)性。將顯示這種多態(tài)性的遺傳標(biāo)記稱為MM1057。因此，只要對RI系統(tǒng)進(jìn)行AFLP分析而確認(rèn)約1057bp大小的DNA片斷，則可以判斷該RI系統(tǒng)具有赤霉病抵抗性因子，反之，沒有確認(rèn)該DNA片斷，則可以判斷該RI系統(tǒng)沒有赤霉病抵抗性因子。另外，圖7中帶有M的泳道是DNA大小標(biāo)記。
(2-3-2.本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的判定方法)與上述有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定方法(本抵抗性因子判定方法)相同，可以判斷試驗(yàn)對象的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))是否有赤霉病抵抗性。由于具有赤霉病抵抗性因子的植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))具有赤霉病抵抗性，因此通過進(jìn)行上述本抵抗性因子判定方法，可以判斷該植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))是否是赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))。換言之，通過用本抵抗性因子判定方法判定有無赤霉病抵抗性因子可以作為赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的判定方法(以下有時(shí)稱為“本判定方法”)。
本判定方法可以用作赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)育種時(shí)的有效的篩選方法。例如，進(jìn)行上述2-2中說明的本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的生產(chǎn)方法時(shí)，可以從多個(gè)轉(zhuǎn)化體候補(bǔ)中容易地篩選導(dǎo)入有含赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的轉(zhuǎn)化體植物(例如以大麥為代表的麥類)。也可以用作對進(jìn)行了其他藥物制劑等的變異處理、雜交等育種處理的植物(例如以大麥為代表的麥類)的篩選方法。
此外，本發(fā)明其他方法如在本判定方法一項(xiàng)中所說明的，可以分別各個(gè)判斷有無2H-2因子、5H-1因子，因此可以區(qū)別是分別單獨(dú)導(dǎo)入有含2H-2因子的DNA片斷或含5H-1因子的DNA片斷的植物(例如以大麥為代表的麥類)、還是導(dǎo)入有兩者的植物(例如以大麥為代表的麥類)，從而進(jìn)行赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判定。
另外，本判定方法的準(zhǔn)確度(概率)與上述本抵抗性因子判定方法一項(xiàng)中所說明的相同。簡要而言，通過檢測位于盡可能靠近赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子)附近的遺傳標(biāo)記，可以更高準(zhǔn)確度(概率)地判定試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)是否是赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)。進(jìn)而，選擇具有夾持赤霉病抵抗性因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測，可以更高準(zhǔn)確度(概率)地判定試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)是否是赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)。
<2-4.本發(fā)明所述的引物組>
本發(fā)明所述的引物組是為了檢測上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記而使用的引物組，其特征為，包含具有序列號1～7和序列號20～47中的任意一種所示的堿基序列的引物中的至少2個(gè)或更多個(gè)。
本發(fā)明所述的引物組中含有的引物的組合沒有特別的限定，例如，優(yōu)選含有如下引物對中的任意引物對的至少1對或更多對具有序列號1所示的堿基序列的引物和具有序列號2所示的堿基序列的引物的組合的第一引物對；具有序列號3所示的堿基序列的引物和具有序列號4所示的堿基序列的引物的組合的第二引物對；具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號6所示的堿基序列的引物的組合的第三引物對；具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號7所示的堿基序列的引物的組合的第四引物對；具有序列號20所示的堿基序列的引物和具有序列號21所示的堿基序列的引物的組合的第五引物對；具有序列號22所示的堿基序列的引物和具有序列號23所示的堿基序列的引物的組合的第六引物對；具有序列號24所示的堿基序列的引物和具有序列號25所示的堿基序列的引物的組合的第七引物對；具有序列號26所示的堿基序列的引物和具有序列號27所示的堿基序列的引物的組合的第八引物對；具有序列號28所示的堿基序列的引物和具有序列號29所示的堿基序列的引物的組合的第九引物對；具有序列號30所示的堿基序列的引物和具有序列號31所示的堿基序列的引物的組合的第十引物對；具有序列號32所示的堿基序列的引物和具有序列號33所示的堿基序列的引物的組合的第十一引物對；具有序列號34所示的堿基序列的引物和具有序列號35所示的堿基序列的引物的組合的第十二引物對；具有序列號36所示的堿基序列的引物和具有序列號37所示的堿基序列的引物的組合的第十三引物對；具有序列號38所示的堿基序列的引物和具有序列號39所示的堿基序列的引物的組合的第十四引物對；具有序列號40所示的堿基序列的引物和具有序列號41所示的堿基序列的引物的組合的第十五引物對；具有序列號42所示的堿基序列的引物和具有序列號43所示的堿基序列的引物的組合的第十六引物對；具有序列號44所示的堿基序列的引物和具有序列號45所示的堿基序列的引物的組合的第十七引物對；以及具有序列號46所示的堿基序列的引物和具有序列號47所示的堿基序列的引物的組合的第十八引物對。
本發(fā)明所述的引物組是為了檢測與赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子等)連鎖的遺傳標(biāo)記而使用的引物組。
如上所述，可以通過使用第一引物對擴(kuò)增與2H-2因子連鎖的MM314進(jìn)行檢測，可以通過使用第二引物對擴(kuò)增與2H-2因子連鎖的FM677進(jìn)行檢測?？梢酝ㄟ^使用第三引物對或第四引物對擴(kuò)增與5H-1因子連鎖的FM426進(jìn)行檢測?？梢酝ㄟ^使用第五引物對擴(kuò)增與5H-1因子連鎖的MM1057進(jìn)行檢測。另外，對能夠用第六引物對～第十八引物對進(jìn)行檢測的遺傳標(biāo)記在后面的[實(shí)施方式2]中敘述。
因此，本發(fā)明所述的引物組只要含有上述18對中的至少1組就可以檢測上述任一種遺傳標(biāo)記，例如，本發(fā)明所述的引物組，只要含有第一引物對和第二引物對中的至少1組，第三引物對和第四引物對中的至少1組，就可以擴(kuò)增與2H-2因子連鎖的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677)及5H-1因子連鎖的遺傳標(biāo)記(FM426)兩者、進(jìn)行檢測，因此更優(yōu)選。此外，本發(fā)明所述的引物組如果含有上述全部的引物對，則可以擴(kuò)增本發(fā)明所述的全部遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測，因此最優(yōu)選。
為了能夠檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，在上述的“2-3-1.有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定方法”和“2-3-2.本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物的判定方法”中，本發(fā)明所述的引物組可以作為用于擴(kuò)增DNA的引物使用。因此，通過含有本發(fā)明所述的引物組，可以制成后述的有無赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒和赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判定試劑盒。
<2-5.有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒以及赤霉病抵抗性植物的判定試劑盒>
有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒(以下有時(shí)稱為“本抵抗性因子判定試劑盒”)是用于上述“2-3-1.有無本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子的判定方法”中的試劑盒，其含有作為用于擴(kuò)增遺傳標(biāo)記的引物對的上述“2-4.本發(fā)明所述的引物組”。
因此，如上所述，例如，由于第一引物對被包含在本抵抗性因子判定試劑盒中，因此可以檢測與2H-2因子連鎖的MM314，由于第二引物對被包含在本抵抗性因子判定試劑盒中，因此可以檢測與2H-2因子連鎖的FM677。此外，由于第三引物對或第四引物對被包含在本抵抗性因子判定試劑盒中，因此可以檢測與5H-1因子連鎖的FM426。此外，由于第五引物對被包含在本抵抗性因子判定試劑盒中，因此可以檢測與5H-1因子連鎖的MM1057。
因此，本抵抗性因子判定試劑盒中含有的引物組只要是上述18對中的至少1組，就可以檢測上述任一個(gè)遺傳標(biāo)記。例如，只要含有第一引物對和第二引物對中的至少1組，以及第三引物對、第四引物對和第五引物對中的至少1組，就能夠檢測與2H-2因子連鎖的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677)和5H-1連鎖的遺傳標(biāo)記(FM426、MM1057)兩者，因此更優(yōu)選。此外，如果本發(fā)明所述的引物組含有上述全部引物對，則由于能夠檢測本發(fā)明所述的全部遺傳標(biāo)記而最為優(yōu)選。
在其他本判定試劑盒中還可以含有用于進(jìn)行PCR的酶、試劑類，還可以含有用于制備成為模板的基因組DNA所必需要的試劑、緩沖液類、離心管，還可以含有檢測目的DNA大小帶所必需要的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426等)或者適當(dāng)?shù)腄NA大小標(biāo)記。
另外，通過與本判定試劑盒相同的構(gòu)成，可以形成赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))的判定試劑盒。對此的原因?yàn)?，如上所述，用本抵抗性因子判定試劑盒判定有無赤霉病抵抗性因子，從而可以判定試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)是否具有赤霉病抵抗性因子，即可以判定是否是赤霉病抵抗性植物(例如禾本科植物(以大麥為代表的麥類))。
<2-6.本發(fā)明所述的基因檢測器具>
本發(fā)明所述的基因檢測器具(例如DNA微陣列)(以下有時(shí)稱為“本基因檢測器具”)是將本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426、MM1057)固定在適當(dāng)?shù)幕?玻璃、硅片、尼龍膜等)上而成的。對于本基因檢測器具，使其與由試驗(yàn)對象植物制成的探針反應(yīng)，檢測此時(shí)產(chǎn)生的信號，由此可以容易且同時(shí)地檢測多個(gè)遺傳標(biāo)記。因此，本基因檢測器具可以用作檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性的裝置。因此，可以用作在有無赤霉病抵抗性因子的判定方法、赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判定方法中的檢測裝置。此外，還可以將本基因檢測器具添加到有無赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒、或者赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判定試劑盒中。另外，在上述試劑盒中也可以含有用于檢測源自基因檢測器具(DNA微陣列)的信號的試劑·器具·裝置等。
可以在本基因檢測器具的基板上固定本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426、MM1057等)中的至少1個(gè)或更多個(gè)的遺傳標(biāo)記。此外，可以固定抵抗性型的遺傳標(biāo)記、患病性型的遺傳標(biāo)記中的任意一方或兩方。進(jìn)而，為了更準(zhǔn)確(概率)地判斷赤霉病抵抗性因子的有無，優(yōu)選固定具有夾持各赤霉病抵抗性因子(2H-2因子、5H-1因子等)的關(guān)系的多個(gè)遺傳標(biāo)記的組合。更具體而言，具有夾持2H-2因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記組合，有MM314和FM677的組合；具有夾持5H-1因子的關(guān)系的遺傳標(biāo)記組合，有FM426和MM1057的組合。
此外，只要將上述組合中的至少1個(gè)或更多個(gè)組合固定在基板上，則可以判定2H-2因子或5H-1因子的有無，能夠檢測2H-2因子和5H-1因子是指，最優(yōu)選將MM314和FM677的組合固定在基板上，而且含有FM426和MM1057的組合。
通過使用固定有上述多個(gè)遺傳標(biāo)記的本基因檢測器具，可以在一次試驗(yàn)中簡便地檢測多個(gè)遺傳標(biāo)記。進(jìn)而可以高準(zhǔn)確度(概率)地進(jìn)行有無赤霉病抵抗性因子的判斷。
另外，在本基因檢測器具中不僅可以固定本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，還可以固定位于其附近的其他遺傳標(biāo)記。
進(jìn)而，優(yōu)選在本基因檢測器具中，將本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記按在大麥染色體上排列的順序進(jìn)行固定，或者給予對應(yīng)于在大麥染色體上排列的順序的序列位置信息后進(jìn)行固定。這是在試驗(yàn)對象為大麥時(shí)可以使檢測準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高的緣故。即，在用以往的DNA微陣列等基因檢測器具的解析中，不能得到對于某位點(diǎn)的信號時(shí)，是不存在所要檢測的遺傳標(biāo)記，還是由于解析實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤而得不到信號，對此，不重新進(jìn)行確認(rèn)就不能進(jìn)行正確地判定。對此，在使用上述本基因檢測器具時(shí)，被排序成能夠確認(rèn)所被固定的遺傳標(biāo)記的染色體上的順序，因此可以容易地判定在上述那樣的實(shí)驗(yàn)中是否有錯(cuò)誤。
具體而言，例如在沒有得到信號的位點(diǎn)前后的位點(diǎn)中獲得了信號。在本發(fā)明所述的陣列中，各位點(diǎn)被排序成能夠確認(rèn)在染色體上的順序。通常，為了在染色體上僅重組在直線排列上緊鄰的基因中的一個(gè)基因，必須在極為相近的距離內(nèi)發(fā)生2次重組。這種現(xiàn)象發(fā)生的概率極低，因此沒有得到信號的結(jié)果，可以判斷是實(shí)驗(yàn)上的錯(cuò)誤引起的。這樣，在本基因檢測器具中，即使得不到對某位點(diǎn)的信號時(shí)，也可以容易地判定是否是實(shí)驗(yàn)上的錯(cuò)誤，因此可以提高解析的準(zhǔn)確度。
另外，本發(fā)明還包括以下發(fā)明。
(1)DNA標(biāo)記，其存在于麥類的基因組DNA中、與赤霉病抵抗性因子連鎖，其特征為，位于從赤霉病抵抗性因子開始約0～9厘摩范圍內(nèi)的距離。
(2)如(1)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，所述麥類是大麥。
(3)如(2)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，所述基因組DNA為2H染色體。
(4)如(1)～(3)任一項(xiàng)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，使用第一引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第一引物對是具有序列號1所示的堿基序列的引物和具有序列號2所示的堿基序列的引物的組合。
(5)如(4)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約0厘摩的距離。
(6)如(1)～(3)任一項(xiàng)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，使用第二引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第二引物對是具有序列號3所示的堿基序列的引物和具有序列號4所示的堿基序列的引物的組合。
(7)如(6)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約0.6厘摩的距離。
(8)如(7)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，具有序列號8所示的堿基序列或序列號9所示的堿基序列。
(9)如(2)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，所述基因組DNA是5H染色體。
(10)如(1)或(2)或(9)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，使用第三引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第三引物對是具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號6所示的堿基序列的引物的組合。
(11)如(10)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約9厘摩的距離。
(12)如(11)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，具有序列號10所示的堿基序列或序列號11所示的堿基序列。
(13)如(1)或(2)或(9)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，使用第四引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第四引物對是具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號7所示的堿基序列的引物的組合。
(14)如(13)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約9厘摩的距離。
(15)如(14)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，具有序列號12所示的堿基序列或序列號13所示的堿基序列。
(16)如(9)所述的DNA標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約2.2厘摩的距離。
(17)DNA片斷的分離方法，其特征為，使用上述(1)～(16)中的任意一種DNA標(biāo)記分離含有赤霉病抵抗性因子的DNA片斷。
(18)赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，在植物的基因組DNA中導(dǎo)入含有用上述(17)的分離方法得到的赤霉病抵抗性因子的DNA片斷。
(19)如(18)所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述植物為麥類。
(20)如(19)所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述麥類為大麥。
(21)赤霉病抵抗性植物，其是用上述(18)～(20)中的任意一種赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法而得到的。
(22)DNA微陣列，其特征為，在基板上固定有選自上述(1)～(16)中的任意一種DNA標(biāo)記中的至少1種DNA標(biāo)記。
(23)DNA標(biāo)記的檢測方法，其是從植物的基因組DNA中檢測與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記的方法，其特征為，將使用選自如下引物對的至少1組引物對進(jìn)行擴(kuò)增得到的DNA作為與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記，所述引物對為具有序列號1所示的堿基序列的引物和具有序列號2所示的堿基序列的引物的組合的第一引物對，具有序列號3所示的堿基序列的引物和具有序列號4所示的堿基序列的引物的組合的第二引物對，具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號6所示的堿基序列的引物的組合的第三引物對，及具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號7所示的堿基序列的引物的組合的第四引物對。
(24)如(23)所述的DNA標(biāo)記的檢測方法，其特征為，使用上述第一引物對和第二引物對中的至少1組，而且使用上述第三引物對和第四引物對中的至少1組。
(25)如(23)或(24)所述的DNA標(biāo)記的檢測方法，其特征為，上述植物是麥類。
(26)如(25)所述的DNA標(biāo)記的檢測方法，其特征為，上述麥類是大麥。
(27)有無赤霉病抵抗性因子的判定方法，其特征為，用上述(23)～(26)中的任意一種檢測方法從植物基因組DNA中檢測DNA標(biāo)記，對于被檢測出的DNA標(biāo)記中的至少1個(gè)DNA標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測。
(28)赤霉病抵抗性植物的判別方法，其特征為，用上述(23)～(26)中的任意一種檢測方法從植物基因組DNA中檢測DNA標(biāo)記，對于被檢測出的DNA標(biāo)記中的至少1個(gè)DNA標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測。
(29)引物組，其特征為，含有如下引物對中的至少1組，所述引物對為具有序列號1所示的堿基序列的引物和具有序列號2所示的堿基序列的引物的組合的第一引物對，具有序列號3所示的堿基序列的引物和具有序列號4所示的堿基序列的引物的組合的第二引物對，具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號6所示的堿基序列的引物的組合的第三引物對，具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號7所示的堿基序列的引物的組合的第四引物對。
(30)如(29)所述的引物對，其特征為，含有所述第一引物和第二引物對中的至少1組，并含有所述第三引物對和第四引物對中的至少1組。
(31)有無赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒，其特征為，其是用于通過對與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測來判定有無赤霉病抵抗性因子的判定方法中，用于擴(kuò)增DNA標(biāo)記的引物對包括(29)或(30)所記載的引物組。
(32)赤霉病抵抗性植物的判別試劑盒，其特征為，其是用于通過對與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測來判定赤霉病抵抗性植物的判定方法中，用于擴(kuò)增DNA標(biāo)記的引物對包括(29)或(30)所記載的引物組。
上述(1)～(16)的DNA標(biāo)記存在于麥類(大麥)的基因組DNA中，而且與赤霉病抵抗性因子連鎖。即，在該DNA標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子之間分離后重組的發(fā)生概率低。因此，通過使用上述DNA標(biāo)記，可以獲得含有例如赤霉病抵抗性因子的DNA片斷，判定有無赤霉病抵抗性因子，進(jìn)行赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判別等。
上述(17)的含有赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的分離方法是包括使用上述(1)～(16)中的任意一種DNA標(biāo)記將該DNA片斷分離。上述DNA標(biāo)記由于與赤霉病抵抗性因子連鎖，因此以上述DNA為目標(biāo)進(jìn)行克隆時(shí)，能夠容易地分離作為目的的DNA片斷。
上述(18)～(20)中的任意一種赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法都包括在植物(麥類、大麥)的基因組DNA中導(dǎo)入含有上述赤霉病抵抗性因子的DNA片斷。赤霉病抵抗性因子是具有給予對赤霉病的抵抗性的特性的基因，因此可以賦予對赤霉病有患病性的植物(麥類、大麥)以抵抗性或者增強(qiáng)抵抗性。
上述(21)的赤霉病抵抗性植物是用上述赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法得到的植物(麥類、大麥)。因此，可以防止赤霉病導(dǎo)致的病害，可以實(shí)現(xiàn)該植物(麥類、大麥)收獲量的提高、品質(zhì)的提高等。
上述(22)的DNA微陣列包括將(1)～(16)所述的DNA標(biāo)記固定在基板上。通過所述的DNA微陣列，可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢測多個(gè)DNA標(biāo)記，可以用少量的勞力用更短的時(shí)間處理更大量的樣品。
在上述(23)的DNA標(biāo)記的檢測方法中，使用第一引物對或第二引物對進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可以檢測存在于2H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記，使用第三引物對或第四引物對進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可以檢測存在于5H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記。
此外，通過(24)所記載的DNA標(biāo)記的檢測方法，由于包括使用上述第一引物對和第二引物對中的至少1組，而且使用上述第三引物對或第四引物對中的至少1組，因此可以檢測存在于2H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記和存在于5H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記。
另外，上述(25)或(26)所記載的DNA標(biāo)記的檢測方法，包括將上述(23)或(24)的檢測方法用于麥類或大麥中。由于檢測的上述DNA標(biāo)記存在于以大麥為代表的麥類的基因組DNA中且與赤霉病抵抗性因子連鎖，因此該DNA標(biāo)記的檢測方法可以優(yōu)選用于以大麥為代表的麥類中。
上述(27)的有無赤霉病抵抗性因子的判定方法為，在用上述(23)～(26)中的任意一種檢測方法從植物的基因組DNA中檢測出的DNA標(biāo)記中，對其中至少1種DNA標(biāo)記檢測多態(tài)性(赤霉病抵抗性型或赤霉病患病性型)，由此判斷試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)中有無赤霉病抵抗性因子。該DNA標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子連鎖，因此如果將該標(biāo)記型作為指標(biāo)，就可以高準(zhǔn)確率地判定赤霉病抵抗性因子的有無。
上述(28)的有無赤霉病抵抗性因子的判定方法為，在用上述(23)～(26)中的任意一種檢測方法從植物的基因組DNA中檢測出的DNA標(biāo)記中，對至少1種DNA標(biāo)記檢測多態(tài)性(赤霉病抵抗性型或赤霉病患病性型)，由此判斷試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)是否是赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)。該DNA標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子連鎖，因此如果將該標(biāo)記型作為指標(biāo)，就可以高準(zhǔn)確率地判定赤霉病抵抗性因子的有無。
上述(29)或(30)的引物組，可以用于與存在于2H染色體中的赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記的檢測和/或與存在于5H染色體中的赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記的檢測中，可以用于有無上述赤霉病抵抗性因子的判定、赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)的判別等中。
上述(31)所述的有無赤霉病抵抗性因子的判定試劑盒，其含有用于擴(kuò)增存在于2H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記和/或存在于5H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記的引物。因此，可以更簡便地進(jìn)行試驗(yàn)對象植物中的有無赤霉病抵抗性因子的判定。
上述(32)所述的赤霉病抵抗性植物的判定試劑盒，其含有用于擴(kuò)增存在于2H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記和/或存在于5H染色體中的與赤霉病抵抗性因子連鎖的DNA標(biāo)記的引物。因此，可以更簡便地進(jìn)行判定試驗(yàn)對象植物(例如以大麥為代表的麥類)是否是赤霉病抵抗性植物(例如以大麥為代表的麥類)。
以下用實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。
為了檢索大麥的赤霉病抵抗性因子，進(jìn)行QTL解析。
<材料>用由對赤霉病的抵抗性大為相異的大麥品種Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交育種而得到的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))進(jìn)行。
<赤霉病抵抗性的評價(jià)方法>
用“切穗檢測法”(參照非專利文獻(xiàn)4)的改變法進(jìn)行評價(jià)。簡單地如下進(jìn)行。
用例行的方法栽培材料，在各自系統(tǒng)的開花期中長出頂葉后在從上開始的第2個(gè)節(jié)間摘取穗，將其豎立在用自來水沖洗后的不銹鋼制的棒(バット)上。對其充分噴霧，噴霧所用懸濁液被調(diào)整到在每個(gè)顯微鏡200倍視野中赤霉病菌的分生孢子為15個(gè)左右。分生孢子接種后2天內(nèi)在25℃·濕度100％的條件下，其后的6天內(nèi)在18℃·濕度90％左右的人工氣象室中進(jìn)行栽培。光條件設(shè)為白晝長14小時(shí)·照度約10000lux。在分生孢子接種后第8天用肉眼觀察，以變成黃褐色的潁花作為患病粒來研究患病性小穗比率，依照表3所示的標(biāo)準(zhǔn)用0(抵抗性)～10(患病性)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價(jià)。


此外，在QTL解析的算法中使用simple interval mapping(SIM)和composite interval mapping(CIM)，解析軟件分別使用MAPMAKER/QTL和QTL Cartographer進(jìn)行。
將上述QTL解析結(jié)果、特別是CIM的結(jié)果示于圖3中。對于相同的集團(tuán)進(jìn)行2次QTL解析，顯示各自的結(jié)果(第1次的結(jié)果用實(shí)線表示，第2次的結(jié)果用虛線表示)。圖3(a)表示對2H染色體的QTL解析結(jié)果，圖3(b)表示對5H染色體的QTL解析結(jié)果。此外，橫軸表示染色體上的位點(diǎn)，左側(cè)為短臂側(cè)(5’端側(cè))而右側(cè)表示長臂側(cè)(3’端側(cè))。另一方面縱軸表示LOD分?jǐn)?shù)(LOD score優(yōu)勢對數(shù)分?jǐn)?shù))。該LOD分?jǐn)?shù)是支配赤霉病抵抗性的性狀的基因(赤霉病抵抗性因子)與其位點(diǎn)的遺傳標(biāo)記連鎖的標(biāo)準(zhǔn)，一般當(dāng)LOD分?jǐn)?shù)大于2或3時(shí)，推定該遺傳標(biāo)記與QTL具有連鎖的關(guān)系。即，可以推定在該基因位點(diǎn)上存在赤霉病抵抗性因子。
根據(jù)圖3(a)的結(jié)果，在大麥的2H染色體上檢測出2個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL；根據(jù)圖3(b)的結(jié)果，在5H染色體上檢測出1個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。在大麥的2H染色體中所檢測出的QTL中的1個(gè)與公知的條性基因(vrs1)的位置(用圖3(a)箭頭表示)一致，因此提示vrs1基因的多種表達(dá)的可能性。該結(jié)果支持目前存在的對赤霉病抵抗性與條性相關(guān)的觀點(diǎn)。然而，在其他QTL基因位點(diǎn)上存在的基因是未知的，認(rèn)為存在除條性基因以外的赤霉病抵抗性因子。在此，特別將存在于大麥2H染色體上的與vrs1基因位置不同的基因位點(diǎn)上的赤霉病抵抗性因子命名為“2H-2因子”，將位于大麥的5H染色體上的赤霉病抵抗性因子命名為“5H-1因子”。
發(fā)明人等根據(jù)制成的高密度連鎖圖的信息，檢索位于上述赤霉病抵抗性因子2H-2因子、5H-1因子的基因位點(diǎn)附近的遺傳標(biāo)記，特別是與上述赤霉病抵抗因子密切連鎖的遺傳標(biāo)記，即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)了作為與2H-2因子連鎖的遺傳標(biāo)記的MM314、FM677。發(fā)現(xiàn)了作為與5H-1因子連鎖的遺傳標(biāo)記的FM426、MM1057。
由于這些遺傳標(biāo)記都是AFLP標(biāo)記，因此分別將其STS化，根據(jù)該序列信息設(shè)計(jì)各個(gè)遺傳標(biāo)記的擴(kuò)增用引物。MM314可以使用序列號1和序列號2所示的第一引物對進(jìn)行擴(kuò)增，F(xiàn)M677可以使用序列號3和序列號4所示的第二引物對進(jìn)行擴(kuò)增。另一方面，F(xiàn)M426可以使用序列號5和序列號6所示的第三引物對或序列號5和序列號7所示的第四引物對進(jìn)行擴(kuò)增。
通過檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，判斷試驗(yàn)對象大麥?zhǔn)欠裼谐嗝共〉挚剐砸蜃?。此外，根?jù)該結(jié)果進(jìn)行赤霉病抵抗性大麥的判定。
<試驗(yàn)對象大麥>
使用由對赤霉病的抵抗性大為相異的大麥品種Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交育種而得到的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))。
<DNA的提取>
用Lanbrige等人的方法(參照Peter Langrige，Angelo Karakousis andJan Nield.(1997)Practical Workshop in Basic Recombinat DNA TechniquesCourse Manual.Waite Agricultural Research Institute University of Adelaide.)從在溫室中培育成的上述RI系統(tǒng)的葉身中提取DNA。DNA濃度用分光光度計(jì)及1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測定，添加RNase和1×TE，調(diào)整到1μg/μl。
<PCR>
PCR反應(yīng)液的組成為，混合5U/μl的TaKaRa Ex TaqTM(TAKARABIO公司制)0.05μl、10×PCR緩沖液1μl、2.5Mm的dNTPs0.8μl、10μM的引物(上游引物、下游引物)各0.25μl、模板DNA1μl，用蒸餾水調(diào)至總量達(dá)到10.0μl。
擴(kuò)增反應(yīng)按圖4所示的條件進(jìn)行。
<HhaI消化>
混合PCR產(chǎn)物10μl、10×M緩沖液(TAKARABIO公司制)1μl、HhaI(TAKARABIO公司制)0.2μl，用蒸餾水調(diào)至總量達(dá)到10μl。
反應(yīng)在37℃下進(jìn)行一晚。
<DNA帶的檢測>
在PCR產(chǎn)物中加入等量的甲酰胺染料，在95℃下加熱5分鐘之后，在冰中急速冷卻。對該樣品用7％聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶二丙烯酰胺＝19∶1、尿素8.5M、0.5×TBE)進(jìn)行電泳(280V、3小時(shí))。DNA的染色用TMVistra Green nucleic acid gel stain(Amersham pharmacia biotechco.)進(jìn)行。此外，對于DNA帶的檢測，通過使用LAS-1000plus(富士FILM公司制)的方法或者使用sil-Best Stain for Protein/PAGE(NACALAITESQUE公司制)的銀染色法(參照菅野康吉，1997，“擴(kuò)增片斷的檢測及標(biāo)記5從銀染色、PCR法最前沿基礎(chǔ)技術(shù)到應(yīng)用”，關(guān)谷剛男·藤永編，共立出版，p85～87)進(jìn)行。
另外，根據(jù)需要，將用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物所得之物用上述方法檢測DNA帶。
<結(jié)果>
使用序列號1及2所記載的引物，把源自Russia6、H.E.S.4及RI系統(tǒng)的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，所得結(jié)果示于圖5(a)中。
圖5(a)是使用具有序列號1和序列號2所示的堿基序列的引物來進(jìn)行PCR所得的結(jié)果，根據(jù)此結(jié)果可檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記MM314的多態(tài)性。從圖5(a)的左側(cè)泳道開始依次表示Russia6、H.E.S.4及各RI系統(tǒng)(RIlines)的結(jié)果。因此，在抵抗性Russia6泳道中所觀察到的＞524bp的片斷為抵抗性型的MM314。因此，只要在RI系統(tǒng)中檢測出所述的＞524bp的片斷，則可以判斷該RI系統(tǒng)很可能含有2H-2因子，進(jìn)而可以判斷該RI系統(tǒng)很可能是赤霉病抵抗性大麥。即，可以判斷在圖5(a)中的則系統(tǒng)中的a1、a2、a4及a5很可能含有2H-2因子，進(jìn)而可以判斷該RI系統(tǒng)很可能是赤霉病抵抗性大麥。
另一方面，可以判斷在患病性的H.E.S.4泳道中所觀察到的＞581bp的片斷的系統(tǒng)很可能沒有2H-2因子，很可能是赤霉病患病性大麥。即，可以判斷圖5(a)中的RI系統(tǒng)中的a3很可能沒有2H-2因子，很可能是赤霉病患病性大麥。
接著，使用具有序列號5和序列號7所示的堿基序列的引物，把源自Russia6、H.E.S.4及RI系統(tǒng)的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，對得到的PCR產(chǎn)物用HhaI消化后所得之物進(jìn)行電泳，所得結(jié)果示于圖5(b)中。
通過使用具有序列號5和序列號7所示的堿基序列的引物進(jìn)行PCR，檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記FM426的多態(tài)性。但是，如表2所示，對于FM426而言，所得到的擴(kuò)增片斷的大小相同，因此即使將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，也不能檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性。因此，如圖2(c)、(d)所示，用切斷赤霉病抵抗性大麥Russia6的擴(kuò)增產(chǎn)物而不切斷對赤霉病具有患病性大麥H.E.S.4的擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶，即用HhaI進(jìn)行消化，確認(rèn)該切斷片斷的大小，由此判斷是否是本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記。
更具體而言，對在該擴(kuò)增反應(yīng)中得到的擴(kuò)增片斷(254bp)用HhaI進(jìn)行消化時(shí)，被切斷一處，只要檢測出194bp和60bp的片斷，則可以判斷是抵抗性型的遺傳標(biāo)記(FM426)；不被切斷，只要僅檢測出254bp的片斷，則可以判斷是患病性型的遺傳標(biāo)記(FM426)。
在圖5(b)中顯示上述各擴(kuò)增片斷的HhaI消化物的電泳結(jié)果，從左側(cè)泳道開始依次表示Russia6、H.E.S.4及各RI系統(tǒng)(RI lines)的結(jié)果。由圖5(b)的結(jié)果可知，在抵抗性大麥品種Russia6的泳道中，確實(shí)觀察到194bp和60bp的片斷，在患病性大麥品種H.E.S.4的泳道中，確實(shí)僅觀察到254bp的片斷。因此，在各RI系統(tǒng)中只要檢測出所述的194bp和60bp的片斷，則可以判斷該RI系統(tǒng)很可能含有5H-1因子，進(jìn)而可以判斷該RI系統(tǒng)很可能是赤霉病抵抗性大麥。即，可以判斷在圖5(b)中的RI系統(tǒng)中的b3及b4很可能含有5H-1因子，進(jìn)而可以判斷該RI系統(tǒng)很可能是赤霉病抵抗性大麥。
另一方面，具有254bp的片斷的RI系統(tǒng)很可能沒有5H-1因子，可以判斷很可能是赤霉病患病性大麥。即，圖5(b)中的RI系統(tǒng)中的b1、b2及b5很可能沒有5H-1因子，可以判斷很可能是赤霉病患病性大麥。
研究以遺傳標(biāo)記為指標(biāo)判定是否是赤霉病抵抗性大麥的結(jié)果與赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)的關(guān)系。
<試驗(yàn)對象大麥>
使用由對赤霉病的抵抗性大為相異的大麥品種Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交育種而得到的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))(n＝121)。
<赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)>
赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)(Scab score)用“切穗檢測法”(參照非專利文獻(xiàn)4)的改變法進(jìn)行評價(jià)。如下簡單地進(jìn)行。
將試驗(yàn)對象大麥(RI系統(tǒng))分別用例行的方法進(jìn)行栽培，在各自系統(tǒng)的開花期中長出頂葉后在從上開始的第2個(gè)節(jié)間摘取穗，將其豎立在用自來水沖洗后的不銹鋼制的棒上。對其充分噴霧，噴霧所用懸濁液被調(diào)整到在每個(gè)顯微鏡200倍視野中赤霉病菌的分生孢子為15個(gè)左右。分生孢子接種后2天內(nèi)在25℃·濕度100％的條件下，隨后的6天內(nèi)在18℃·濕度90％左右的人工氣象室中進(jìn)行栽培。光條件設(shè)為白晝長14小時(shí)、照度約10000lux。在分生孢子接種后第8天用肉眼觀察，以變成黃褐色的潁花作為患病粒來研究患病性小穗比率，依照表3所示的標(biāo)準(zhǔn)用0(抵抗性)～10(患病性)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價(jià)(參照表3)。
<遺傳標(biāo)記的檢測>
與上述實(shí)施例2所示的方法同樣地檢測遺傳標(biāo)記，通過判斷遺傳標(biāo)記是抵抗性型還是患病性型來進(jìn)行。作為判斷對象的赤霉病抵抗性因子是對2H-2因子、5H-1因子及vrs1基因進(jìn)行檢測。
<結(jié)果>
在圖6中示出結(jié)果。圖6的橫軸表示赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)(Scab score)，縱軸表示個(gè)體數(shù)(No.of RI lines)。此外，箭頭表示赤霉病抵抗性的Russia6及赤霉病患病性的H.E.S.4的赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)。此外，圖中涂成黑色的符號表示對于全部3個(gè)遺傳標(biāo)記顯示出赤霉病抵抗性型的RI系統(tǒng)的赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)的結(jié)果，斜線的符號表示對于全部3個(gè)遺傳標(biāo)記顯示出赤霉病患病性型的RI系統(tǒng)的赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)的結(jié)果，空心的符號表示對于遺傳標(biāo)記是混合有抵抗性型、患病性型兩者的RI系統(tǒng)的赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)。
由圖6的結(jié)果可知，全部3個(gè)遺傳標(biāo)記顯示出赤霉病抵抗性型的RI系統(tǒng)的赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)值低，即是赤霉病抵抗性品種的概率高；反之，全部3個(gè)遺傳標(biāo)記顯示出患病性型的RI系統(tǒng)的赤霉病抵抗性分?jǐn)?shù)值高，即是對赤霉病具有患病性品種的概率高。
因此，可知以本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記作為指標(biāo)，判斷是否是赤霉病抵抗性大麥的方法極為有效。
根據(jù)圖8～圖22對本發(fā)明的其他實(shí)施方式進(jìn)行說明，說明如下。
本發(fā)明涉及與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的遺傳位點(diǎn)等)連鎖的遺傳標(biāo)記及其利用之一例。以下分別加以說明。
(1)本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記只要存在于禾本科植物的基因組DNA中，與赤霉病抵抗性連鎖即可。禾本科植物優(yōu)選麥類，特別優(yōu)選大麥。所謂的禾本科植物只要是大麥屬、小麥屬、稻屬等的植物即可，沒有特別的限定。此外，麥類是指如大麥、小麥、黑麥、黑小麥等。
如上所述，“赤霉病”是指鏈孢菌屬菌類感染到麥類中而引起的病害。該赤霉病不僅引起充實(shí)不良·減產(chǎn)，而且產(chǎn)生霉毒(例如脫氧瓜萎鐮菌醇)，如果將發(fā)病的麥子食用或用作飼料就會(huì)引起中毒癥狀的重大病害。
大麥中存在對于所述赤霉病顯示有抵抗性的品種。雖然赤霉病抵抗性的詳細(xì)機(jī)理尚未明確，但是通過以往研究提示其與條性·穗長·出穗時(shí)期·穗軸節(jié)間長等性狀相關(guān)。而且大麥沒有對赤霉病的免疫抵抗性，據(jù)稱較少基因是與其抵抗性相關(guān)的數(shù)量性狀。
所述的數(shù)量性狀通過QTL解析，可以推定與該數(shù)量性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)在染色體上的位置。以下對本發(fā)明人等對大麥開發(fā)出的與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)相連鎖的遺傳標(biāo)記進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記并不限于這些。
本發(fā)明人等為了檢索該赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))，進(jìn)行與大麥赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析。具體如下。材料使用由Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(RHI集團(tuán))、由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(RI2集團(tuán))以及由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的DH系統(tǒng)(DHHS集團(tuán))進(jìn)行。此外，赤霉病抵抗性的評價(jià)方法用改變“切穗檢測法”(參照非專利文獻(xiàn)4)的0(抵抗性)～10(患病性)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價(jià)。此外，在解析算法中使用compositeinterval mapping(CIM)，在解析軟件中分別使用MAPMAKER/QTL和QTLCartographer進(jìn)行。
所述QTL解析的結(jié)果為，在RHI集團(tuán)中于2H、4H染色體上，在RI2集團(tuán)中于2H、4H、6H染色體上，在DHHS集團(tuán)中于2H、4H、5H染色體上分別檢測出1個(gè)QTL。在這些檢測到的QTL中，從RHI集團(tuán)檢測出的2H染色體上所檢測到的QTL與上述[實(shí)施方式1]中所述的QTL一致。
本發(fā)明人等根據(jù)制成的高密度連鎖圖的信息，在各個(gè)分離集團(tuán)中發(fā)現(xiàn)與上述赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記。
從RHI集團(tuán)檢測到的4H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“MMtgaEatc128”、“FMgcgEatc530”。
“MMtgaEatc128”是通過如下方法檢測到的遺傳標(biāo)記在將大麥等禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有示為GACGATGAGTCCTGAG(序列號16)和TACTCAGGACTCAT(序列號17)的堿基序列的MseI連接物以及具有示為CTCGTAGACTGCGTACC(序列號14)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列號15)的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有示為GATGAGTCCTGAGTAA(序列號19)的堿基序列的MseI通用引物和具有示為GACTGCGTACCAATTC(序列號18)的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十一引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十一引物對是具有示為GATGAGTCCTGAGTAAATC(序列號32)的堿基序列的引物和具有示為GACTGCGTACCAATTCTGA(序列號33)的堿基序列的引物的組合，即所謂的AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)。該遺傳標(biāo)記位于從上述4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)(5’末端側(cè))約0.1厘摩(以下表示為cM)的位置。
另外，上述AFLP及以下說明中的AFLP的檢測順序沒有特別的限定，例如，可以依照文獻(xiàn)(Pieter Vos，Rene Hogers，Marjo Bleeker，Martin Reijans，Theo van de Lee，Miranda Hornes，Adrie Frijters，Jerina Pot，Johan Peleman，Martin Kuiper and Marc Zabeau.(1995)AFLPa new technique for DNAfingerprinting.Nucleic Asids Research.23214407-4414.)的方法或其改變法進(jìn)行。此外，PCR等擴(kuò)增反應(yīng)的各種條件，可以在通常的條件下進(jìn)行，或者可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上優(yōu)選采用。
在使用上述第十一引物對進(jìn)行最終擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Russia6型)的長度為約128bp，患病性型(H.E.S.4型)的長度為0bp。換言之，對赤霉病為抵抗性型(Russia6型)得到約128bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(H.E.S.4型)不能得到約128bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述AFLP的檢測操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
“FMgcgEatc530”是通過如下方法檢測到的遺傳標(biāo)記在將大麥等禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有示為GACGATGAGTCCTGAG(序列號16)和TACTCAGGACTCAT(序列號17)的堿基序列的MseI連接物以及具有示為CTCGTAGACTGCGTACC(序列號14)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列號15)的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有示為GATGAGTCCTGAGTAA(序列號19)的堿基序列的MseI通用引物和具有示為GACTGCGTACCAATTC(序列號18)的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十二引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十二引物對是具有GATGAGTCCTGAGTAAATC(序列號34)所示的堿基序列的引物和具有GACTGCGTACCAATTCGCG(序列號35)所示的堿基序列的引物的組合，即所謂的AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)。該遺傳標(biāo)記位于從上述4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始長臂側(cè)(3’末端側(cè))約8.0cM的位置。
在使用上述第十二引物對進(jìn)行最終擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Russia6型)的長度為0bp，患病性型(H.E.S.4型)的長度為約530bp。換言之，對赤霉病為抵抗性型(Russia6型)不能得到約530bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(H.E.S.4型)可以得到約530bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述AFLP的檢測操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
此外，從RI2集團(tuán)檢測到的2H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“FXLRRfor_XLRRrev119”。
“FXLRRfor_XLRRrev119”是用第六引物對進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，即所謂的RGA(Resistant GeneAnalogs)標(biāo)記，所述第六引物對是具有示為CCGTTGGACAGGAAGGAG(序列號22)的堿基序列的引物和具有示為CCCATAGACCGGACTGTT(序列號23)的堿基序列的引物的組合，其位于從上述2H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約0.2cM的距離。另外，上述引物序列是根據(jù)稻白枯葉病抵抗性基因Xa21的堿基序列信息(gene bank Accession NoU37133)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。
另外，上述RGA標(biāo)記的檢測順序沒有特別的限定，例如可以依照如下文獻(xiàn)的方法或其改變法來進(jìn)行，所述文獻(xiàn)為(Chem XM，Line RF，LeungH(1998)Genome scanning for resistance-gene analogs in rice，barley，andwheat by high-resolution electrophoresis.Theor Appl Genet 98345-355)。此外，PCR等擴(kuò)增反應(yīng)條件可以在通常的條件下進(jìn)行，或者可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第六引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)的長度為0bp，患病性型(Turkey6型)的長度為約119bp。換言之，對赤霉病為抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到約119bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(Turkey6型)可以得到約119bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該2H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
此外，從RI2集團(tuán)檢測到的4H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“FMacgEcgt288”、“HVM67”。
“FMacgEcgt288”是通過如下方法檢測到的遺傳標(biāo)記在將大麥等禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有示為GACGATGAGTCCTGAG(序列號16)和TACTCAGGACTCAT(序列號17)的堿基序列的MseI連接物以及具有示為CTCGTAGACTGCGTACC(序列號14)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列號15)的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有示為GATGAGTCCTGAGTAA(序列號19)的堿基序列的MseI通用引物和具有示為GACTGCGTACCAATTC(序列號18)的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十三引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十三引物對是具有示為GATGAGTCCTGAGTAAACG(序列號36)的堿基序列的引物和具有示為GACTGCGTACCAATTCCGT(序列號37)的堿基序列的引物的組合，即所謂的AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)。該遺傳標(biāo)記位于從上述4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約0.3cM的位置。
在使用上述第十三引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)的長度為0bp，患病性型(Turkey6型)的長度為288bp。換言之，對赤霉病為抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到約288bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(Turkey6型)可以得到約288bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述AFLP檢測操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
“HVM67”是使用第十四引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第十四引物對是具有示為GTCGGGCTCCATTGCTCT(序列號38)的堿基序列的引物和具有示為CCGGTACCCAGTGACGAC(序列號39)的堿基序列的引物的組合，其位于從上述4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始長臂側(cè)約46.8cM的距離。該遺傳標(biāo)記是所謂的SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記。
“HVM67”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第十四引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)的長度為160bp，患病性型(Turkey6型)的長度為約140bp。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
此外，從RI2集團(tuán)檢測到的6H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“FMataEagc408”、“HVM11”。
“FMataEagc408”是通過如下方法檢測到的遺傳標(biāo)記在將大麥等禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有示為GACGATGAGTCCTGAG(序列號16)和TACTCAGGACTCAT(序列號17)的堿基序列的MseI連接物以及具有示為CTCGTAGACTGCGTACC(序列號14)和AATTGGTACGCAGTCTAC(序列號15)的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有示為GATGAGTCCTGAGTAA(序列號19)的堿基序列的MseI通用引物和具有示為GACTGCGTACCAATTC(序列號18)的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十七引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十七引物對是具有示為GATGAGTCCTGAGTAAATA(序列號44)的堿基序列的引物和具有示為GACTGCGTACCAATTCAGC(序列號45)的堿基序列的引物的組合，即所謂的AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)。該遺傳標(biāo)記位于從上述6H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約4.1cM的位置。
在使用上述第十七引物對進(jìn)行最終擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)的長度為0bp，患病性型(Turkey6型)的長度為約408bp。換言之，對赤霉病為抵抗性型(Harbin2-row型)不能得到約408bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(Turkey6型)可以得到約408bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述AFLP檢測操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該6H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
“HVM11”是使用第十八引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第十八引物對是具有CCGGTCGGTGCAGAAGAG(序列號46)所示的堿基序列的引物和具有AAATGAAAGCTAAATGGGCGATAT(序列號47)所示的堿基序列的引物的組合，其位于從上述6H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始長臂側(cè)約9.4cM的距離。該遺傳標(biāo)記是所謂的SSR(Simple SequenceRepeat)標(biāo)記。
“HVM11”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第十八引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)的長度為144bp，患病性型(Turkey6型)可觀察到約100bp～160bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該6H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
此外，從DHHS集團(tuán)檢測到的2H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“Bmag125”、“k04002”。
“Bmag125”是使用第七引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第七引物對是具有示為AATTAGCGAGAACAAAATCAC(序列號24)的堿基序列的引物和具有示為AGATAACGATGCACCACC(序列號25)的堿基序列的引物的組合，其位于從上述2H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約0cM的距離。該遺傳標(biāo)記是所謂的SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記。
“Bmag125”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第七引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)的長度為約142bp，患病性型(H602型)可觀察到約134bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該2H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
“k04002”是使用第八引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第八引物對是具有示為GACACAGGACCTGAAGCACA(序列號26)的堿基序列的引物和具有示為CGGCAGGCTCTACTATGAGG(序列號27)的堿基序列的引物的組合，其位于從上述2H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約10cM的距離。上述引物序列是根據(jù)發(fā)明人等單獨(dú)開發(fā)出的大麥EST序列之一(EST克隆名bah32c06，序列號55、56)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。另外，序列號40表示從5’末端側(cè)開始的堿基序列，序列號41表示從3’末端側(cè)開始的堿基序列。
“k04002”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第八引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，抵抗性型(春名二條型)擴(kuò)增片斷的片斷長度為約350bp，與此相對，患病性型(H602型)可觀察到約440bp的擴(kuò)增片斷。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述檢測操作而得到擴(kuò)增產(chǎn)物，可以對對象植物個(gè)體位于該2H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
此外，從DHHS集團(tuán)檢測到的4H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“k05042”、“k03289”。
“k05042”是使用第十五引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第十五引物對是具有ATACATGCATGCCATTGTGG(序列號40)所示的堿基序列的引物和具有ATCCATCCACTGTTTGAGGG(序列號41)所示的堿基序列的引物的組合，其位于從上述4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約1.2cM的距離。上述引物序列是根據(jù)發(fā)明人等單獨(dú)開發(fā)出的大麥EST序列之一(EST克隆名basd1e04，序列號48)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。
“k05042”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第十五引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型和患病性型，兩者之間具有SNP(single nucleotide polymorphism；一堿基多態(tài)性)。圖21表示兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列中含有上述SNP的部分堿基序列。下面為患病性型(春名二條型)的堿基序列(序列號51)，上面為抵抗性型(H602型)的堿基序列(序列號52)。用□括起來的堿基是SNP。下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶HapII的識別序列(CCGG)。由圖21可知，抵抗性型的擴(kuò)增產(chǎn)物由于具有限制性內(nèi)切酶HapII的識別序列(CCGG)而被HapII切斷，由于患病性型擴(kuò)增產(chǎn)物的上述識別部分的C變異成A(CAGG)而不被限制性內(nèi)切酶HapII切斷。即，本遺傳標(biāo)記k05042是CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)標(biāo)記，如果用上述第十五引物對進(jìn)行擴(kuò)增，則通過對擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HapII切斷，可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
另外，本遺傳標(biāo)記所連鎖的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))是赤霉病患病性型品種H602所具有的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。因此，檢測本遺傳標(biāo)記時(shí)，春名二條成為患病性型，H602成為抵抗性型。
“k03289”是使用第十六引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第十六引物對是具有示為TGCTCTGCATTTCATTCAGC(序列號42)的堿基序列的引物和具有示為CAGCGTTACAGGCATTCTCA(序列號43)的堿基序列的引物的組合，其位于從上述4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始長臂側(cè)約4.0cM的距離。上述引物序列是根據(jù)發(fā)明人等單獨(dú)開發(fā)出的大麥EST序列之一(EST克隆名bags3h19，序列號49)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。
“k03289”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第十六引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型和患病性型，兩者之間具有SNP(single nucleotide polymorphism；一堿基多態(tài)性)。圖22表示兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列中含有上述SNP的部分的堿基序列。下面為患病性型(春名二條型)的堿基序列(序列號53)，上面為抵抗性型(H602)的堿基序列(序列號54)。用□括起來的堿基是SNP。下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶SacII的識別序列(CCGCGG)。由圖22可知，患病性的擴(kuò)增產(chǎn)物由于具有限制性內(nèi)切酶SacII的識別序列(CCGCGG)而被SacII切斷，由于抵抗性型擴(kuò)增產(chǎn)物的上述識別部分的C變異成T(CCGTGG)而不被SacII切斷。即，本遺傳標(biāo)記k03289是CAPS標(biāo)記，如果用上述第十六引物對進(jìn)行擴(kuò)增，則通過擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶SacII切斷，可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
另外，本遺傳標(biāo)記所連鎖的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))是赤霉病患病性型品種H602所具有的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。因此，檢測本遺傳標(biāo)記時(shí)，春名二條成為患病性型，H602型成為抵抗性型。
此外，從DHHS集團(tuán)檢測到的5H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的新型遺傳標(biāo)記可以舉出“HvLOX”、“k00835”。
“HvLOX”是使用第九引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第九引物對是具有CAGCATATCCATCTGATCTG(序列號28)所示的堿基序列的引物和具有CACCCTTATTTATTGCCTTAA(序列號29)所示的堿基序列的引物的組合，其位于從上述5H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約0.5cM的距離。該遺傳標(biāo)記是所謂的SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記。
“HvLOX”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第九引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)的長度為約155bp，患病性型(H602型)的長度為約157bp。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該5H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
“k00835”是使用第十引物對以大麥基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，所述第十引物對是具有TCCATGTTCCCAGCTACACA(序列號30)所示的堿基序列的引物和具有AGGAACACATTGGTTCTGGC(序列號31)所示的堿基序列的引物的組合，其位于從上述5H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始長臂側(cè)約1.9cM的距離。上述引物序列是根據(jù)發(fā)明人等單獨(dú)開發(fā)出的大麥EST序列之一(EST克隆名baak46e06，序列號50)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。
“k00835”的擴(kuò)增方法沒有特別的限定，可以在研究最佳條件的基礎(chǔ)上適當(dāng)采用。
在使用上述第十引物對進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)的長度為約900bp，患病性型(H602型)的長度為約880bp。因此，用電泳等公知的方法確認(rèn)通過上述操作所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長度，由此可以對對象植物個(gè)體位于該5H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
在此，對摩(M)進(jìn)行說明。1摩(M)是指每1次減數(shù)分裂引起平均1次交叉的染色體上的距離單位。例如，2.2cM表示在赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))與遺傳標(biāo)記之間每個(gè)染色單體平均發(fā)生1000分之22次交換。即，此時(shí)表示約2.2％的重組率。
但是，擴(kuò)增時(shí)作為模板使用的基因組DNA可以用以往公知的方法從大麥植物體中提取。具體而言，可以舉出優(yōu)選的例子，即用于從植物體提取基因組DNA的普通方法(參照Murray，M.G.and W.F.Thompson(1980)，Nucleic Acids Res.84321-4325.等)。此外，上述基因組DNA還可以使用根、莖、葉、生殖器官等構(gòu)成大麥植物體的任意組織來進(jìn)行提取。根據(jù)情況，也可以從大麥的愈傷組織中提取。上述生殖器官還包括花器官(含有雄性·雌性生殖器官)及種子?；蚪MDNA的提取使用如大麥的發(fā)芽期的葉來進(jìn)行。其理由可以舉出如下各點(diǎn)，即組織的磨碎較容易、多糖類等雜質(zhì)的混合比例較少、而且可以在短時(shí)間內(nèi)從種子培育成。
以大麥的基因組DNA為模板，使用上述引物的組合來擴(kuò)增的方法，可以采用以往公知的DNA擴(kuò)增法。一般使用PCR法(聚合酶鏈反應(yīng)法)或其改變法。使用PCR法或其改變法時(shí)的反應(yīng)條件沒有特別的限定，可以在與通常相同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。
通過使用本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，可以分離含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，通過使用上述DNA片斷，可以用于與大麥赤霉病抵抗性相關(guān)的基因和赤霉病抵抗性機(jī)理的闡明中。此外，通過將上述DNA片斷導(dǎo)入植物(特別是禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中，可以生產(chǎn)(育種)赤霉病抵抗性植物(特別是禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))。
此外，由于上述遺傳標(biāo)記與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，因此通過檢測在作為試驗(yàn)對象的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中的該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，就可以判定該植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))是否具有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。同樣地，由于與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，因此通過檢測在作為試驗(yàn)對象的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中的該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，可以判定該植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))是否是赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))。此外，如果將能夠擴(kuò)增上述遺傳標(biāo)記的引物或固定有上述遺傳標(biāo)記的DNA微陣列試劑盒化，則可以提供植物(例如以大麥為代表的麥類)有無赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的判定試劑盒以及赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的判定試劑盒。
如上所述，明確本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記可以用于各種用途中。下面對上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記用途之一例進(jìn)行詳細(xì)說明。
(2)本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的利用<含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的分離方法>
如上所述，本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記“FXLRRfor_XLRRrev119”、“Bmag125”、“k04002”與在大麥2H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，“MMtgaEatc128”、“FMgcgEatc530”、“FMacgEcgt288”、“HVM67”、“k05042”、“k03289”與在大麥4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，“HvLOX”、“k00835”與在大麥5H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖，“FMataEagc408”、“HVM11”與在大麥6H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖。
因此，通過使用FXLRRfor_XLRRrev119”、“Bmag125”、“k04002”的遺傳標(biāo)記可以分離含有在大麥2H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，通過使用“MMtgaEatc128”、“FMgcgEatc530”、“FMacgEcgt288”、“HVM67”、“k05042”、“k03289”的遺傳標(biāo)記可以分離含有在大麥4H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，通過使用“HvLOX”、“k00835”的遺傳標(biāo)記可以分離含有在大麥5H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，通過使用“FMataEagc408”、“HVM11”的遺傳標(biāo)記可以分離含有在大麥6H染色體上檢測到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷。
分離自然是指克隆目的的DNA片斷，即克隆含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，分離在廣義上還包括通過由雜交F1集團(tuán)回交等，選拔具有含有雙親本中的一方的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的個(gè)體，僅將該基因位點(diǎn)區(qū)域?qū)肽康钠贩N中的同源基因系統(tǒng)的制作。
使用本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記來分離含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的方法沒有特別的限定，例如可以舉出如下的方法。
對于大麥而言，包括本發(fā)明人等不斷開發(fā)的“春名二條”在內(nèi)，已制成2種基因組DNA的BAC文庫，現(xiàn)在多個(gè)BAC文庫在開發(fā)中。因此，使用這種BAC文庫，依照以往公知的定位克隆方法，用赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))和與該基因位點(diǎn)連鎖的本發(fā)明的遺傳標(biāo)記來鑒定含有該標(biāo)記的BAC克隆，由此制成BAC的疊連序列來確定堿基序列，從而最終可以到達(dá)赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。
如上所述，通過將雜交F1與一方的親本進(jìn)行回交，可以將另一親本含有的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷導(dǎo)入目的品種之中來進(jìn)行(廣義的)分離。
另外，分離以上述方法為代表的含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷時(shí)，選擇位于相對于作為目的的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))盡可能近的遺傳標(biāo)記來使用是優(yōu)選的。這是因?yàn)樵谧鳛槟康牡某嗝共〉挚剐砸蜃?與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))和遺傳標(biāo)記之間發(fā)生重組的概率變得更低，能夠更準(zhǔn)確地分離含有該赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的片斷的緣故。
<赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的生產(chǎn)方法以及通過該生產(chǎn)方法得到的赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)>
通過在植物(禾本科植物)的基因組DNA中導(dǎo)入含有通過含有上述本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的分離方法而得到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，可以生產(chǎn)赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)。植物優(yōu)選禾本科植物，而該禾本科植物優(yōu)選麥類，特別優(yōu)選大麥。此外，例如，也可以在除大麥以外的植物(禾本科植物)中導(dǎo)入含有從大麥中分離得到的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，而不僅限于同一屬之間的分離、導(dǎo)入。
導(dǎo)入上述DNA片斷的方法沒有特別的限定，可以適當(dāng)選擇公知的方法來使用。更具體而言，可以通過使用例如土壤桿菌法或基因槍法導(dǎo)入到植物(禾本科植物)的基因組DNA中來生產(chǎn)，由此，可以得到赤霉病抵抗性品種。例如，在雜志The Plant Journal(1997)11(6)，1369-1376中公開有由Sonia Tingay等人使用Agrobacterium tumefaciens來對大麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法，可以利用該方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)化大麥。
此外，通過具有含作為目的的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的植物個(gè)體與要導(dǎo)入該DNA片斷的植物個(gè)體的雜交，也可以將含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷導(dǎo)入到植物中。對該方法而言，只要能夠雜交，則可以導(dǎo)入含有其它種或?qū)偎哂械某嗝共〉挚剐砸蜃?與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷。
本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)是通過上述本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法得到的。該赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)在導(dǎo)入含有具有赤霉病抵抗性的表現(xiàn)型(赤霉病抵抗性型)的基因位點(diǎn)的DNA片斷時(shí)，成為比原品種的赤霉病抵抗性更高的品種；在導(dǎo)入含有具有赤霉病患病性的表現(xiàn)型(赤霉病患病性型)的基因位點(diǎn)的DNA片斷時(shí)，成為比原品種的赤霉病抵抗性更弱的品種。因此，優(yōu)選導(dǎo)入含有具有赤霉病抵抗性型的基因位點(diǎn)的DNA片斷。
導(dǎo)入到植物(例如以大麥為代表的麥類)中的含有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷，無論是2H染色體上的DNA片斷、4H染色體上的DNA片斷、5H染色體上的DNA片斷、6H染色體上的DNA片斷中的哪一種DNA片斷都可以生產(chǎn)出赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))，但通過將多個(gè)DNA片斷導(dǎo)入到同一植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的基因組DNA中，可以生產(chǎn)進(jìn)一步提高赤霉病的抵抗性的植物(禾本科植物)。
本發(fā)明人等將含有與條性基因vrs1的基因位點(diǎn)一致的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷(以下稱為vrs1片斷)導(dǎo)入到分別單獨(dú)導(dǎo)入有2H染色體上的DNA片斷或5H染色體上的DNA片斷的大麥中，由此可確認(rèn)赤霉病抵抗性比單獨(dú)導(dǎo)入時(shí)得到提高。進(jìn)而，將上述vrs1片斷導(dǎo)入到導(dǎo)入有2H染色體上的DNA片斷和5H染色體上的DNA片斷兩者的大麥中時(shí)，確認(rèn)赤霉病抵抗性進(jìn)一步提高。
通過以上述方法所得到的本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性大麥為代表的赤霉病抵抗性禾本科植物，可以有效地回避以往因赤霉病導(dǎo)致的品質(zhì)·收獲量的降低、因食用感染有赤霉病的植物導(dǎo)致的對人體·家畜的危害，對農(nóng)業(yè)·畜牧業(yè)等極為有效。還可以改善糧食困難的問題。
另外，上述“赤霉病抵抗性植物”、“赤霉病抵抗性禾本科植物”及“赤霉病抵抗性大麥”是指，包括通過賦予對赤霉病完全沒有抵抗性的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))以赤霉病抵抗性而生產(chǎn)的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))以及通過對原來對赤霉病具有抵抗性的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))進(jìn)一步增強(qiáng)赤霉病抵抗性而生產(chǎn)的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))。
<赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定方法>
本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定方法(選拔方法)只要是包括上述本發(fā)明所述的檢測遺傳標(biāo)記的工序即可，其它工序、條件、材料等沒有特別的限定。例如，可以利用以往公知的作物育種法。
更具體而言，可以例舉出，提取通過雜交等制成的植物基因組DNA，以本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的基因型為指標(biāo)來判定(選拔)植物的方法。檢測遺傳標(biāo)記的方法可以例舉出，把從作為對象的植物中提取出的基因組DNA作為模板，對于用上述第一～第十八引物對中的任意一對進(jìn)行擴(kuò)增得到的DNA片斷，觀察片斷長度或片斷的限制性內(nèi)切酶消化圖案。由擴(kuò)增片斷，對于試驗(yàn)對象植物個(gè)體與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)的等位基因，以各遺傳標(biāo)記為指標(biāo)來判定其是具有抵抗性的基因型還是具有患病性的基因型的方法，此方法如在上述本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記各項(xiàng)中所說明的。
在此，本判定方法的判定準(zhǔn)確度(概率)如下。位于從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始1.2cM的距離的遺傳標(biāo)記，在赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))與遺傳標(biāo)記之間每個(gè)染色單體平均發(fā)生1000分之12次的交換。即以約1.2％的概率發(fā)生重組。因此，在該遺傳標(biāo)記中，只要檢測出赤霉病抵抗性型的基因，就可以說以98.8％的概率具有赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。因此，可以說赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))與遺傳標(biāo)記的距離越近，就可以高概率地判定有無赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))，即可以判定(選拔)赤霉病抵抗性禾本科植物。
根據(jù)上述理由，檢測多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，無論是上述遺傳標(biāo)記的哪一種都可以判定有無赤霉病抵抗性，優(yōu)選檢測位于相對于各赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))盡可能近的遺傳標(biāo)記。例如，在本判定方法中檢測4H染色體上的與赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))連鎖的遺傳標(biāo)記時(shí)，可以說比起“k03289”(從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始的距離約4.0cM)更優(yōu)選“k05042”(從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始的距離約1.2cM)。
此外，在本檢測方法中，也可以檢測多個(gè)遺傳標(biāo)記的多態(tài)性。特別是為了使判定準(zhǔn)確度(概率)提高，可以選擇具有夾持赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的關(guān)系的遺傳標(biāo)記來進(jìn)行多態(tài)性檢測。例如，有“k05042”(從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約1.2cM)和“k03289”(從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始的距離約4.0cM)的組合。以所述組合為例，對該遺傳標(biāo)記分別單獨(dú)地檢測多態(tài)性時(shí)及檢測雙方的多態(tài)性時(shí)，對于本判定方法的準(zhǔn)確度(概率)進(jìn)行更具體的說明。
“k05042”位于從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始短臂側(cè)約1.2cM的位置，單獨(dú)檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性時(shí)的本判定方法的準(zhǔn)確度(概率)為(1-12÷1000)×100＝約98.8％。另一方面，“k03289”位于從赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))開始的距離4.0cM的位置，同樣地計(jì)算單獨(dú)地檢測該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性時(shí)的本判定方法的準(zhǔn)確度(概率)，為96.0％。檢測該2個(gè)遺傳標(biāo)記的多態(tài)性兩者時(shí)，為(1-(12÷1000)×(40÷1000))×100＝99.952％，可以高概率地判定有無4H上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。
因此，優(yōu)選檢測具有夾持赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的關(guān)系的遺傳標(biāo)記來進(jìn)行判定。除了上述“k05042”和“k03289”的組合之外，還可以舉出“MMtgaEatc128”和“FMgcgEatc530”的組合、“FMacgEcgt288”和“HVM67”的組合、“FMataEagc408”和“HVM11”的組合、“Bmag125”和“k04002”的組合、“HvLOX”和“k00835”的組合等。
另外，本判定方法可以用作赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))育種時(shí)的有效的篩選方法。例如，進(jìn)行上述本發(fā)明所述的赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的生產(chǎn)方法時(shí)，可以從多個(gè)轉(zhuǎn)化體候補(bǔ)中容易地篩選導(dǎo)入有含赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的DNA片斷的轉(zhuǎn)化體植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))。也可以用作進(jìn)行了其他藥物制劑等的變異處理、雜交等育種處理的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的篩選方法。
<赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定試劑盒>
此外，通過將用于進(jìn)行上述“赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定方法”所必需的試劑、酶類試劑盒化，可以構(gòu)成赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定試劑盒(以下有時(shí)稱為“判定試劑盒”)。如在上述“赤霉病抵抗性植物(禾本科植物的判定方法)一項(xiàng)中所述，通過利用本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，對于試驗(yàn)對象禾本科植物個(gè)體的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，可以判定其是具有抵抗性的基因型還是具有患病性的基因型。即，可以判斷試驗(yàn)對象植物個(gè)體(試驗(yàn)對象禾本科植物個(gè)體)是赤霉病抵抗性還是患病性。因此，通過該判定試劑盒，發(fā)揮可以更簡便地判定赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的效果。
另外，在該判定試劑盒中，優(yōu)選至少含有能夠檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的引物對(第一～第十八引物對)中的至少一對或更多對。進(jìn)一步優(yōu)選的是，含有上述引物對(第一～第十八引物對)全部。此外，還可以含有用于檢測公知的與赤霉病抵抗性連鎖的標(biāo)記所必需的引物。
進(jìn)而，在該判定試劑盒中，還可以含有用于進(jìn)行PCR的酶、試劑類，還可以含有用于制備成為模板的基因組DNA所必需的試劑、緩沖液類、離心管，還可以含有檢測目的DNA大小帶所必需的遺傳標(biāo)記(MMtgaEatc128、FMgcgEatc530、FXLRRfor_XLRRrev119、FMacgEcgt288、HVM67、FMataEagc408、HVM11、Bmag125、k04002、k05042、k03289、HvLOX、k00835等)或適當(dāng)?shù)腄NA大小標(biāo)記。
<基因檢測器具(DNA微陣列等)>
通過將本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(MMtgaEatc128、FMgcgEatc530、FXLRRfor_XLRRrev119、FMacgEcgt288、HVM67、FMataEagc408、HVM11、Bmag125、k04002、k05042、k03289、HvLOX、k00835等)固定在適當(dāng)?shù)幕?玻璃、硅片、尼龍膜等)上，可以構(gòu)成以DNA微陣列為代表的基因檢測器具。對于該基因檢測器具(DNA微陣列等)，使其與由試驗(yàn)對象植物制成的探針反應(yīng)，檢測此時(shí)產(chǎn)生的信號，由此可以容易且同時(shí)地檢測多個(gè)本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記。因此，該基因檢測器具(DNA微陣列等)可以作為檢測本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性的裝置使用。因此，可以作為在上述赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定方法中的檢測裝置使用。此外，還可以將該基因檢測裝置(DNA微陣列等)添加到上述赤霉病抵抗性植物(禾本科植物)的判定試劑盒中。在這種情況下，在該試劑盒中也可以含有用于檢測源自基因檢測器具(DNA微陣列等)的信號的試劑·器具·裝置等。
可以在本基因檢測器具(DNA微陣列等)的基板上固定本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(MMtgaEatc128、FMgcgEatc530、FXLRRfor_XLRRrev119、FMacgEcgt288、HVM67、FMataEagc408、HVM11、Bmag125、k04002、k05042、k03289、HvLOX、k00835等)中的至少1個(gè)或更多個(gè)的遺傳標(biāo)記。此外，可以固定抵抗性型的遺傳標(biāo)記、患病性型的遺傳標(biāo)記中的任意一方或兩方。進(jìn)而，為了更準(zhǔn)確(概率)地判斷赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的有無，優(yōu)選固定具有夾持赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的關(guān)系的多個(gè)遺傳標(biāo)記的組合。所述的遺傳標(biāo)記的組合可以例舉出“k05042”和“k03289”的組合、“MMtgaEatc128”和“FMgcgEatc530”的組合、“FMacgEcgt288”和“HVM67”的組合、“FMataEagc408”和“HVM11”的組合、“Bmag125”和“k04002”的組合、“HvLOX”和“k00835”的組合等。自然最優(yōu)選固定所有的遺傳標(biāo)記(抵抗性型和患病性型)。
通過使用固定有上述多個(gè)遺傳標(biāo)記的基因檢測器具(DNA微陣列等)，可以在一次試驗(yàn)中簡便地檢測多個(gè)遺傳標(biāo)記。進(jìn)而可以高準(zhǔn)確度(概率)地進(jìn)行有無赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的判斷。
另外，在上述基因檢測器具(DNA微陣列等)中不僅可以固定本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，還可以固定位于其附近的其他遺傳標(biāo)記。
進(jìn)而，優(yōu)選在上述基因檢測器具(DNA微陣列等)中，將本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記按在大麥染色體上排列的順序進(jìn)行固定，或者給予對應(yīng)于在大麥染色體上排列的順序的序列位置信息后進(jìn)行固定。這是在試驗(yàn)對象為大麥時(shí)可以使檢測準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高的緣故。即，在以往使用DNA微陣列的解析中，不能得到對于某位點(diǎn)的信號時(shí)，是不存在所要檢測的遺傳標(biāo)記，還是由于解析實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤而得不到信號，對此，不重新進(jìn)行確認(rèn)就不能進(jìn)行正確地判定。對此，如上所述，遺傳標(biāo)記按在大麥染色體上排列的順序被固定，或者給予對應(yīng)于在大麥染色體上排列的順序的序列位置信息后被固定，當(dāng)使用按如此固定有遺傳標(biāo)記的基因檢測器具(DNA微陣列等)時(shí)，由于排序成能夠確認(rèn)被固定的遺傳標(biāo)記的染色體上的順序，因此可以容易地判定在上述那樣的實(shí)驗(yàn)中是否有錯(cuò)誤。
具體而言，例如在沒有得到信號的位點(diǎn)前后的位點(diǎn)中獲得了信號。在該基因檢測器具(DNA微陣列等)中，各位點(diǎn)被排序成能夠確認(rèn)在染色體上的排列順序。通常，為了在染色體上僅重組在直線上緊鄰排列的基因中的一個(gè)基因，必須在極為相近的距離內(nèi)發(fā)生2個(gè)重組。這種現(xiàn)象發(fā)生的概率極低，因此沒有得到信號的結(jié)果，可以判定是實(shí)驗(yàn)上的錯(cuò)誤引起的。這樣，在該基因檢測器具(DNA微陣列等)中，即使得不到某位點(diǎn)的信號時(shí)，也可以容易地判定是否是實(shí)驗(yàn)上的錯(cuò)誤，因此可以提高解析的準(zhǔn)確度。
另外，本發(fā)明說明中所使用的引物等的堿基序列只要能夠擴(kuò)增本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，則可以使用具有1個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、附加的堿基序列的引物。
下面用實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
為了檢索與大麥的赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)，進(jìn)行了QTL解析。
<材料>
用由對赤霉病的抵抗性不同的大麥品種Russia6(二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(RHI集團(tuán))、由Harbin2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(RI2集團(tuán))以及由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(DHHS集團(tuán))進(jìn)行。
<赤霉病抵抗性的評價(jià)方法>
用“切穗檢測法”(參照非專利文獻(xiàn)4)的改變法進(jìn)行評價(jià)。簡單地如下進(jìn)行。
用例行的方法栽培材料，在各自系統(tǒng)的開花期中長出頂葉后在從上開始的第2個(gè)節(jié)間摘取穗，將其豎立在用自來水沖洗后的不銹鋼制的棒上。對其充分噴霧，噴霧所用懸濁液被調(diào)整到在每個(gè)顯微鏡200倍視野中赤霉病菌的分生孢子為15個(gè)左右。分生孢子接種后2天內(nèi)在25℃·濕度100％的條件下，其后的6天內(nèi)在18℃·濕度90％左右的人工氣象室中進(jìn)行栽培。光條件設(shè)為白晝長14小時(shí)·照度約10000lux。在分生孢子接種后第8天用肉眼觀察，以變成黃褐色的潁花作為患病粒來研究患病性小穗比率，依照表1所示的標(biāo)準(zhǔn)用0(抵抗性)～10(患病性)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價(jià)。


此外，在QTL解析的算法中使用composite interval mapping(CIM)，解析軟件分別使用MAPMAKER/QTL和QTL Cartographer進(jìn)行。將LOD分?jǐn)?shù)的閾值設(shè)定為2，當(dāng)LOD分?jǐn)?shù)超過2時(shí)，推定QTL存在于該2個(gè)標(biāo)記區(qū)間內(nèi)LOD最大的位置。
<結(jié)果>
將RHI集團(tuán)的結(jié)果示于表5中，將RI2集團(tuán)的結(jié)果示于表6中，將DHHS的結(jié)果示于表7中。


a)從左側(cè)標(biāo)記開始的LOD分?jǐn)?shù)峰值位置的距離b)顯著標(biāo)記間隔的LOD分?jǐn)?shù)峰值c)LOD分?jǐn)?shù)峰值的方差說明
d)預(yù)測的附加效果由表5明確，在RHI集團(tuán)中，在2H染色體上、4H染色體上各檢測出1個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。其中，在2H染色體上檢測到的與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL是根據(jù)發(fā)明人等以往的研究所檢測出的。因此，根據(jù)本次研究，在4H染色體上新發(fā)現(xiàn)一個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。
上述QTL存在于從遺傳標(biāo)記MMtgaEatc128開始0.0cM的距離和從遺傳標(biāo)記FMgcgEatc530開始短臂側(cè)8.0cM的距離，位于被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為2.7?？梢哉f明在該QTL中表現(xiàn)型的分散為12.4％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)降低1.1(即抵抗性提高)。


a)從左側(cè)標(biāo)記開始的LOD分?jǐn)?shù)峰值位置的距離b)顯著標(biāo)記間隔的LOD分?jǐn)?shù)峰值c)LOD分?jǐn)?shù)峰值的方差說明d)預(yù)測的附加效果對RI2集團(tuán)進(jìn)行2次QTL解析，在第1次QTL解析中，在2H染色體上檢測到1個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。此外，通過第2次QTL解析，在4H染色體上檢測到1個(gè)，在6H染色體上檢測到1個(gè)。
上述在2H染色體上檢測到的QTL，在從遺傳標(biāo)記FXLRRfor_XLRRrev119開始長臂側(cè)0.2cM的距離和從遺傳標(biāo)記FegtaMacg677開始短臂側(cè)3.3cM的距離，位于被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為2.6?？梢哉f明在該QTL中表現(xiàn)型的分散為10.1％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)降低1.3(即抵抗性提高)。
此外，上述在4H染色體上檢測到的QTL，在從遺傳標(biāo)記FMacgEcgt288開始長臂側(cè)0.3cM的距離和從遺傳標(biāo)記HVM67開始短臂側(cè)46.8cM的距離，位于被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為2.2。可以說明在該QTL中表現(xiàn)型的分散為25.5％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)降低0.9(即抵抗性提高)。
此外，上述在6H染色體上檢測到的QTL，在從遺傳標(biāo)記FMataEagc408開始長臂側(cè)4.1cM的距離和從遺傳標(biāo)記HVM11開始短臂側(cè)9.4cM的距離，位于被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為2.7?？梢哉f明在該QTL中表現(xiàn)型的分散為28.6％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)降低1.0(即抵抗性提高)。


a)從左側(cè)標(biāo)記開始的LOD分?jǐn)?shù)峰值位置的距離b)顯著標(biāo)記間隔的LOD分?jǐn)?shù)峰值c)LOD分?jǐn)?shù)峰值的方差說明d)預(yù)測的附加效果由表7明確，在DHHS集團(tuán)中，在2H染色體上、4H染色體上、5H染色體上各檢測出1個(gè)與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL。
上述在2H染色體上檢測到的QTL，在從遺傳標(biāo)記Bmag125開始0.0cM的距離和從遺傳標(biāo)記k04002開始短臂側(cè)10.0cM的距離，被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為2.0?？梢哉f明在該QTL中表現(xiàn)型的分散為12.2％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)降低2.2(即抵抗性提高)。
此外，上述在4H染色體上檢測到的QTL，存在于從遺傳標(biāo)記k05042開始長臂側(cè)1.2cM的距離和從遺傳標(biāo)記k03289開始短臂側(cè)4.0cM的距離，位于被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為3.2。可以說明在該QTL中表現(xiàn)型分散為27.7％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)提高2.8(即抵抗性降低)。
此外，上述在5H染色體上檢測到的QTL，存在于從遺傳標(biāo)記HvLox開始長臂側(cè)0.5cM的距離和從遺傳標(biāo)記k00835開始短臂側(cè)1.9cM的距離，位于被這兩個(gè)遺傳標(biāo)記夾持的位置，LOD分?jǐn)?shù)為3.1。可以說明在該QTL中表現(xiàn)型的分散為19.7％。此外，在該QTL存在的條件下，上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)降低2.4(即抵抗性提高)。
上述表5～7中的“染色體”是指“遺傳標(biāo)記位點(diǎn)存在的染色體”，“標(biāo)記間隔(M1-A-QTL-B-M2)”是指“位于QTL附近、夾持該QTL的2個(gè)遺傳標(biāo)記(M1、M2)”，“距離(cM)A+B”是指“夾持QTL的2個(gè)遺傳標(biāo)記之間的距離”，“位置a)(cM)A”是指“遺傳標(biāo)記M1和QTL之間的距離”，“位置(cM)B”是指“遺傳標(biāo)記M2和QTL之間的距離”，“LODb)分?jǐn)?shù)”是指“LOD分?jǐn)?shù)的峰值”，“Var.(％)c)”是指“表示通過QTL的存在能夠說明表現(xiàn)型的分散為多少(％)的值”，“重量d)”是指“表示通過QTL的存在上述“切穗檢測法”的分?jǐn)?shù)提高多少的值”。
(方法)對50ng的試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA用各1.5U的EcoRI(TAKARABIO公司制)和MseI(NEW ENGLAND Biolabs公司制)在合計(jì)25μl的反應(yīng)體系中于37℃下進(jìn)行雙消化12小時(shí)。在限制性內(nèi)切酶處理后的DNA上，與5μM的EcoRI連接物(堿基序列示于序列號14和序列號15中)和50μM的MseI連接物(堿基序列示于序列號16和序列號17中)用25U的T4連接酶(TAKARABIO公司制)于37℃下進(jìn)行3小時(shí)連接。對上述連接后的DNA片斷用EcoRI通用引物(堿基序列示于序列號18中)和MseI通用引物(堿基序列示于序列號19中)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增(預(yù)備擴(kuò)增)。在0.07mg/ml的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)溶液中，使用具有序列號33所示的堿基序列的EcoRI的選擇引物和具有序列號32所示的堿基序列的MseI的選擇引物來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(本擴(kuò)增)。另外，在擴(kuò)增反應(yīng)中使用TaKaRa Ex Taq(TAKARABIO公司制)。
上述預(yù)備擴(kuò)增的反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行2分鐘后，進(jìn)行94℃30秒→56℃1分鐘→72℃1分鐘的工序20次。
本擴(kuò)增的反應(yīng)循環(huán)為，在94℃30秒→68℃30秒→72℃1分鐘之后，在94℃30秒→68℃30秒→72℃30秒→94℃30秒→67.3℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→66.6℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→65.9℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→65.2℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→64.5℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→63.8℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→63.1℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→62.4℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→61.7℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→61.0℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→60.3℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→59.6℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→58.9℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→58.2℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→57.5℃30秒→72℃1分鐘→94℃30秒→56.8℃30秒→72℃1分鐘之后，進(jìn)行94℃30秒→56℃30秒→72℃1分鐘的工序23次。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖8中。圖8中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示對赤霉病抵抗性大麥品種Russia6進(jìn)行上述AFLP檢測所得的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示對赤霉病抵患病性大麥品種H.E.S.4進(jìn)行上述AFLP檢測所得的結(jié)果。其他泳道顯示對由Russia6和H.E.S.4雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RHI集團(tuán)進(jìn)行上述AFLP檢測所得的結(jié)果。
由圖8的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Russia6型)為約128bp(圖中用箭頭表示)，患病性型(H.E.S.4型)為0bp，換言之，對赤霉病為抵抗性型(Russia6型)得到約128bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(H.E.S.4型)不能得到約128bp的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述AFLP的檢測操作，以有無約128bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)方法為，使用具有序列號35所示的堿基序列的EcoRI的選擇引物和具有序列號34所示的堿基序列的MseI的選擇引物來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(本擴(kuò)增)，除此之外，采用與上述實(shí)施例5所示同樣的方法。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖9中。圖9中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示對赤霉病抵抗性大麥品種Russia6進(jìn)行上述AFLP檢測所得的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示對赤霉病患病性大麥品種H.E.S.4進(jìn)行上述AFLP檢測所得的結(jié)果。其他泳道顯示由Russia6和H.E.S.4雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RHI集團(tuán)進(jìn)行上述AFLP檢測所得的結(jié)果。
由圖9的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Russia6型)和患病性型(H.E.S.4型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Russia6型)為0bp，患病性型(H.E.S.4型)為約530bp(圖中用箭頭表示)，換言之，對赤霉病為抵抗性型(Russia6型)得不到約530bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(H.E.S.4型)能得到約530bp的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述AFLP的檢測操作，以有無約530bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)使用具有序列號22和23所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行5分鐘后，進(jìn)行94℃1分鐘→45℃1分鐘→72℃2分鐘的工序45次，然后在72℃進(jìn)行7分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖10中。圖10中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種Harbin 2-row的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種Turkey6的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示對由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RI2集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖10的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)為0bp，患病性型(Turkey6型)為約119bp(圖中用箭頭表示)，換言之，對赤霉病為抵抗性型(Harbin 2-row型)不能得到約119bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(Turkey6型)能得到約119bp的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述AFLP的檢測操作，以有無約119bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該2H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)方法為，使用具有序列號37所示的堿基序列的EcoRI的選擇引物和具有序列號36所示的堿基序列的MseI的選擇引物來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(本擴(kuò)增)，除此之外，采用與上述實(shí)施例5所示的方法。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖11中。圖11中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種Harbin 2-row的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種Turkey6的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RI2集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖11的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)為0bp，患病性型(Turkey6型)為約288bp(圖中用箭頭表示)，換言之，對赤霉病為抵抗性型(Harbin 2-row型)得不到約288bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(Turkey6型)能得到約288bp的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述AFLP的檢測操作，以有無約288bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)使用具有序列號38和39所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行3分鐘后，進(jìn)行94℃1分鐘→64℃1分鐘(每個(gè)循環(huán)降低1℃)→72℃1分鐘的循環(huán)10次，然后進(jìn)行94℃1分鐘→55℃1分鐘→72℃1分鐘的循環(huán)30次，然后在72℃進(jìn)行5分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖12中。圖12中的左端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種Harbin 2-row的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種Turkey6的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RI2集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖12的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)為160bp(圖中用箭頭表示)，患病性型(Turkey6型)為約140bp(圖中用空心箭頭表示)。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以有無約160bp或約140bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)方法為，使用具有序列號45所示的堿基序列的EcoRI的選擇引物和具有序列號44所示的堿基序列的MseI的選擇引物來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(本擴(kuò)增)，除此之外，采用與上述實(shí)施例5所示的方法。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖13中。圖13中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種Harbin 2-row的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種Turkey6的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RI2集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖13的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)為0bp，患病性型(Turkey6型)為約408bp(圖中用箭頭表示)，換言之，對赤霉病為抵抗性型(Harbin 2-row型)得不到約408bp的擴(kuò)增片斷，與此相對，患病性型(Turkey6型)能得到約408bp的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述AFLP的檢測操作，以有無約408bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該6H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)使用具有序列號46和47所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行3分鐘后，進(jìn)行94℃1分鐘→64℃1分鐘(每個(gè)循環(huán)降低1℃)→72℃1分鐘的循環(huán)10次，然后進(jìn)行94℃1分鐘→55℃1分鐘→72℃1分鐘的循環(huán)30次，然后在72℃進(jìn)行5分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖14中。圖14中右端泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種Harbin 2-row的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中右端泳道開始第2泳道顯示赤霉病患病性大麥品種Turkey6的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由Harbin 2-row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的重組近交系統(tǒng)(RI系統(tǒng))RI2集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖14的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(Harbin 2-row型)和患病性型(Turkey6型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(Harbin 2-row型)為144bp(圖中用箭頭表示)，患病性型(Turkey6型)為約100bp～160bp(圖中用空心箭頭表示)。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以有無約144bp或約100bp～160bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該6H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)使用具有序列號24和25所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行3分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘后，進(jìn)行94℃1分鐘→55℃1分鐘→72℃1分鐘的循環(huán)30次，然后在72℃進(jìn)行5分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖15中。圖15中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種春名二條的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種H602的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，第4泳道顯示這些F1擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的雙單倍體系統(tǒng)(DH系統(tǒng))DHHS集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖15的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)為142bp(圖中用箭頭表示)，患病性型(H602型)可觀察到約134bp(圖中用空心箭頭表示)的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以有無約142bp或約134bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該2H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)使用具有序列號26和27所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行2分鐘后，進(jìn)行94℃30秒→65℃30秒(每個(gè)循環(huán)降低1℃)→72℃2分鐘的循環(huán)5次，然后進(jìn)行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分鐘的循環(huán)35次，然后在72℃進(jìn)行7分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖16中。圖16中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種春名二條的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種H602的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，第4泳道顯示這些F1擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的雙單倍體系統(tǒng)(DH系統(tǒng))DHHS的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖16的結(jié)果可知，在通過上述操作被擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)為約350bp(圖中用箭頭表示)，患病性型(H602型)可觀察到約440bp(圖中用空心箭頭表示)的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以有無約350bp或約440bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該2H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)
使用具有序列號40和41所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行2分鐘后，進(jìn)行94℃30秒→65℃30秒(每個(gè)循環(huán)降低1℃)→72℃2分鐘的循環(huán)5次，然后進(jìn)行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分鐘的循環(huán)35次，然后在72℃進(jìn)行7分鐘。
對上述擴(kuò)增產(chǎn)物用1.6U的HapII(TAKARABIO公司制)于37℃下進(jìn)行15小時(shí)限制性內(nèi)切酶消化。
(結(jié)果)對通過上述限制性內(nèi)切酶消化后的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖17中。圖17中的左端泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種春名二條的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病患病性大麥品種H602的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，第3泳道顯示這些F1擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由春名二條和H602雜交培育而得到的雙單倍體系統(tǒng)(DH系統(tǒng))的DHHS的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
如上所述，該遺傳標(biāo)記是CAPS標(biāo)記。因此，限制性內(nèi)切酶(HapII)的消化圖案不同。由圖17的結(jié)果可知，在進(jìn)行上述操作得到的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的春名二條型和抵抗性型H602型，各個(gè)擴(kuò)增片斷的消化片斷長度為，春名二條型可觀察到約150bp、約350bp、約500bp的片斷，H602型可觀察到約300bp、約340bp、約360bp的片斷。另外，H602型的約340bp、約360bp的擴(kuò)增片度在電泳解像度低時(shí)有時(shí)也能反復(fù)看到。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以消化片斷的圖案為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
但是，如上所述，本遺傳標(biāo)記連鎖的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))是赤霉病患病性型品種H602所含有的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。因此，檢測本遺傳標(biāo)記時(shí)，春名二條型為患病性型，H602型為抵抗性型。
(方法)使用具有序列號42和43所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行2分鐘后，進(jìn)行94℃30秒→65℃30秒(每個(gè)循環(huán)降低1℃)→72℃2分鐘的循環(huán)5次，然后進(jìn)行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分鐘的循環(huán)35次，然后在72℃進(jìn)行7分鐘。
對上述擴(kuò)增產(chǎn)物用1.6U的SacII(TAKARABIO公司制)于37℃下進(jìn)行15小時(shí)限制性內(nèi)切酶消化。
(結(jié)果)對上述限制性內(nèi)切酶消化的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖18中。圖18中的右端泳道顯示春名二條的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中右端泳道開始第2泳道顯示H602的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，第3泳道顯示這些F1擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的雙單倍體系統(tǒng)(DH系統(tǒng))DHHS集團(tuán)的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
如上所述，該遺傳標(biāo)記是CAPS標(biāo)記。因此，限制性內(nèi)切酶(SacII)的消化圖案不同。由圖18的結(jié)果可知，在進(jìn)行上述操作得到的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的春名二條型和H602型，各個(gè)消化片斷的片斷長度為，春名二條型可觀察到約250bp、約250bp的擴(kuò)增片斷，H602型可觀察到約500bp的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以消化片斷的圖案為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該4H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
但是，如上所述，本遺傳標(biāo)記連鎖的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))是赤霉病患病性型品種H602所含有的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))。因此，檢測本遺傳標(biāo)記時(shí)，春名二條型為患病性型，H602型為抵抗性型。
(方法)使用具有序列號28和29所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃3分鐘、58℃1分鐘→72℃1分鐘之后，進(jìn)行94℃30秒→58℃30秒→72℃30秒的循環(huán)30次，然后在72℃進(jìn)行5分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖19中。圖19中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種春名二條的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種H602的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的雙單倍體系統(tǒng)(DH系統(tǒng))DHHS的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖19的結(jié)果可知，在進(jìn)行上述操作擴(kuò)增得到的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)可觀察到155bp的擴(kuò)增片斷(圖中用箭頭表示)，患病性型(H602型)可觀察到約157bp(圖中用空心箭頭表示)的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以有無約155bp或約157bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該5H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
(方法)使用具有序列號30和31所示的堿基序列的引物，以試驗(yàn)對象大麥的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)為，在94℃進(jìn)行2分鐘后，進(jìn)行94℃30秒→65℃30秒(每個(gè)循環(huán)降低1℃)→72℃2分鐘的循環(huán)5次，然后進(jìn)行94℃30秒→60℃30秒→72℃2分鐘的循環(huán)35次，然后在72℃進(jìn)行7分鐘。
(結(jié)果)對通過上述擴(kuò)增反應(yīng)得到的擴(kuò)增片斷進(jìn)行電泳，其結(jié)果示于圖20中。圖20中的左端泳道和右端泳道表示大小標(biāo)記，從左端泳道開始第2泳道顯示赤霉病抵抗性大麥品種春名二條的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，從同圖中左端泳道開始第3泳道顯示赤霉病患病性大麥品種H602的擴(kuò)增片斷的結(jié)果，第4泳道顯示這些F1的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。其他泳道顯示由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的雙單倍體系統(tǒng)(DH系統(tǒng))DHHS的擴(kuò)增片斷的結(jié)果。
由圖20的結(jié)果可知，在通過上述操作進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增片斷上，存在對赤霉病的抵抗性型(春名二條型)和患病性型(H602型)，各個(gè)擴(kuò)增片斷的片斷長度為，抵抗性型(春名二條型)可觀察到約900bp的擴(kuò)增片斷(圖中用箭頭表示)，患病性型(H602型)可觀察到約880bp(圖中用空心箭頭表示)的擴(kuò)增片斷。因此，對試驗(yàn)對象植物進(jìn)行上述檢測操作，以有無約900bp或約880bp的擴(kuò)增片斷為指標(biāo)，則可以對對象植物個(gè)體位于該5H染色體上的赤霉病抵抗性因子(與赤霉病抵抗性相關(guān)的基因位點(diǎn))的等位基因，判定其是含有抵抗性的基因型還是含有患病性的基因型。
另外，本發(fā)明不限于如上所述的各構(gòu)成，可以在專利權(quán)利要求書所示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種改變，將在不同的實(shí)施方式和實(shí)施例中分別公開的技術(shù)方法適當(dāng)組合而得到的實(shí)施方式也包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明所述的與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記及其利用，可以分離含有赤霉病抵抗性因子的DNA片斷。因此，通過使用該DNA片斷，發(fā)揮可以進(jìn)行與大麥的赤霉病抵抗性相關(guān)的基因及赤霉病抵抗性機(jī)理等的闡明的效果。
此外，通過本發(fā)明，可以生產(chǎn)出具有赤霉病抵抗性的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))或赤霉病抵抗性被進(jìn)一步增強(qiáng)的植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))。因此，發(fā)揮可以減少作為食用作物很重要的大麥等因赤霉病導(dǎo)致的大麥?zhǔn)斋@量降低及品質(zhì)降低等的災(zāi)害的效果。
此外，本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記，由于與赤霉病抵抗性因子連鎖，因此以該遺傳標(biāo)記作為指標(biāo)可以進(jìn)行赤霉病抵抗性禾本科植物(以大麥為代表的麥類)的育種。因此，發(fā)揮可以實(shí)現(xiàn)赤霉病抵抗性禾本科植物的高效育種的效果。更具體而言，由于可以在幼苗階段進(jìn)行目的個(gè)體選拔，因此實(shí)際上在評價(jià)植物個(gè)體的赤霉病抵抗性之后，沒有必要選拔目的個(gè)體，發(fā)揮可以縮短育種期間的效果。此外，由于可以同時(shí)選拔多個(gè)基因位點(diǎn)，因此與通過觀察來選拔相比，可以準(zhǔn)確地得到作為目的的基因型。進(jìn)而，發(fā)揮可以減少勞動(dòng)力和農(nóng)田地面積的效果。
進(jìn)而，以本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記為指標(biāo)進(jìn)行選拔育種，則可以排除栽培環(huán)境因素對表現(xiàn)型的影響。因此，發(fā)揮能夠準(zhǔn)確地選拔有用基因(基因位點(diǎn))的作用。
因此，通過本發(fā)明，可以進(jìn)行大麥赤霉病抵抗性的機(jī)理的闡明，進(jìn)行赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的生產(chǎn)，進(jìn)行有無赤霉病抵抗性因子的判斷，進(jìn)行赤霉病抵抗性植物(禾本科植物(例如以大麥為代表的麥類))的判定等。因此，只要應(yīng)用于以往因赤霉病而遭受收獲量降低·品質(zhì)降低·人體受損害等的以大麥為代表的植物(禾本科植物)中，就可以減少該病害。因此，可以用于以園藝農(nóng)業(yè)為代表的農(nóng)業(yè)全體中。進(jìn)而，還可以有效地用于以大麥等作為原料的食品產(chǎn)業(yè)中。
序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)<120>與赤霉病抵抗性因子連鎖的遺傳標(biāo)記及其利用<130>A 181-09PCT<150>JP 2004-014839<151>2004-01-22<150>JP 2004-270268<151>2004-09-16<160>56<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>1agagatccct gctcagcttg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>2tcgtattaag gccgcatagg 20<210>3<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>3gcacgtagcg ttcaacatca 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>4aacttttccc aaccctttcc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>5ccgtgtgtcg tctaggtcaa 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>6caactttggt gggacgtagg 20
<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>7gttttcgcca tcactcttcc 20<210>8<211>208<212>DNA<213>大麥<400>8gcacgtagcg ttcaacatca catctcatct ttggcaaaag aaatggtcaa tcggcacact 60ctcagttttt tgcaccaaaa tgtcccatga gaccaccaac atgtgcttcc cgcaatagta 120gtaaacgaac aaagcaatct agaatgcata gtttgttagc acgaaacagg aaaccatcat 180gcacataaaa cttttcccaa ccctttcc 208<210>9<211>208<212>DNA<213>大麥<400>9gcacgtagcg ttcaacatca catctcatct ttggcaaaag aaatggtcaa tcggcacact 60ctcagttttt tgcaccaaaa tgtcccatga gaccaccaac atgtgcttcc cgcaatagta 120gtaaacgaac aaagctatct agaatgcata gtttgttagc acgaaacagg aaaccatcat 180gcacataaaa cttttcccaa ccctttcc 208<210>10<211>335<212>DNA<213>大麥<400>10ccgtgtgtcg tctaggtcaa ccatgacaac aactacgtgt ggtcgtgact ttggcctgct 60
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gtgatggcga aaac254<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>14ctcgtagact gcgtacc 17<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>15aattggtacg cagtctac18<210>16<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>16gacgatgagt cctgag 16<210>17<211>14<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>17tactcaggac tcat14<210>18<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>18gactgcgtac caattc 16<210>19<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>19gatgagtcct gagtaa 16<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>20gactgcgtac caattcccg 19<210>21
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>21gatgagtcct gagtaaacg 19<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>22ccgttggaca ggaaggag18<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>23cccatagacc ggactgtt18<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>24
aattagcgag aacaaaatca c21<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>25agataacgat gcaccacc18<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>26gacacaggac ctgaagcaca 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>27cggcaggctc tactatgagg 20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>28cagcatatcc atctgatctg 20<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>29cacccttatt tattgcctta a21<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>30tccatgttcc cagctacaca 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>31aggaacacat tggttctggc 20<210>32
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>32gatgagtcct gagtaaatc 19<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>33gactgcgtac caattctga 19<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>34gatgagtcct gagtaaatc 19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>35
gactgcgtac caattcgcg 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>36gatgagtcct gagtaaacg 19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>37gactgcgtac caattccgt 19<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>38gtcgggctcc attgctct18<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>39ccggtaccca gtgacgac18<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>40atacatgcat gccattgtgg 20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>41atccatccac tgtttgaggg 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>42tgctctgcat ttcattcagc 20<210>43
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>43cagcgttaca ggcattctca 20<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>44gatgagtcct gagtaaata 19<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>45gactgcgtac caattcagc 19<210>46<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>46
ccggtcggtg cagaagag18<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>47aaatgaaagc taaatgggcg atat 24<210>48<211>251<212>DNA<213>大麥<220>
<221>n<222>(7)<220>
<221>n<222>(17)<220>
<221>n<222>(29)<220>
<221>n<222>(47)<220>
<221>n<222>(98)<400>48ttacagntat aataggnggt ttcagttgnt agtgctttta caacagnaat agaagggttt 60cactgtgaat ccacaacata tcaagtggta cacatagnac catgtcattc atacatgcat 120gccattgtgg ggagaagcac aggtgggtgg gaaattccct ctcctcaaag agaagatgtg 180
gctatgcctt gagcatccgc aggtagtctt cgattatgga catggctgac gagcggtacc 240cagagccgaa a 251<210>49<211>251<212>DNA<213>大麥<220>
<221>n<222>(35)<220>
<221>n<222>(37)<400>49tgttgggaca tggagctgca gctcttgcac aaccnanctc ctctgctctg catttcattc 60agcaaataaa ctcatggcct tgctgctgct tccctaaaac ctaaagacta gcaactactg 120gtacacgcaa cctcctcctc catctctagc tatgaacaag gtaaatttac ccaccttttc 180tatcacaaaa aaaatatgaa caccaagccg aatcacgact gagaatttta cacaatgata 240atcgctcagc c 251<210>50<211>249<212>DNA<213>大麥<220>
<221>n<222>(19)<400>50acaagcgcac attttaatnc ttattatcgc tcactcactc gaagagttgc gtattaaaat 60tacactaaaa acctaacagc tcagctagct aagctcctcc tcaaccatca acatgggaac 120aatccatgtt cccagctaca catatgatac atacatcagc taagctcttc tagcaaccca 180accaatgacc ctggttggat tcagaagttg ctcttgctcg tcgaaggctt cgacctcttg 240ctgttgagc 249<210>51<211>21
<212>DNA<213>大麥<400>51gaaaacatgc aggtgaactc a21<210>52<211>21<212>DNA<213>大麥<400>52gaaaacatgc cggtgaactc a21<210>53<211>21<212>DNA<213>大麥<400>53gcgggcgccg cgggtcgagc g21<210>54<211>21<212>DNA<213>大麥<400>54gcgggcgccg tgggtcgagc g21<210>55<211>519<212>DNA<213>大麥<400>55agcactccag tgttggggca ttgtcgactt cagtgcacgg ccatctcaca acaagcagca 60accgcttgat gggaacatgt ttattaacta tatcgtcagg aagtgctgtg accttggcat 120tcagatgaac aagacagcat gttttgtgca tctatcagaa atgtcagtgc tatcggatcc 180acaccaactg cacgaggagc tgaacaaagc aaagcaggct gcggtgaaga agaaccagaa 240
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<221>n<222>(41)<400>56agtcgctcgt tgtggctttg catatcatca gactggcaag nggccaggca accacataac 60tatagtataa aagacacaga cctgaagcac acgcacaatg acagaaccag caatacgttc 120caagttcaaa gttcagacca tacgaaacag ttcggagtac atgttctacc ggaccaagtt 180cagaccatat gaagcagtct gtatatatgt tctaccggac caagttcaga ccatatgaag 240cagtctgtat atatgttcta ccggaccaag ttcagaccat atgaagcagt ctgtatatat 300gttctaccgg accaagacgc taagcggcac cggtgagaag ccggcgtcag atgaagaaca 360tgttgtcctg aagatccacg tgcagcgtcg ggaagttgct gaagtcacaa gcccccgccg 420ctgtggagga ggccgacgac gacgagctgc gcacctgggg ctgggacgcc agcatgccct 480catagtagag cctgccgcgg tacgccgcca ggtcggcgta gtagacgggc gtcgccag538
權(quán)利要求
1.遺傳標(biāo)記，其存在于禾本科植物的基因組DNA中、與赤霉病抵抗性因子連鎖，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始0～10厘摩范圍內(nèi)的距離。
2.如權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，所述禾本科植物是麥類。
3.如權(quán)利要求2所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，所述麥類是大麥。
4.如權(quán)利要求3所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，所述基因組DNA為2H染色體。
5.如權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第一引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第一引物對是具有序列號1所示的堿基序列的引物和具有序列號2所示的堿基序列的引物的組合。
6.如權(quán)利要求5所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約0厘摩的距離。
7.如權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第二引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第二引物對是具有序列號3所示的堿基序列的引物和具有序列號4所示的堿基序列的引物的組合。
8.如權(quán)利要求7所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約0.6厘摩的距離。
9.如權(quán)利要求8所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，具有序列號8所示的堿基序列或序列號9所示的堿基序列。
10.如權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第六引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第六引物對是具有序列號22所示的堿基序列的引物和具有序列號23所示的堿基序列的引物的組合。
11.如權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第七引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第七引物對是具有序列號24所示的堿基序列的引物和具有序列號25所示的堿基序列的引物的組合。
12.如權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第八引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第八引物對是具有序列號26所示的堿基序列的引物和具有序列號27所示的堿基序列的引物的組合。
13.如權(quán)利要求2所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，所述基因組DNA是5H染色體。
14.如權(quán)利要求1、2、3或13所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第三引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第三引物對是具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號6所示的堿基序列的引物的組合。
15.如權(quán)利要求14所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約9厘摩的距離。
16.如權(quán)利要求15所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，具有序列號10所示的堿基序列或序列號11所示的堿基序列。
17.如權(quán)利要求1、2、3或13所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第四引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第四引物對是具有序列號5所示的堿基序列的引物和具有序列號7所示的堿基序列的引物的組合。
18.如權(quán)利要求17所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約9厘摩的距離。
19.如權(quán)利要求18所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，具有序列號12所示的堿基序列或序列號13所示的堿基序列。
20.如權(quán)利要求1、2、3或13所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第五引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第五引物對是具有序列號21所示的堿基序列的引物和具有序列號20所示的堿基序列的引物的組合。
21.如權(quán)利要求13或20所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，位于從所述赤霉病抵抗性因子開始約2.2厘摩的距離。
22.如權(quán)利要求1、2、3或13所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第九引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第九引物對是具有序列號28所示的堿基序列的引物和具有序列號29所示的堿基序列的引物的組合。
23.如權(quán)利要求1、2、3或13所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第十引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十引物對是具有序列號30所示的堿基序列的引物和具有序列號31所示的堿基序列的引物的組合。
24.如權(quán)利要求3所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，所述基因組DNA是4H染色體。
25.如權(quán)利要求1或2或3或22所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十引物對是具有序列號32所示的堿基序列的引物和具有序列號33所示的堿基序列的引物的組合。
26.如權(quán)利要求1或2或3或22所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十二引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十二引物對是具有序列號34所示的堿基序列的引物和具有序列號35所示的堿基序列的引物的組合。
27.如權(quán)利要求1或2或3或22所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十三引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十三引物對是具有序列號36所示的堿基序列的引物和具有序列號37所示的堿基序列的引物的組合。
28.如權(quán)利要求1或2或3或22所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第十四引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十四引物對是具有序列號38所示的堿基序列的引物和具有序列號39所示的堿基序列的引物的組合。
29.如權(quán)利要求1或2或3或22所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第十五引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十五引物對是具有序列號40所示的堿基序列的引物和具有序列號41所示的堿基序列的引物的組合。
30.如權(quán)利要求1或2或3或22所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第十六引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十六引物對是具有序列號42所示的堿基序列的引物和具有序列號43所示的堿基序列的引物的組合。
31.如權(quán)利要求3所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，所述基因組DNA為6H染色體。
32.如權(quán)利要求1或2或3或31所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，在將禾本科植物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI消化而得到的DNA片斷上，連接具有序列號16和17所示的堿基序列的MseI連接物以及具有序列號14和15所示的堿基序列的EcoRI連接物；使用具有序列號19所示的堿基序列的MseI通用引物和具有序列號18所示的堿基序列的EcoRI通用引物進(jìn)行所述連接后的DNA片斷的預(yù)備擴(kuò)增；進(jìn)而，使用第十七引物對擴(kuò)增通過所述預(yù)備擴(kuò)增而得到的預(yù)備擴(kuò)增片斷，所述第十七引物對是具有序列號44所示的堿基序列的引物和具有序列號45所示的堿基序列的引物的組合。
33.如權(quán)利要求1、2、3或31所述的遺傳標(biāo)記，其特征為，使用第十八引物對進(jìn)行擴(kuò)增，所述第十八引物對是具有序列號46所示的堿基序列的引物和具有序列號47所示的堿基序列的引物的組合。
34.DNA片斷的分離方法，其特征為，包括使用權(quán)利要求1～33中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記分離含有赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的工序。
35.赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，包括在植物的基因組DNA中導(dǎo)入通過權(quán)利要求34所述的分離方法而得到的含有所述赤霉病抵抗性因子的DNA片斷的工序。
36.如權(quán)利要求35所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述植物為禾本科植物。
37.如權(quán)利要求36所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述禾本科植物為麥類。
38.如權(quán)利要求37所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述麥類為大麥。
39.赤霉病抵抗性植物，其是通過權(quán)利要求35～38中的任一項(xiàng)所述的赤霉病抵抗性植物的生產(chǎn)方法而得到的。
40.赤霉病抵抗性植物的判定方法，其特征為，包括檢測權(quán)利要求1～33中的任一項(xiàng)所述的遺傳標(biāo)記的工序。
41.赤霉病抵抗性植物的判定試劑盒，其是為了進(jìn)行權(quán)利要求40所述的赤霉病抵抗性植物的判定方法而使用的。
42.基因檢測器具，其特征為，固定有權(quán)利要求1～33所述的遺傳標(biāo)記中的至少一個(gè)或更多個(gè)。
43.引物組，其是為了檢測權(quán)利要求1～33所述的遺傳標(biāo)記而使用的，其特征為，包含具有序列號1～7和序列號20～47中的任意一種所示的堿基序列的引物中的至少2個(gè)或更多個(gè)引物。
全文摘要
把由Russia6 (二條、抵抗性)和H.E.S.4(六條、患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(RHI集團(tuán))、Harbin 2－row(抵抗性)和Turkey6(患病性)雜交培育而成的RI系統(tǒng)(RI2集團(tuán))以及由春名二條(抵抗性)和H602(患病性)雜交培育而成的DH系統(tǒng)(DHHS集團(tuán))作為材料，進(jìn)行與赤霉病抵抗性相關(guān)的QTL解析。其結(jié)果為，在RHI集團(tuán)中于2H、4H及5H染色體上，在RI2集團(tuán)中于2H、4H及6H染色體上，在DHHS集團(tuán)中于2H、4H及5H染色體上分別檢測到QTL。進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)與該QTL連鎖的本發(fā)明所述的遺傳標(biāo)記(MM314、FM677、FM426、MM1057、MMtgaEatc128、FMgcgEatc530、FXLRRforXLRRrev119、FMacgEcgt288、HVM67、FMataEagc408、HVM11、Bmag125、k04002、k05042、k03289、HvLOX、k00835)。
文檔編號A01H5/00GK1910279SQ20058000295
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月22日
發(fā)明者武田和義, 佐藤和廣 申請人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)