專(zhuān)利名稱(chēng)：一種培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法。
背景技術(shù)：
蘆薈(Aloe)屬百合科多年生單子葉植物，具有醫(yī)療、美容、保健、食用等多種功能，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)譽(yù)為“21世紀(jì)人類(lèi)的最佳保健品”。可用于商業(yè)性栽培的優(yōu)良蘆薈品種，必須同時(shí)具備三個(gè)條件1)有效成分含量高；2)適應(yīng)性強(qiáng)，便于擴(kuò)大種植面積，發(fā)展集約化生產(chǎn)；3)單位面積產(chǎn)量高，有利于獲得最佳的經(jīng)濟(jì)效率。然而，蘆薈不耐寒，雖耐旱，但在貧瘠、干旱的土壤中生長(zhǎng)緩慢，且產(chǎn)量低；食用蘆薈品種味苦、味感差，這些不利因素阻礙了蘆薈的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。雖然蘆薈屬內(nèi)資源豐富(共有500多種)，但蘆薈開(kāi)花不結(jié)實(shí)，或結(jié)實(shí)率極低，且種子育苗技術(shù)復(fù)雜、成苗率低(熊佑清，姚利，蘆薈，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，62-65)。此外，部分性狀的改良不能靠常規(guī)育種達(dá)到，需要借助基因工程的手段。目前人們對(duì)蘆薈的研究側(cè)重于對(duì)其有效成分的分析和開(kāi)發(fā)利用。雖然蘆薈組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)已經(jīng)成熟(由繼紅，蘆薈組織培養(yǎng)研究進(jìn)展，中國(guó)野生植物資源，2001，210-11；杜勇軍，李惠芝，祁云枝，蘆薈芽快繁及試管苗栽培馴化研究，西北植物學(xué)報(bào)，2003，12(1)72-75)，但對(duì)蘆薈轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建及其相關(guān)轉(zhuǎn)基因方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
植物轉(zhuǎn)基因主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因具有操作簡(jiǎn)單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、可以導(dǎo)入大片段DNA，且導(dǎo)入的基因一般為單拷貝或低拷貝整合，可以減少發(fā)生基因沉默現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛，已在大豆等雙子葉經(jīng)濟(jì)作物的改良中得到推廣應(yīng)用。隨著人們對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化機(jī)理認(rèn)識(shí)的深入，轉(zhuǎn)化方法也不斷得到改進(jìn)，如選用高侵染力的菌株、超雙元載體、適宜的外植體、高效的啟動(dòng)子、適宜的共轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基、合適的選擇劑、較高濃度的酚類(lèi)化合物如乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)處理等(孔英珍，周功克，王根軒，王亞馥，影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素及其在單子葉作物上的應(yīng)用，應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11(5)791-794)。利用改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已經(jīng)在水稻、玉米、小麥、大麥等有重要價(jià)值的單子葉植物中也已成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并得到了詳細(xì)的分子生物學(xué)和遺傳性證據(jù)(Hiei Y，Komari T，Kabo T.，Transformation of rice mediated by Agrobacteriumtumefaciens.，Plant Mol Biol，1997，35205-218；Ishida Y，Saito H，Ohta S.High efficiency transformation of maize(Zea mays L)mediated by Agrobacteriumtumefaciens，Nat Biotech，1996，14745-750；Cheng Ming，E.F.Joyce，PangShengzhi et al.，Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacteriumtumefaciens，Plant Physiol，1997，115971-980)。目前，人們致力于拓寬農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的宿主范圍和轉(zhuǎn)化效率的提高，如柴寶峰等經(jīng)研究建立了單子葉早熟禾農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方案(CHAI Bao-Feng，LIANG Ai-Hua，WANG Wei，Hu Wei，Agrobacterium-mediated Transformation of Kentucky Bliuegrass，Acta BotanicaSinica，2003，45(8)966-973)，發(fā)現(xiàn)影響轉(zhuǎn)基因效率的主要因素有愈傷組織的胚性、光照時(shí)間、共轉(zhuǎn)化時(shí)間、抗生素濃度和選擇壓力。已經(jīng)獲得的單子葉植物的成功轉(zhuǎn)化實(shí)例表明，幼胚及成熟或未成熟胚經(jīng)誘導(dǎo)所產(chǎn)生的胚性愈傷組織是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和再生獲得成功的基礎(chǔ)(殷麗青，張建軍，王惠梅，程磊，王新其，沈革志，提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化頻率的研究，上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué))，2003，21(增刊)43-47)，此外，共培養(yǎng)條件包括溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基成分也是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要因素(李衛(wèi)，郭光沁，鄭國(guó)锠，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化研究的若干新進(jìn)展(評(píng)述)，科學(xué)通報(bào)，2000，45(8)798-807)。如何誘導(dǎo)產(chǎn)生適宜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的非胚性組織，研制適宜的共培養(yǎng)條件是目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物基因轉(zhuǎn)化的任務(wù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法。
本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法，可包括以下步驟1)以經(jīng)消毒滅菌的莖段為外植體，將其切成小塊后，在23-27℃下，用經(jīng)蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基(ACC)懸浮制成的攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液浸泡20-40min進(jìn)行侵染，取出莖塊，再在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下，進(jìn)一步侵染2-4天；所述蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基是在1/8-1/12MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤(6-BA)，α-萘乙酸(NAA)，乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)，葡萄糖，谷氨酸鹽和干酪素水解物；2)將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的蘆薈莖塊置于不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基(ARC)上，在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下恢復(fù)培養(yǎng)6-14天；所述不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤和α-萘乙酸和對(duì)農(nóng)桿菌具有致死作用的抗生素；3)將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊置于叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基(ASC)上，在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)18-22天，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)與篩選；所述叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤，α-萘乙酸，glufosinate-ammonium(商用名為L(zhǎng)iberty，法國(guó)Aventis作物科學(xué)公司)和對(duì)農(nóng)桿菌具有致死作用的抗生素；4)將在叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的愈傷組織或幼嫩叢生芽移至新的叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上在與步驟3)相同的條件下進(jìn)行繼代與篩選培養(yǎng)，獲得叢生芽；5)將叢生芽進(jìn)行壯苗、生根后，得到轉(zhuǎn)基因蘆薈。
對(duì)蘆薈莖段進(jìn)行消毒滅菌的方法可為將蘆薈莖段先在20％ NaClO溶液中浸泡20-30min，再在0.1％升汞(HgCl)溶液中浸泡6-8min。
步驟1)中攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液的制備方法可為將OD650值為0.6-0.8的攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌液中的菌體懸浮于0.6-1倍菌液體積的蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基中即可?？蓪⑻J薈莖塊置于滅菌的濾紙上，在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天條件下，進(jìn)行進(jìn)一步地侵染。
為確定滅菌效果，在用農(nóng)桿菌侵染前，可先將經(jīng)消毒滅菌的蘆薈莖塊置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(AC)上，在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下預(yù)培養(yǎng)5-6天，優(yōu)選的預(yù)培養(yǎng)條件為溫度24℃、光照10小時(shí)/天；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤和α-萘乙酸。
所述步驟1)中用于侵染的農(nóng)桿菌可為任意一種根癌農(nóng)桿菌，如EHA101、C58c1或LBA4404等，優(yōu)選為EHA101；蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基優(yōu)選為在1/10MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤，α-萘乙酸，乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)，葡萄糖，谷氨酸鹽和干酪素水解物；步驟3)叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中的抗生素可為任意一種對(duì)農(nóng)桿菌具有致死作用的抗生素，如頭孢霉素、萬(wàn)古霉素或羧芐青霉素等。
在上述培育方法中所用到的培養(yǎng)基添加劑的濃度為蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，優(yōu)選為3mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L，優(yōu)選為0.18mg/L，AS的濃度為180-220μM，優(yōu)選為200μM，葡萄糖的質(zhì)量百分濃度為0.8-1.2％，優(yōu)選為1％，谷氨酸鹽的濃度為0.3-0.7g/L，優(yōu)選為0.5g/L，干酪素水解物的濃度為0.08-0.12g/L，優(yōu)選為0.1g/L；不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，優(yōu)選為3mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L，優(yōu)選為0.18mg/L；叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，優(yōu)選為3mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L，優(yōu)選為0.18mg/L，glufosinate-ammonium的濃度為2-3mg/L，優(yōu)選為2.5mg/L，抗生素種類(lèi)不同則濃度不同，如選用羧芐青霉素時(shí)，濃度為200-300mg/L，優(yōu)選為250mg/L；叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，優(yōu)選為3mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L，優(yōu)選為0.18mg/L。
步驟1)中對(duì)蘆薈莖塊進(jìn)行侵染的方法優(yōu)選為將經(jīng)消毒的蘆薈莖段切成小塊后，先在25℃下，攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液中浸泡30min，取出莖塊，再在24℃，光照10小時(shí)/天的條件下，在滅菌的濾紙上培養(yǎng)3天；步驟2)中經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的蘆薈莖塊在不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)的條件優(yōu)選為在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)7天；步驟3)中經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊在叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件優(yōu)選為在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)20天。
本發(fā)明提供了一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法，在實(shí)際應(yīng)用方面，該方法將產(chǎn)生以下積極效果(1)加速優(yōu)良外源基因向蘆薈中的轉(zhuǎn)移；(2)為提高蘆薈生長(zhǎng)階段的抗寒、耐鹽能力，擴(kuò)展蘆薈的種植范圍，提高單位面積蘆薈葉片的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)；(3)為增強(qiáng)蘆薈醫(yī)療、保健產(chǎn)品的功效和穩(wěn)定性，改善蘆薈食品的口感，延長(zhǎng)蘆薈食品保鮮期，提高蘆薈化妝品的保濕、防止紫外線效果等諸多具有現(xiàn)實(shí)和產(chǎn)業(yè)化意義的改良工作順利實(shí)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)，從而加速蘆薈的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。此外，本發(fā)明為弄清影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的多肉單子葉植物轉(zhuǎn)基因體系的主要因素，發(fā)掘并利用更廣泛的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因受體資源也具有重要意義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為由蘆薈莖段誘導(dǎo)生成的叢生芽圖1A為pPNT289的物理圖譜圖1B為pPNT290的物理圖譜圖2為不同農(nóng)桿菌-質(zhì)粒載體組合侵染蘆薈莖段后分別在固體培養(yǎng)基和濾紙上共培養(yǎng)3天后X-gluc的染色結(jié)果圖3為蘆薈莖塊在添加有1mg/L、3mg/L、5mg/L glufosinate-ammonium的叢生芽誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天后的生長(zhǎng)情況圖4為蘆薈莖塊在添加有不同濃度(1、2、3、4、5mg/L)glufosinate-ammonium的叢生芽誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天后的存活曲線5為轉(zhuǎn)基因蘆薈的PCR檢測(cè)結(jié)果圖6為轉(zhuǎn)基因蘆薈的ELISA檢測(cè)結(jié)果圖7為蘆薈轉(zhuǎn)基因苗具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法；所用百分含量均為質(zhì)量百分含量。
叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(AC)在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.5mg/L 6-BA和0.15mg/LNAA。
蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用培養(yǎng)基(ACC)在1/10 MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.5mg/L6-BA，0.15mg/L NAA，200μM AS，1％葡萄糖，0.5g/L谷氨酸鹽，0.1g/L干酪素水解物(固體培養(yǎng)基再添加7-8％瓊脂)。
蘆薈恢復(fù)培養(yǎng)基(ARC)在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.5mg/L6-BA，0.15mg/LNAA和250mg/L羧芐青霉素。
蘆薈叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基(ASC)在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.5mg/L6-BA，0.15mg/L NAA，glufosinate-ammonium 2.5mg/L和250mg/L羧芐青霉素。
實(shí)施例1、蘆薈外植體滅菌方法的優(yōu)化以蘆薈莖段為例，對(duì)蘆薈外植體的滅菌方法進(jìn)行優(yōu)化，具體方法為將蘆薈莖段切成約1cm×1cm的小塊，在70％酒精中浸泡30s后，分成四組，分別經(jīng)0.1％升汞溶液(HgCl)滅菌8min、0.1％HgCl溶液滅菌13min、10％次氯酸鈉(NaClO)溶液滅菌15min、20％NaClO溶液滅菌25min，再用無(wú)菌水漂洗3-4次，然后將蘆薈莖塊置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)外植體成活率和污染比率，結(jié)果如表1所示，兼顧成活率和滅菌效率，確定將蘆薈外植體先在20％NaClO溶液中浸泡20-30min，再在0.1％升汞(HgCl)溶液中浸泡6-8min為優(yōu)選的蘆薈外植體滅菌方法。
表1 蘆薈莖段外植體不同滅菌方法效果的比較結(jié)果

實(shí)施例2、用于農(nóng)桿菌侵染的蘆薈外植體的優(yōu)選將蘆薈滅菌后，分別將葉片、葉鞘、莖段切成1cm×1cm的小塊，置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)4-5周，觀察外植體的再生情況，統(tǒng)計(jì)存活數(shù)目及存活比例，結(jié)果如表2所示，確定蘆薈的莖段為最適宜于農(nóng)桿菌侵染的外植體，由其經(jīng)誘導(dǎo)生成的叢生芽如圖1所示。
表2 蘆薈外植體生長(zhǎng)狀況比較結(jié)果

實(shí)施例3、不同農(nóng)桿菌菌系侵染效果的比較將質(zhì)粒載體pPNT289(物理圖譜如圖1A所示)、pPNT290(物理圖譜如圖1B所示)，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA101，經(jīng)篩選得到分別攜帶有pPNT289、pPNT290的重組子，命名為EHA101/pPNT289和EHA101/pPNT290；用同樣方法將質(zhì)粒pPNT289、pPNT290分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58c1，經(jīng)篩選得到分別攜帶有pPNT289、pPNT290的重組子，命名為C58c1/pPNT289、C58c1/pPNT290。收集上述四種OD650值為0.8的重組農(nóng)桿菌菌液的菌體，將菌體懸浮于0.8倍上述菌液體積的蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基(ACC)中，得到農(nóng)桿菌菌液。然后將用ACC液體培養(yǎng)基懸浮制成的四種農(nóng)桿菌菌液對(duì)蘆薈莖段侵染30min，再分別在ACC固體培養(yǎng)基和無(wú)菌空白濾紙上在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下共培養(yǎng)3天，培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)其進(jìn)行X-Gluc染色，染色結(jié)果如圖2所示，計(jì)算經(jīng)侵染的外植體中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率，并進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如表3所示，EHA101/pPNT289的侵染效果明顯優(yōu)于其它組合，經(jīng)EHA101侵染后的外植體中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到約80％，而C58c1侵染后的外植體中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率只有約30％，表明EHA101菌系的整體侵染效果優(yōu)于c58c1菌系，將EHA101確定為優(yōu)選的用于構(gòu)建蘆薈外植體侵染菌株的出發(fā)菌株。
表3 不同農(nóng)桿菌-質(zhì)粒載體組合侵染蘆薈莖段后分別在固體培養(yǎng)基和濾紙上共培養(yǎng)3天后X-gluc的染色結(jié)果

實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因蘆薈的培育及檢測(cè)一、轉(zhuǎn)基因蘆薈的培育以農(nóng)桿菌EHA101為出發(fā)菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育轉(zhuǎn)基因蘆薈，具體的培育過(guò)程包括以下步驟1、農(nóng)桿菌的侵染以蘆薈莖段為外植體，洗凈后，將蘆薈莖段先在20％NaClO溶液中浸泡25min，再在0.1％升汞溶液中浸泡8min進(jìn)行滅菌。用15#手術(shù)刀將滅菌后的蘆薈莖段切成1cm×1cm的小塊。將OD650值為0.7的實(shí)施例3中攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌EHA101/pPNT289菌液中的菌體懸浮于1倍菌液體積的ACC液體培養(yǎng)基中，得到EHA101/pPNT289菌液。在25℃下，將經(jīng)消毒滅菌的蘆薈莖塊置于ACC液體培養(yǎng)基懸浮制成的EHA101/pPNT289菌液中浸泡30min進(jìn)行侵染，取出莖塊，置于無(wú)菌的空白濾紙上，再在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下共培養(yǎng)3天進(jìn)行進(jìn)一步的侵染。
2、恢復(fù)培養(yǎng)將步驟1獲得的經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的蘆薈莖塊置于不添加抗生素篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上，在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下，恢復(fù)培養(yǎng)7天。
3、叢生芽的誘導(dǎo)、篩選及篩選劑適宜濃度的確定1)叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中篩選劑glufosinate-ammonium適宜濃度的確定將步驟2獲得的經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊置于添加有不同濃度(1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L)篩選劑glufosinate-ammonium的叢生芽誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中，在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)，觀察蘆薈外植體生長(zhǎng)及芽誘導(dǎo)情況，培養(yǎng)14天后的蘆薈莖塊在添加有1mg/L、3mg/L、5mg/L glufosinate-ammonium的叢生芽誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖3所示，統(tǒng)計(jì)存活的莖段數(shù)及存活比例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制成曲線圖(圖4，橫坐標(biāo)為篩選劑濃度，縱坐標(biāo)為存活比例)，將成活率50％時(shí)的篩選劑濃度定為其適宜濃度，故確定蘆薈轉(zhuǎn)化中叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中篩選劑glufosinate-ammonium(以bar基因作為選擇標(biāo)記)的適宜濃度為2.5mg/L。
表4 蘆薈莖段在不同濃度glufosinate-ammonium篩選劑下存活比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2)叢生芽的誘導(dǎo)、篩選將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊置于含有2.5mg/L glufosinate-ammonium的叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上，在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)20天，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)與篩選。
4、叢生芽的獲得將步驟3在叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的愈傷組織或幼嫩叢生芽移至新的叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上在與步驟3相同的條件下進(jìn)行繼代與篩選培養(yǎng)，獲得叢生芽。
5、轉(zhuǎn)基因蘆薈的獲得將步驟4獲得的叢生芽進(jìn)行壯苗、生根后，得到轉(zhuǎn)基因蘆薈。
二、轉(zhuǎn)基因蘆薈的檢測(cè)1、轉(zhuǎn)基因蘆薈的PCR檢測(cè)對(duì)步驟一獲得的轉(zhuǎn)基因蘆薈用PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)NPT II基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下引物1(上游引物)5’-TGTTCCGGCTGTCAGCGCAG-3’引物2(下游引物)5’-TCGGCAAGCAGGCATCGCCA-3’采用SDS法提取蘆薈再生苗的總DNA并以此作為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中的NPT II基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94℃5min；然后94℃30s，58℃30s，72℃90s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(泳道MDNA MarkerDL2000，泳道1-8不同的待測(cè)植株，泳道9陰性對(duì)照，泳道10陽(yáng)性對(duì)照)，可擴(kuò)增出大小為476bp DNA片段的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
2、轉(zhuǎn)基因蘆薈的ELISA檢測(cè)用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中NPTII蛋白的表達(dá)情況，采用agdia公司的Pathoscreen kit for neomycin phosphotransferase II試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(1-4PCR陽(yáng)性的待測(cè)植株；5陰性對(duì)照；6-7未進(jìn)行PCR檢測(cè)的待測(cè)植株；8陽(yáng)性對(duì)照)，經(jīng)步驟1 PCR檢測(cè)和步驟2 ELISA檢測(cè)獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因蘆薈(圖7)。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法，包括以下步驟1)以經(jīng)消毒滅菌的莖段為外植體，將其切成小塊后，在23-27℃下，用經(jīng)蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基懸浮制成的攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液浸泡20-40min進(jìn)行侵染，取出莖塊，再在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下，進(jìn)一步侵染2-4天；所述蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基是在1/8-1/12 MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤，α-萘乙酸，乙酰丁香酮，葡萄糖，谷氨酸鹽和干酪素水解物；2)將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的蘆薈莖塊置于不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上，在22-26C、光照8-12小時(shí)/天的條件下恢復(fù)培養(yǎng)6-14天；所述不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤、α-萘乙酸和對(duì)農(nóng)桿菌具有致死作用的抗生素；3)將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊置于叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上，在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)18-22天，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)與篩選；所述叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤、α-萘乙酸、glufosinate-ammonium和對(duì)農(nóng)桿菌具有致死作用的抗生素；4)將在叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的愈傷組織或幼嫩叢生芽移至新的叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上在與步驟3)相同的條件下進(jìn)行繼代與篩選培養(yǎng)，獲得叢生芽；5)將叢生芽進(jìn)行壯苗、生根后，得到轉(zhuǎn)基因蘆薈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中對(duì)蘆薈莖段進(jìn)行消毒滅菌的方法為將蘆薈莖段先在20％NaClO溶液中浸泡20-30min，再在0.1％升汞溶液中浸泡6-8min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液，是將OD650值為0.6-0.8的攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌液中的菌體懸浮于0.6-1倍菌液體積的蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基中制成的；對(duì)蘆薈莖塊在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天條件下，進(jìn)一步侵染是在滅菌的濾紙上進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于在用農(nóng)桿菌侵染前，先將經(jīng)消毒滅菌的蘆薈莖塊置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在22-26℃、光照8-12小時(shí)/天的條件下預(yù)培養(yǎng)5-6天；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了濃度為2.5-4mg/L的6-芐基腺嘌呤和濃度為0.15-0.2mg/L的α-萘乙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述對(duì)蘆薈莖塊進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的條件為溫度24℃、光照10小時(shí)/天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述步驟1)中用于侵染的農(nóng)桿菌出發(fā)菌株為EHA101或C58c1；蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基為在1/10 MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤，α-萘乙酸，乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)，葡萄糖，谷氨酸鹽和干酪素水解物；步驟3)叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中的抗生素為頭孢霉素、萬(wàn)古霉素或羧芐青霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中用于侵染的農(nóng)桿菌出發(fā)菌株為EHA101。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L，AS的濃度為180-220μM，葡萄糖的質(zhì)量百分濃度為0.8-1.2％，谷氨酸鹽的濃度為0.3-0.7g/L，干酪素水解物的濃度為0.08-0.12g/L；不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L；叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2.5-4mg/L，NAA的濃度為0.15-0.2mg/L，glufosinate-ammonium的濃度為2-3mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基中6-BA的濃度為為3mg/L，NAA的濃度為為0.18mg/L，AS的濃度為200μM，葡萄糖的質(zhì)量百分濃度為1％，谷氨酸鹽的濃度為0.5g/L，干酪素水解物的濃度為0.1g/L；不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為3mg/L，NAA的濃度為0.18mg/L；叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基中6-BA的濃度為3mg/L，NAA的濃度為0.18mg/L，glufosinate-ammonium的濃度為2.5mg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述步驟1)中對(duì)蘆薈莖塊進(jìn)行侵染的方法為將經(jīng)消毒的蘆薈莖塊先在25℃下，用經(jīng)蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基懸浮制成的攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液浸泡30min，取出莖塊，再在24℃，光照10小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)3天；所述步驟2)中經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的蘆薈莖塊在不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)的條件為在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)7天；所述步驟3)中經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊在叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件為在24℃、光照10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)20天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種培育轉(zhuǎn)基因蘆薈的方法。該方法包括以下步驟1)以經(jīng)消毒滅菌的莖段為外植體，將其切成小塊后，在23－27℃下，用經(jīng)蘆薈農(nóng)桿菌共培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基懸浮制成的攜帶有目的基因的農(nóng)桿菌的菌液浸泡20－40min進(jìn)行侵染，取出莖塊，再在22－26℃、光照8－12小時(shí)/天的條件下，進(jìn)一步侵染2－4天；2)將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的蘆薈莖塊置于不添加篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)6－8天；3)將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的蘆薈莖塊置于叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上，在22－26℃、光照8－12小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)18－22天；4)將在叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的愈傷組織或幼嫩叢生芽移至新的叢生芽誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上在與步驟3)相同的條件下進(jìn)行繼代與篩選培養(yǎng)，獲得叢生芽；5)將叢生芽進(jìn)行壯苗、生根后，得到轉(zhuǎn)基因蘆薈。
文檔編號(hào)A01H1/06GK1742565SQ20051010907
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2005年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月17日
發(fā)明者何聰芬, 葉興國(guó), 董銀卯, 張佳星, 陳杰, 王艷麗, 徐惠君, 杜麗璞, 趙華, 蘭社益 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)