一種小麥赤霉病液體生防菌劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)病害防治領(lǐng)域，具體涉及一種小麥赤霉病液體生防 菌劑及其制備方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌侵染引起的真菌性病害，致病能力極強(qiáng)，可以侵染小 麥的各個(gè)部位，主要危害穗部；在小麥生長(zhǎng)各個(gè)階段都能發(fā)病，苗期侵染引起苗腐，中后期 侵染引起桿腐和穗腐，尤以穗腐危害最大。在大流行年份，一般減產(chǎn)10~20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá) 80~90%，甚至絕產(chǎn)，造成巨大損失。小麥赤霉病不僅造成麥類產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降、出粉率 降低，而且病菌代謝產(chǎn)物含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉蜀黍赤霉烯酮等真菌毒素，可引起人 畜中毒，發(fā)生嘔吐、頭昏、腹痛、懷孕母畜流產(chǎn)等嚴(yán)重后果?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期施用帶來(lái)了農(nóng)藥 殘留、病原菌抗藥性增強(qiáng)和環(huán)境污染等嚴(yán)重問(wèn)題，利用拮抗微生物及其活性物質(zhì)防治作物 病害的優(yōu)點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)，綠色生防制劑的研宄已成為熱點(diǎn)。
[0004] 生化黃腐酸是腐殖酸的一種，是以植物渣體為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵得到的分 子量較小、活性較高的黃腐酸物質(zhì)。除含有高含量黃腐酸外，生化黃腐酸還富含植物生長(zhǎng)過(guò) 程中所需的幾乎全部氨基酸、氮、磷、鉀、多種酶類、糖類、維生素等營(yíng)養(yǎng)成份。研宄報(bào)道，生 化黃腐酸能夠促進(jìn)植物根系發(fā)育、提高根系活力，提高作物的抗凍、抗病性，提高多種酶活 性，促進(jìn)光合作用，促進(jìn)糖分和干物質(zhì)積累，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，是一種公認(rèn)的綠色生理 活性物質(zhì)。
[0005] 殼寡糖是一類由N-乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖通過(guò)0 - (1，4)-糖苷鍵連接起 來(lái)的低聚合度水溶性的糖類。殼寡糖可刺激植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，同時(shí)殼寡糖 還具有廣譜抑菌活性并對(duì)人畜無(wú)害。殼寡糖本身含有豐富的碳和氮，可促進(jìn)有益微生物的 生長(zhǎng)而抑制一些植物病原菌。另外有研宄報(bào)道，殼寡糖可解除DON毒素對(duì)小麥黃化苗生長(zhǎng) 及胚細(xì)胞啟動(dòng)的抑制作用，表明殼寡糖可提高小麥對(duì)DON毒素的抗性。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種小麥赤霉病液體生防菌劑及其制備方法。
[0008] 本發(fā)明提供的一種小麥赤霉病液體生防菌劑，其有效活性成分由枯草芽孢桿菌及 其發(fā)酵代謝產(chǎn)物組成、生化黃腐酸和殼寡糖組成。
[0009] 本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌優(yōu)選已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo. 9377的枯草芽孢桿菌sMd7itts)LM3403,地址： 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，保藏日期2014年6月25日。
[0010] 枯草芽孢桿菌菌株LM3403能夠合成三種抗菌脂肽（Surfactin、Fengycin和 Iturin)和Y-聚谷氨酸。菌株LM3403抗菌譜廣，對(duì)病原細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球 菌、嗜水氣單胞菌等)、腐敗真菌(黑曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉、擴(kuò)展青霉等)、病原真菌(禾谷 鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、尖孢鐮孢菌、鏈格孢霉、細(xì)極鏈格孢、根菌索菌、橄欖色盾殼霉、尖孢鐮 刀菌、灰葡萄孢、禾谷絲核菌、綠色木霉等）等均具有較好的抑制作用。
[0011] 按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，本發(fā)明所述的生防菌劑在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可制成農(nóng) 業(yè)上允許的任意劑型，較好的制劑劑型是水分散粒劑、懸浮劑、可濕性粉劑、微乳劑、水乳劑 或懸乳劑。
[0012] 本發(fā)明所述的生防菌劑可以以成品制劑形式提供，即生防菌劑中各組分已經(jīng)混 合；也可以以單劑制劑提供，使用前直接混合。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明提供的一種小麥赤霉病液體生防菌劑，其有效活性分由枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵 代謝產(chǎn)物、生化黃腐酸和殼寡糖組成，屬于不同作用機(jī)理的活性成分，協(xié)同作用下對(duì)小麥赤 霉病防效更好，且各組分均屬于綠色的、環(huán)境友好的、無(wú)毒害的、兼有藥效和肥效雙重生物 調(diào)節(jié)功能的活性成分。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明更加容易理解，以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。應(yīng)理解， 這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0016] 下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0017] 實(shí)施例1:菌株LM3403分離篩選 采集生長(zhǎng)在海拔3000米以上高寒無(wú)污染草原的野生牦牛牛糞。采用梯度稀釋、涂布 分離的方法，對(duì)樣品中細(xì)菌菌株進(jìn)行涂布分離。挑取形態(tài)差異明顯的菌落進(jìn)行劃線純化、編 號(hào)、保存?zhèn)溆?。采用濾紙片法、平板對(duì)峙法考察待測(cè)菌株的抑菌能力，將得到的廣譜抑菌能 力最強(qiáng)的菌株命名為L(zhǎng)M3403。菌株LM3403對(duì)禾谷鐮刀菌抑菌帶寬度為（6. 7±1.l)mm。
[0018] 實(shí)施例2 :菌株LM3403鑒定 菌株LM3403在NA平板上菌落圓形、不透明乳白色、較黏稠、邊緣不整齊；細(xì)胞呈桿狀， 革蘭氏陽(yáng)性，芽孢中生、橢圓形。需氧生長(zhǎng)：陽(yáng)性，運(yùn)動(dòng)性：陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)：陽(yáng)性，過(guò)氧化氫 酶試驗(yàn)：陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)：陽(yáng)性，淀粉水解：陽(yáng)性，酪蛋白水解：陽(yáng)性，明膠液化：陽(yáng)性，葡萄糖 發(fā)酵試驗(yàn)：陽(yáng)性，硝酸鹽還原：陽(yáng)性，尿素利用：陽(yáng)性，菌株LM3403的形態(tài)特征、生理生化特 征與枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株保持一致。菌株LM3403的16SrDNA序列與 strainSPAN1(JQ308575)、辦以77狀strainME2(JQ900623)和 strainBDT3(HQ711982)的同源性達(dá)到100%。綜合分析確定菌株LM3403為枯草 芽抱桿菌。
[0019] 實(shí)施例3 :菌株LM3403抗菌脂肽提取和分析 將菌株發(fā)酵液于4 °C、12000rpm離心15min，收集無(wú)菌上清液；用6mo1/L的HC1將 無(wú)菌上清液調(diào)至pH2.0,4°C靜置過(guò)夜后12000r/min、4°C離心15min，收集沉淀；向沉淀中 加入適量甲醇，于磁力攪拌器上攪拌30min后，放入4°C冰箱內(nèi)靜置抽提8h，抽提結(jié)束后 4°C、12000rpm離心15min，得到甲醇抽提液。經(jīng)減壓濃縮、真空冷凍干燥后，得到抗菌物 質(zhì)，-20°C保存。取真空冷凍干燥后的抗菌物質(zhì)，溶于pH7. 0的磷酸緩沖液中，配制成一定濃 度的抗菌物質(zhì)溶液，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0020] 樣品紅外光譜結(jié)果顯示，1652cnf1和1538. 66cnT1兩處吸收分別為酰胺譜帶I和 II，表明樣品中含有肽鏈；296〇-286〇Cnf1和1455-1380cnT1兩處吸收是脂肪酸鏈的C-H伸 縮振動(dòng)，1240cnT1為內(nèi)酯的特征吸收，表明樣品中含有脂肪酸；故推測(cè)為脂肽類物質(zhì)。樣品 茚三酮反應(yīng)陰性，說(shuō)明無(wú)自由N端；酸水解后茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)均陽(yáng)性，故推測(cè)為環(huán) 脂肽。
[0021]ESI-MS質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，m/z值1030、1044、1058處離子峰分別與 C13_Surfactin[M+Na+]、C14_Surfactin[M+Na+]、C15_Surfactin[M+Na+]分子量吻合，推測(cè) 為脂肽Surfactin同系物；m/z值 1065、1079、1093 處離子峰分別與C14_Iturin[M+Na+]、 C15-Iturin[M+Na+]、C16-Iturin[M+Na+]分子量吻合，推測(cè)為脂肽Iturin同系物；m/ z值 1449、1463、1477 處離子峰分另丨」與C15-Fengycin[M+H+]、C16-Fengycin[M+H+]、 C17Fengycin[M+H+]分子量吻合，推測(cè)為脂肽Fengycin同系物。
[0022] 實(shí)施例4 :發(fā)酵液制備 取平板活化后的枯草芽孢桿菌LM3403二環(huán)，接入裝液量150mL/500mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基，30°C下175rpm搖床振蕩培養(yǎng)24h得到種子液；將種子液全部接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的 5L全自動(dòng)發(fā)酵罐，33°C、轉(zhuǎn)速300r/min、通氣量18L/min、pH7. 0下培養(yǎng)50h得到發(fā)酵液。
[0023] 實(shí)施例4 :發(fā)酵液制備 取平板活化后的枯草芽孢桿菌LM3403 -環(huán)，接入裝液量100mL/250mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基，30°C下175rpm搖床振蕩培養(yǎng)24h得到種子液；將種子液全部接入裝液量1L/2L的大三 角瓶，33°C、搖床轉(zhuǎn)速250r/min、pH7. 0下培養(yǎng)44h得到發(fā)酵液。
[0024] 實(shí)施例6:液體生防菌劑制備 稱取生化黃腐酸3g、殼寡糖5g加入1L發(fā)酵液（活菌數(shù)3X108cfu/mL)，混合均勻，即 得液體生防菌劑。
[0025] 實(shí)施例7:液體生防菌劑制備 稱取生化黃腐酸8g、殼寡糖lg加入1L發(fā)酵液（活菌數(shù)5X107cfu/mL)，混合均勻，即 得液體生防菌劑。
[0026] 實(shí)施例8:液體生防菌劑制備 稱取生化黃腐酸5g、殼寡糖3g加入1L發(fā)酵液（活菌數(shù)5X108cfu/mL)，混合均勻，即 得液體生防菌劑。
[0027] 實(shí)施例9:小麥赤霉病防治試驗(yàn) 小區(qū)面積5m2,小麥品種，揚(yáng)花初期噴霧，噴霧體積800mL，實(shí)驗(yàn)組為液體生防菌劑，陽(yáng)性 對(duì)照組為50%多菌靈1000倍液，空白對(duì)照為水。
[0028] 實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組噴霧處理后，立即進(jìn)行禾谷鐮刀菌菌懸液噴霧接 種，噴霧體積800ml，菌懸液濃度5X105cfu/mL。
[0029] 每組重復(fù)4次。參照NYT1464. 15-2007進(jìn)行病情調(diào)查、病情指數(shù)計(jì)算和防效計(jì)算。 結(jié)果見(jiàn)表1。
[0030]表1液體生防菌劑防治小砉去霍病小嘆試駘效里

對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)上述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修 改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本 質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小麥赤霉病液體生防菌劑，其有效活性成分由枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵代謝產(chǎn) 物、生化黃腐酸和殼寡糖組成。2. 權(quán)利要求1所述的液體生防菌劑在防治小麥赤霉病中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，優(yōu)選已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo. 9377的枯草芽孢桿菌4. 權(quán)利要求1所述液體生防菌劑的制備方法，包括：將枯草芽孢桿菌LM3403在營(yíng)養(yǎng)瓊 脂平板活化16h后，接入營(yíng)養(yǎng)肉湯種子培養(yǎng)基，30°C搖床振蕩培養(yǎng)24h得到種子液；將種子 液按體積比5%-10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基，33°C好氧培養(yǎng)44h-50h得到發(fā)酵液；稱取一定量的生 化黃腐酸、殼寡糖加入發(fā)酵液，混合均勻，即得液體生防菌劑。5. 權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖30g/L、谷氨酸5g/L、硝酸銨4 g/L、磷酸二氫鉀4.08g/L、磷酸氫二鈉18.32g/L、硫酸鎂0.096g/L、氯化鈣0.78mg/L、 EDTA-Na2I. 5mg/L、FeS04 ? 7H20 556mg/L，pH7. 0。6. 權(quán)利要求4所述，液體生防菌劑中生化黃腐酸、殼寡糖的濃度分別為3%。-8%。、 1%。-5%。，液體生防菌劑中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)不小于5X107cfu/mL。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)病害防治領(lǐng)域，公開(kāi)了一種小麥赤霉病液體生防菌劑及其制備方法。該生防菌劑有效活性成分由枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵代謝產(chǎn)物、生化黃腐酸和殼寡糖等組成，所述的枯草芽孢桿菌優(yōu)選已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.9377的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilius)LM3403。該生防菌劑各有效組份通過(guò)不同作用方式協(xié)同防治小麥赤霉病，防效更好，且環(huán)境友好、無(wú)殘留、無(wú)公害和不產(chǎn)生抗藥性。CGMCC No.937720140625
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/125, A01N63/02, A61P3/00
【公開(kāi)號(hào)】CN104904751
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510165246
【發(fā)明人】陳亮, 關(guān)二旗, 李瑞靜, 王金水, 卞科
【申請(qǐng)人】河南工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年4月9日