專利名稱：一種共顯性標(biāo)記方法及其在植物育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物共顯性標(biāo)記(Codominant-SCAR)方法。具體地說，是將SCAR標(biāo)記原理與多引物PCR技術(shù)結(jié)合來建立的一種方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明利用該方法對(duì)12份番茄近等基因系進(jìn)行了遺傳鑒定。
背景技術(shù)：
1992年Tanksley等發(fā)表了以RFLP標(biāo)記為主的高密度番茄連鎖圖譜，平均每1.2cM(厘米)就有一個(gè)標(biāo)記(Tanksley等，1992)。此后，番茄圖譜不斷被各種標(biāo)記飽和(Http://www.sgn.cornll.edu/maps/tornato arabidopsis)。擬南芥基因組測序的完成加速了番茄圖譜上分子標(biāo)記的飽和，例如利用番茄已有的EST序列與擬南芥基因組序列信息開發(fā)的COS(Conserved OrthologSet)標(biāo)記技術(shù)使番茄圖譜的COS標(biāo)記增加到300個(gè)。RFLP技術(shù)是基于物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生不同大小的DNA片段，用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，把與被標(biāo)記DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。高密度的分子圖譜和分子標(biāo)記為番茄的分子育種奠定了基礎(chǔ)。但是RFLP、COS等標(biāo)記存在費(fèi)用高，步驟復(fù)雜，周期長，要求高質(zhì)量DNA等缺點(diǎn)，在輔助育種中很難推廣，并且RFLP標(biāo)記要使用放射性同位素。
因此，在分子育種中一些RFLP、COS等標(biāo)記常被轉(zhuǎn)化成簡單方便的SCAR(特征性片段擴(kuò)增區(qū)域，sequence characterized amplifiedregion)、CAPS(酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列，cleaved amplified polymorphismsequences)等標(biāo)記。SCAR標(biāo)記一般是由RFLP、RAPD、AFLP等標(biāo)記轉(zhuǎn)換而來，其基本原理是根據(jù)已獲得的標(biāo)記片段的序列信息，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，然后通過PCR來揭示多態(tài)性。
本發(fā)明利用SCAR標(biāo)記的原理和多引物PCR技術(shù)，建立了一種共顯性標(biāo)記技術(shù)(Codominant-SCAR)，即在獲得與父本、母本基因型一致的顯性SCAR標(biāo)記的基礎(chǔ)上，同時(shí)將父母本的特異引物加入到同一PCR反應(yīng)體系中，得到了能同時(shí)鑒定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶。這樣本發(fā)明結(jié)合了SCAR標(biāo)記和多引物PCR技術(shù)原理建立了能同時(shí)檢測父本、母本及其雜合體的基因型的共顯性標(biāo)記方法。該標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有重復(fù)性好、迅速、簡便、低成本的特點(diǎn)，非常適合于樣品的大量分析。對(duì)于作物分子育種和構(gòu)建遺傳圖譜而言更具優(yōu)越性。由于共顯性標(biāo)記提供的信息量多，對(duì)于鑒定雜交種子的純度，以及為農(nóng)作物新品種審定、保護(hù)品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)等方面也提供了方法和技術(shù)借鑒。對(duì)于番茄、水稻、玉米、擬南芥等序列信息豐富的植物，RFLP、RAPD、AFLP、COS等標(biāo)記和已克隆的基因都可能根據(jù)其雙親的序列信息設(shè)計(jì)特異引物，將其轉(zhuǎn)換成共顯性的SCAR標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
(一)、要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種植物分子育種方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種植物共顯性標(biāo)記(Codominant-SCAR)的方法在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種植物共顯性標(biāo)記(Codominant-SCAR)的方法在植物近等基因系遺傳鑒定中的應(yīng)用。
(二)、技術(shù)方案本發(fā)明的植物分子育種方法包括(a)對(duì)作物已有的RFLP、AFLP、CAPS、RAPD、COS等標(biāo)記的父本、母本的DNA序列，進(jìn)行同源比較；(b)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)分別獲得與父、母本材料基因型一致的顯性SCAR引物；
(c)同時(shí)將父母本的特異引物加入到同一PCR反應(yīng)體系中，得到能同時(shí)鑒定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶。
按照本發(fā)明，上游引物分別處于其特異的DNA序列內(nèi)，每個(gè)引物只能與相應(yīng)的同源序列配對(duì)，而下游引物則是同一個(gè)引物。
按照本發(fā)明，父、母本一致的顯性SCAR上游引物分別為SCAR-A和SCAR-B，下游為T0974R。
SCAR-A序列為5’-GTTCTCTCCGCCGTCGTTCG-3’；SCAR-B序列為5’-TCAGACCCATATGAAGTTGTCA-3’；T0974R序列5’-ACTTGCAAAATCAAGGGTCG-3’。
PCR體系如下10mmol/L SCAR-A 0.5μL10mmol/L SCAR-B 1.0μL10mmol/L T0974R 0.5μL模板 50ng10×PCR buffer2.5μL25mmol/L Mg2+1.0μLTaqDNA聚合酶 1.25U10mmol/L dNTPs2.5μL去離子水 加至25μLPCR擴(kuò)增的程序92℃ 3min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)92℃ 1min，64℃ 1min，72℃ 2min，最后72℃ 8min，保存溫度4℃。
(三)、有益效果本發(fā)明將SCAR標(biāo)記和多引物PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)綜合在一起，同時(shí)將父、母本的特異SCAR引物加入到同一PCR反應(yīng)體系中，得到同時(shí)鑒定父本、母本及其雜合體基因型的特異譜帶，從而建立了共顯性SCAR(Codominant-SCAR)標(biāo)記方法。該標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有重復(fù)性好、迅速、簡便、低成本、信息量大等特點(diǎn)，非常適合于樣品的大量分析。對(duì)于分子育種、構(gòu)建遺傳圖譜、鑒定雜交種子的純度、農(nóng)作物新品種審定、保護(hù)品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)等方面均具有較大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1分別為利用CAPS引物、引物SCAR-A和SCAR-B對(duì)TA1527與E6203的PCR擴(kuò)增結(jié)果，以及利用引物SCAR-A+SCAR-B對(duì)其F1的擴(kuò)增結(jié)果。所標(biāo)示的M為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2為番茄TA1527，3為番茄E6203；圖2是利用共顯性標(biāo)記技術(shù)Codominant-SCAR對(duì)TA517的12個(gè)近等基因系遺傳鑒定的電泳圖，所標(biāo)示的M為100bp標(biāo)準(zhǔn)分子量，1A為番茄E6203，67為番茄TA517，75為TA1527，68～79分別為TA517的12個(gè)近等基因系。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1共顯性標(biāo)記技術(shù)Codominant-SCAR的建立番茄材料TA1527，E6203，以及T0974播種于溫室，待幼苗長到6～8片真葉時(shí)，提取細(xì)嫩葉片中的DNA進(jìn)行分析。DNA提取按照常規(guī)CTAB(Williamson VM.等，1994)小量提取方法進(jìn)行，DNA貯存于-20℃的冰箱中備用。
以COS標(biāo)記T0974為研究對(duì)象，先將其轉(zhuǎn)化成為CAPS標(biāo)記，并得到了親本材料TA1527、E6203的CAPS標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物測序(三博遠(yuǎn)志公司測序)，獲得測序結(jié)果分別命名為T0974-2F、T0974-3R。
對(duì)T0974-2F和T0974-3R序列用DNAMAN進(jìn)行同源比較，再用Primer Pmemier5.0對(duì)T0974-2F、T0974-3R序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，分別獲得與TA1527和E6203基因型一致的顯性SCAR引物，并命名為SCAR-A和SCAR-B。引物設(shè)計(jì)的最顯著特點(diǎn)是SCAR-A和SCAR-B的上游引物分別處于其特異的DNA序列內(nèi)，每個(gè)引物只能與相應(yīng)的同源序列配對(duì)，而下游引物則是同一個(gè)引物。SCAR-A和SCAR-B分別與下游引物配對(duì)擴(kuò)增得到分子量不同的PCR產(chǎn)物。
SCAR-A、SCAR-B及同時(shí)加入SCAR-A+SCAR-B的優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序分別為SCAR-A和SCAR-B的體系相同，均為50ng模板、2.5μL 10×PCR buffer、1.0μL Mg2+(25mmol/L)、1.25U TaqDNA聚合酶、0.5μL SCAR-A(10mmol/L)或SCAR-B(10mmol/L)、0.5μLT0974R(10mmol/L)、2.5μL dNTPs(10mmol/L)，加去離子水至25μL。
SCAR-A+SCAR-B的優(yōu)化體系如下引物比例分別為SCAR-A(10mmol/L)的上游引物0.5μL、SCAR-B(10mmol/L)的上游引物1.0μL及其共有的下游引物(10mmol/L)0.5μL，其余成分相同。
SCAR-A、SCAR-B及SCAR-A+SCAR-B的PCR擴(kuò)增的程序相同92℃ 3min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)92℃ 1min，64℃ 1min，72℃ 2min，最后72℃ 8min，保存溫度4℃。
表1引物名稱及序列

結(jié)果表明(圖1)CAPS引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物相同，約為370bp，E6203與TA1527都有此譜帶；根據(jù)E6203的序列設(shè)計(jì)的特異引物SCAR-B經(jīng)擴(kuò)增后僅在E6203中獲得270bp的PCR產(chǎn)物，而TA1527沒有該特異譜帶，表明該譜帶為與E6203基因型一致的顯性SCAR標(biāo)記；根據(jù)TA1527的序列設(shè)計(jì)的特異引物SCAR-A經(jīng)擴(kuò)增后僅在TA1527中獲得200bp的PCR產(chǎn)物，而E6203沒有該特異譜帶，表明該譜帶為與TA1527基因型一致的顯性SCAR標(biāo)記；同時(shí)加入SCAR-A和SCAR-B對(duì)F1的PCR擴(kuò)增結(jié)果分別獲得了一個(gè)與E6203和TA1527基因型一致的譜帶，兩譜帶的多態(tài)性正是兩個(gè)引物多態(tài)性的疊加，分子量為270bp和200bp，表明獲得了可同時(shí)區(qū)分親本TA1527、E6203及其雜交一代的共顯性SCAR標(biāo)記。
實(shí)施例2對(duì)TA517的12個(gè)近等基因系的遺傳鑒定應(yīng)用了番茄材料TA517，TA1527，E6203，以及TA517的12個(gè)近等基因系02P68、02P69、02P70、02P71、02P72、02P73、02P74、02P75、02P76、02P77、02P78、02P79。所有試材播種于溫室，待幼苗長到6～8片真葉時(shí)，提取細(xì)嫩葉片中的DNA進(jìn)行分析。DNA提取、引物設(shè)計(jì)以及PCR條件按照實(shí)施例1進(jìn)行。
結(jié)果表明(附圖2)67、75、68、69、71及72的多態(tài)性表現(xiàn)一致，得到一條270bp的譜帶，1A、70、73、74、76、78及79多態(tài)性表現(xiàn)一致，得到一條200bp的譜帶，與預(yù)期結(jié)果一致(王孝宣.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文，2004，26-30)。
權(quán)利要求
1.一種植物共顯性標(biāo)記的方法，其特征在于包括以下步驟(a)對(duì)作物已有的RFLP、AFLP、CAPS、RAPD、COS等標(biāo)記的父本、母本的DNA序列進(jìn)行同源比較；(b)引物設(shè)計(jì)分別獲得與父、母本材料基因型一致的顯性SCAR引物；(c)同時(shí)將父母本的特異引物加入到同一PCR反應(yīng)體系中，得到能同時(shí)鑒定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于與父、母本一致的顯性SCAR上游引物分別為SCAR-A和SCAR-B，下游引物為T0974R，其中SCAR-A序列為5’-GTTCTCTCCGCCGTCGTTCG-3’；SCAR-B序列為5’-TCAGACCCATATGAAGTTGTCA-3’；T0974R序列為5’-ACTTGCAAAATCAAGGGTCG-3’。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于上游引物分別處于其特異的DNA序列內(nèi)，每個(gè)引物只能與相應(yīng)的同源序列配對(duì)，而下游引物則是同一個(gè)引物。
4.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于PCR體系如下10mmol/L SCAR-A 0.5μL10mmol/L SCAR-B 1.0μL10mmol/L T0974R 0.5μL模板50ng10×PCR buffer 2.5μL25mmol/L Mg2+1.0μLTaqDNA聚合酶1.25U10mmol/L dNTPs 2.5μL去離子水加至25μL
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中PCR擴(kuò)增的程序均為92℃3min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)92℃1min，64℃1min，72℃2min，最后72℃8min，保存溫度4℃。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的方法在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的農(nóng)作物為番茄、水稻、玉米或擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種共顯性標(biāo)記(Codominant－SCAR)方法。其步驟包括對(duì)作物已有的RFLP、AFLP、CAPS、RAPD、COS等標(biāo)記的父本、母本的DNA序列，進(jìn)行同源性比較后，利用Primer5或其它軟件設(shè)計(jì)引物，分別獲得與父、母本材料基因型一致的顯性SCAR引物。在此基礎(chǔ)上，同時(shí)將父、母本的特異引物加入到同一PCR反應(yīng)體系中，得到了能同時(shí)鑒定父本、母本及其雜合體基因型的特異譜帶。該標(biāo)記在應(yīng)用上具有重復(fù)性好、迅速、簡便和成本低的特點(diǎn)，非常適合于樣品的大量分析。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1769493SQ20051008644
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者杜永臣, 國艷梅, 王孝宣, 高建昌, 朱德蔚, 戴善書 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所