專利名稱：牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚胎工程領(lǐng)域，特別是涉及牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法。
背景技術(shù)：
?；铙w采卵(OPU)是繼牛體外受精、胚胎移植技術(shù)之后研究并推出的一項(xiàng)胚胎工程技術(shù)。牛活體采集卵母細(xì)胞技術(shù)是一項(xiàng)充分挖掘優(yōu)良母牛繁殖潛能，獲取種源明確的卵母細(xì)胞技術(shù)，它可結(jié)合體外受精技術(shù)為胚胎移植技術(shù)、胚胎干細(xì)胞的研究和建立、胚胎核移植、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、胚胎的性別鑒定等提供可用卵母細(xì)胞和胚胎。目前牛活體采卵的主要方法有內(nèi)窺鏡法和超聲波法。采用內(nèi)窺鏡法采卵效率高于超聲波法，但內(nèi)窺鏡法對(duì)供體牛的傷害較大。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所生物工程室朱裕鼎教授根據(jù)國(guó)外資料改進(jìn)設(shè)計(jì)的我國(guó)第一臺(tái)牛用內(nèi)窺鏡活體采卵儀進(jìn)行?；铙w采卵。常用內(nèi)窺鏡活體采卵法主要包括如下步驟1.采卵前準(zhǔn)備內(nèi)窺鏡鏡筒、組合套管針，采卵針及接卵離心管，用無(wú)水乙醇棉球擦凈內(nèi)窺鏡前端進(jìn)出光源的玻面；磷酸鹽緩沖液(PBS)預(yù)熱配制成沖卵液；用利多卡因(Lidocain)進(jìn)行薦尾間隙硬膜外麻醉，根據(jù)牛體格大小肌肉注射靜松靈，待尾根松馳麻醉成功后，再將CO2氣體充入供體牛的腹腔。
2.穿刺操作者將鈍套管針插入套管，旋轉(zhuǎn)套管針固定卡使兩者固定為一體，然后將鈍套管針小心插入陰道，通過(guò)直腸把握的引導(dǎo)將套管導(dǎo)向陰道穹隆預(yù)定刺入的位置上，套管的方向與?？v向長(zhǎng)軸平行，然后撤出鈍套針，插入有刃套針，并調(diào)整穿刺角度，使套針的方向與母牛的長(zhǎng)軸略向右腹壁偏向10°的夾角，略向上用力刺穿陰道穹隆，到達(dá)腹腔。
3.采卵將采卵針穿入內(nèi)窺鏡的進(jìn)針孔中，采卵針針尖與內(nèi)窺鏡光源截面平行，轉(zhuǎn)動(dòng)螺栓將針固定，注射器將沖卵液注入采卵針中，以潤(rùn)滑采卵針管壁，并給接卵管中注入吸卵液，將采卵針和負(fù)壓泵管連接到接卵管的橡膠塞上。將二氧化碳充氣管從套管拔掉，立即把準(zhǔn)備好的內(nèi)窺鏡插入套管中調(diào)節(jié)固定卡將兩者固定，連結(jié)好攝像機(jī)連線，把內(nèi)窺鏡接入冷光源。操作者一手在直腸隔腸壁握住欲采一側(cè)卵巢，另一手握內(nèi)窺鏡柄不斷調(diào)整內(nèi)窺鏡與卵巢的位置，在卵巢與內(nèi)窺鏡之間不能有腸壁等阻隔，操作者根據(jù)屏幕上的圖像，改變卵巢的位置來(lái)展示卵巢上卵泡、黃體大小形態(tài)及其卵巢表面的情況，并確定要穿刺的卵泡，操作者讓助手推進(jìn)采卵針。擰緊螺栓將針的后端固定，操作者一手把握卵巢，一手把握內(nèi)窺鏡鏡柄前后移動(dòng)，并將針頭的斜面貼近卵泡壁，在將要穿入卵泡時(shí)，腳踩真空泵開關(guān)，將卵泡液、卵母細(xì)胞吸出。
上述采卵方法的缺點(diǎn)是對(duì)牛陰道穹窿、卵巢的傷害均較大，從而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量及牛的壽命。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，盡量減少對(duì)供體牛的傷害，同時(shí)使采卵工藝更加程序化，簡(jiǎn)單化，提高采卵效率。
牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，主要包括采卵前準(zhǔn)備、穿刺和采卵三個(gè)步驟，其特征在于穿刺步驟中用細(xì)套簡(jiǎn)將穿刺棒送入陰道穹窿，穿刺成功后撤出穿刺棒，導(dǎo)入引導(dǎo)棒，再將細(xì)套筒撤出，導(dǎo)入粗套筒，將內(nèi)窺鏡插入粗套筒內(nèi)開始采卵。與改進(jìn)前相比，用細(xì)套筒將穿刺棒送入陰道穹窿，減小了對(duì)陰道穹窿損傷；穿刺后替換成粗套筒，加大了采卵視野面，可以更清晰的觀察到卵巢上卵泡位置，減少了對(duì)卵巢的損壞。
所述采卵步驟中，采卵針、沖液口、內(nèi)窺鏡光源的位置在內(nèi)窺鏡顯示屏上相對(duì)固定，即采卵針在內(nèi)窺鏡光源“5”點(diǎn)位置上。與改進(jìn)前內(nèi)窺鏡光源與采卵針位置不固定相比，“5”點(diǎn)位置不但可以在顯示器上標(biāo)記出針位置，增加了采卵的準(zhǔn)確性，而且可以試看針斜面，避免了出針劃傷卵巢，從而可減少了對(duì)卵巢的傷害。
所述采卵前準(zhǔn)備中供體牛采用饑餓法，使其瘤胃內(nèi)容物減少，瘤胃前移，增加了穿刺的安全性，避免誤傷瘤胃；與改進(jìn)前相比，牛只腹腔不注入CO2氣體，節(jié)約了CO2氣體。
所述內(nèi)窺鏡上安裝有沖液口。在采卵過(guò)程中，血黏液的出現(xiàn)會(huì)造成視野模糊，在內(nèi)窺鏡上加裝有沖液口，用生理鹽水沖洗血黏液，可以清晰視野；同時(shí)可以通過(guò)沖液口注入雙抗消炎。與改進(jìn)前相比，窺鏡上的血黏液不再用直腸內(nèi)的手清除，這樣不但操作簡(jiǎn)便，而且減少了供體牛直腸的損傷。
所述套筒配有套筒刷。采卵步驟中，套筒內(nèi)若濺有血沫，在不撤出套筒的情況下，撤出內(nèi)窺鏡探頭，用套筒刷刷拭套筒。這樣就改變了以往需要撤出套筒才能刷拭，減少了反復(fù)插入套筒造成對(duì)牛只陰道穹隆的損傷。
所述采卵步驟中，增加有消毒器械槽，對(duì)采卵所用的器械進(jìn)行清洗消毒，保證采卵過(guò)程的無(wú)菌操作。
本發(fā)明牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，采卵工藝更加程序化，簡(jiǎn)單化，減少了對(duì)供體牛的瘤胃、陰道穹窿及卵巢的傷害，減小了在操作過(guò)程中供體牛的損傷，同時(shí)提高了采卵效率。


圖1采卵時(shí)位置示意圖①術(shù)者 ②助手 ③采卵儀 ④抽氣泵 ⑤靜松靈、利多卡因、采卵液及注射器 ⑥0.1％新潔而滅、0.9％生理鹽水 ⑦酒精棉球、碘酒、石蠟油 ⑧器械槽具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例11采卵前準(zhǔn)備1.1采卵器材內(nèi)窺鏡采卵儀、套筒(粗、細(xì)各一個(gè))、穿刺棒、導(dǎo)管、集卵管、采卵針、引導(dǎo)棒、套筒刷1.2物品、藥劑1)、物品25ml采卵液/頭 酒精棉球 碘酒棉球 滅菌生理鹽水 10ml一次性注射器五個(gè)剪毛剪一把 直剪一把鑷子一把20ml玻璃注射器一個(gè) 器械車2)、藥劑2％鹽酸利多卡因(按10ml/頭牛準(zhǔn)備) 5％靜松靈一盒 1支青霉素/頭 1支鏈霉素/頭 蘇醒靈一盒 1210消毒液 0.1％新潔而滅消毒液(20ml/頭準(zhǔn)備)1.3牛只的準(zhǔn)備1.3.1供體牛采卵前絕食24小時(shí)。
1.3.2將牛牽到保定架內(nèi)保定堅(jiān)實(shí)、牢固。
1.3.3 5％靜松靈小劑量鎮(zhèn)靜，根據(jù)個(gè)體差異、敏感程度選擇適宜劑量，一般為0.3-1.0ml肌注。
1.3.4 2％鹽酸利多卡因薦尾間隙硬膜外傳導(dǎo)麻醉1.3.4.1找到薦尾間隙并剪毛；1.3.4.2 5％碘酊棉球涂布消毒，而后用75％酒精脫碘；1.3.43利多卡因劑量4ml--10ml，視牛對(duì)麻醉效果而定；1.3.4.4薦尾間隙硬膜外局部傳導(dǎo)麻醉選用滅菌9#長(zhǎng)針，注射器可選用5ml或10ml一次性注射器；1.3.4.5先用針頭對(duì)準(zhǔn)薦尾間隙，找好下針位置穿刺，針頭與水平面呈45-60度角，刺到硬膜外腔內(nèi)；1.3.4.6然后將針管接到針頭上，先回抽注射器芯，觀察有無(wú)回血，無(wú)回血時(shí)將麻醉劑推入。判斷麻醉效果是否確實(shí)，以牛尾部完全松弛、肛門及會(huì)陰部輕觸不收縮為準(zhǔn)；1.3.5麻醉前先清除直腸內(nèi)糞便。
1.3.6按要求麻醉。
1.3.7要求接通電源(220v)，調(diào)好抽氣泵壓力55mmHg。
1.3.8清洗外陰1.3.8.1先用清水洗；1.3.8.2 0.1％新潔而滅消毒及沖洗，停滯2MIN；1.3.8.3滅菌0.9％生理鹽水沖洗；1.3.8.4吸水紙擦干。
2穿刺2.1一只手帶好長(zhǎng)臂手套，涂布潤(rùn)滑劑伸入直腸；2.2穿刺棒在細(xì)套筒中送入陰道穹窿；2.3控制套筒的手與直腸內(nèi)的手配合，使其前端頂住子宮頸口正上方(陰道穹窿)，然后直腸內(nèi)的手抬起，穿刺方向偏右上方(避開瘤胃)，將穿刺棒推出套管，一次用力穿刺，撤出穿刺棒(可聽到“呋呋”進(jìn)氣聲)；2.4將細(xì)引導(dǎo)棒穿入細(xì)套筒直腸內(nèi)的手隔直腸握住引導(dǎo)棒，拔出細(xì)套筒然后將粗套筒導(dǎo)入，最后拔出引導(dǎo)棒至此穿刺完畢。
2.5將窺鏡管插入粗套筒推入。
3采卵3.1集卵管、采卵針內(nèi)吸入少量采卵液，將采卵針?biāo)腿脶樀溃压芊湃胄g(shù)者下衣口袋中等待扎針。
3.2術(shù)者直腸內(nèi)手握卵巢，靠近套筒端輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)通過(guò)顯示器尋找適宜卵泡(直徑2毫米至8毫米)。
3.3術(shù)者將適宜的卵泡轉(zhuǎn)到時(shí)鐘“5點(diǎn)”位置，助手先踩踏板隨后將針尖刺入卵泡內(nèi)吸引(針尖斜口向下)。
3.4采卵過(guò)程中，術(shù)者直腸內(nèi)的手輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)卵巢，助手輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)采卵針以達(dá)到多方位吸引。
3.5吸引完畢后，助手先撤針再抬腳。
3.6吸采卵液使卵母細(xì)胞進(jìn)入采卵管，至此一個(gè)卵泡采完，或每吸一針拔出后用吸有采卵液的注射器緩慢將卵泡液反沖集卵管中。
3.7以同樣的方法采集兩側(cè)卵巢上的適宜卵泡。
3.8每采完一頭牛應(yīng)由沖液孔推入100萬(wàn)單位青霉素及160萬(wàn)單位鏈霉素各一只(0.9％生理鹽水稀釋20毫升)。
4采卵后的工作4.1采卵結(jié)束，將牛牽走；如有必要注射與靜松靈同等劑量的蘇醒靈。
4.2所用采卵針、導(dǎo)管用酒精沖洗三遍，再用蒸餾水沖洗三遍，涼干等待氣體滅菌，金屬采卵針高壓滅菌備用。
4.3內(nèi)窺鏡套管，穿刺棒流水沖凈酒精消毒涼干備用。
4.4針道刷凈，進(jìn)液孔蒸餾水沖凈(禁止用生理鹽水以防止結(jié)晶堵塞)備用。
5采卵過(guò)程中遇到的情況及處理方法。
5.1如穿刺不徹底(有膜)，必須進(jìn)行第二次穿刺。
5.2如視野模糊不清，還可以用生理鹽水由沖液口孔沖洗。
5.3如視野仍有血沫影響視野時(shí)可將窺鏡撤出，用套筒刷刷拭套筒內(nèi)壁。
權(quán)利要求
1.牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，主要包括采卵前準(zhǔn)備、穿刺和采卵三個(gè)步驟，其特征在于穿刺步驟中用細(xì)套筒旋轉(zhuǎn)固定穿刺棒送入陰道穹窿正上方，穿刺成功后將穿刺棒撤出，導(dǎo)入引導(dǎo)棒，再將細(xì)套筒撤出，導(dǎo)入粗套筒，將內(nèi)窺鏡插入粗套筒內(nèi)。
2.權(quán)利要求1所述的牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，所述采卵步驟中將采卵針、沖液口、內(nèi)窺鏡光源在內(nèi)窺鏡顯示屏上相對(duì)固定，采卵針在內(nèi)窺鏡光源“5”點(diǎn)位置上。
3.權(quán)利要求2所述的牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，所述采卵前準(zhǔn)備步驟中讓供體牛饑餓24小時(shí)。
4.權(quán)利要求1所述的牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，所述內(nèi)窺鏡上安裝有沖液口。
5.權(quán)利要求1所述的牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，所述粗套筒配有套筒刷。
6.權(quán)利要求1所述的牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，所述采卵步驟中還增加有消毒器械槽。
全文摘要
牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，主要包括采卵前準(zhǔn)備、穿刺和采卵三個(gè)步驟，其特征在于穿刺步驟中用細(xì)套筒將穿刺棒送入陰道穹窿，穿刺成功后撤出穿刺棒，導(dǎo)入引導(dǎo)棒，再將細(xì)套筒撤出，導(dǎo)入粗套筒，將內(nèi)窺鏡插入粗套筒內(nèi)開始采卵。本發(fā)明牛內(nèi)窺鏡活體采卵方法，采卵工藝更加程序化，簡(jiǎn)單化，減少了對(duì)供體牛的瘤胃、陰道穹窿及卵巢的傷害，減小了在操作過(guò)程中供體牛的損傷，同時(shí)提高了采卵效率。
文檔編號(hào)A61D19/00GK1759815SQ20051008694
公開日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2005年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月21日
發(fā)明者李繼成, 吳亦芳, 張紅霞, 張向利 申請(qǐng)人:北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司