專利名稱：一種抗灰霉病的生物殺菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)用生物殺菌劑及其加工方法，確切地說是一種抗灰霉病的生物殺菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
由灰葡萄孢(Botrytis cinerea PersexFr)所致的灰霉病(Botrytis cinerea Pers)，不但是我國草莓危害較嚴(yán)重的病害之一，而且殃及其他園藝作物，也是世界性的重要的園藝作物病害。目前又出現(xiàn)單抗、雙抗甚至多抗的灰霉病菌菌株，防止該類病害的任務(wù)艱巨。化學(xué)防治草莓病除帶來環(huán)境污染和病原菌產(chǎn)生抗生以外，重要的是草莓作為一種鮮果品，因?qū)r(nóng)藥的殘留問題特別敏感，給人的健康帶來心理影響。當(dāng)前無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)和消費(fèi)熱潮正在興起，隨著化學(xué)物質(zhì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的限制越來越多，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中減少植物病蟲害病發(fā)揮重要增產(chǎn)作用的農(nóng)藥，無疑提出了更高要求，各國研究者正在尋求天然生物源農(nóng)藥，通過篩選和利用抗灰霉菌的有益微生物及其代謝產(chǎn)物的生物防治方法，已成為灰霉病控制的一條重要而有效的途徑。
木霉菌(Trichoderma spp)屬于半知菌類的叢孢菌綱，叢梗孢目叢梗孢科，廣泛存在土壤、根圍、葉圍、種子和球莖等生態(tài)環(huán)境中。由于木霉菌的廣泛適應(yīng)性、廣譜性及多機(jī)制性，一直是植病生防學(xué)家研究的重點(diǎn)對(duì)象，目前研究的熱點(diǎn)是通過生物技術(shù)方法有目的地改造從自然界分離篩選到的木霉菌，以獲得新型菌株，例如用紫外線照射誘變、原生質(zhì)體融合和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)等研制開發(fā)新型木霉菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本生物殺菌劑根據(jù)木霉良好的生物防治特性，采用木霉為出發(fā)菌株，通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得具有抗灰霉菌活性的生物殺菌劑，所要解決的問題是培養(yǎng)基的篩選和發(fā)酵過程的控制。
本生物殺菌劑是將木霉接種在液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后經(jīng)分離得到的(即發(fā)酵液)。
所述的培養(yǎng)液以麥麩或/和稻糠或/和馬鈴薯為基料(碳源)，幾丁質(zhì)為誘導(dǎo)物，輔之其他基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分和水配制而的。麥麩或/和稻糠經(jīng)干燥粉碎后加適量水煎煮，分離，取其汁液配制培養(yǎng)液，而馬鈴薯是鮮品去皮后粉碎，取鮮粉配制培養(yǎng)液，麥麩、稻糠、馬鈴薯以下簡(jiǎn)稱碳源粉。各組份有以下重量百分比碳源粉 1～5％幾丁質(zhì) 0.5～3.5％FeSO40.01～0.03％KH2PO40.02～0.2％K2HPO40.05～0.25％MgSO40.05～0.35％水 余量。
優(yōu)選碳源粉 2～4％幾丁質(zhì) 1～3％FeSO40.015～0.025％KH2PO40.05～0.15％K2HPO40.1～0.2％MgSO40.1～0.3％水 余量。
最佳碳源粉 3％幾丁質(zhì) 2％FeSO40.02％KH2PO40.1％K2HPO40.15％MgSO40.2％水 余量。
將配制好的培養(yǎng)液調(diào)pH5.7～6.5，高壓滅菌后接種，于25～40℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)5～10天。發(fā)酵結(jié)束后過濾分離，若發(fā)酵終止時(shí)pH＞4，則調(diào)pH≤4，沉降過濾，濾液調(diào)pH5.8～6.2，即是具有抗灰霉病活性的生物殺菌劑。
優(yōu)選培養(yǎng)液pH6.0～6.2，高壓滅菌后接種，于26～28℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)6～8天。后處理過程同上。
所述的幾丁質(zhì)是由蟹、蝦、貝類、昆蟲等甲殼動(dòng)物的外殼經(jīng)酸解、洗滌、干燥得到的甲殼質(zhì)，主要成分是線性高分子多糖和少量的蛋白質(zhì)。酸解一般使用稀鹽酸，也可以使用工業(yè)鹽酸。
本發(fā)酵液經(jīng)江蘇省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行毒性試驗(yàn)(試驗(yàn)編號(hào)20020571)，大鼠急性經(jīng)口LD50＞4640mg/Kg，屬低毒級(jí)。
本發(fā)酵液作為殺菌劑使用需兌水稀釋50倍以上，50倍稀釋液畝用量20～30Kg，葉面噴施，三天后防效為80％，五天后防效達(dá)99％，與此同時(shí)對(duì)作物生長(zhǎng)有顯著的刺激作用。
本發(fā)明原料易得、價(jià)格低廉、工藝簡(jiǎn)單，使用方便，對(duì)環(huán)境無污染，無發(fā)酵物殘留，是名副其實(shí)的綠色無公害殺菌劑。但產(chǎn)品熱穩(wěn)定性較差，不同溫度貯藏半年，10℃以下防效95％以上，15℃以下防效80％以上，25℃以下防效65％以上，宜10℃以下低溫貯藏。
具體實(shí)施例方式
1、碳源粉的制備取麥麩或稻糠干燥后粉碎，或者鮮馬鈴薯去皮后粉碎，備用。
2、幾丁質(zhì)的制備取蟹殼、蝦皮或貝殼剔除殘余(剩)腐肉，洗凈后烘干、粉碎，投入工業(yè)鹽酸中浸泡24小時(shí)，并不斷攪拌，水洗至中性，再蒸餾水洗去氯離子，干燥后粉碎，備用。
3、培養(yǎng)液配制與發(fā)酵培養(yǎng)取麥麩或稻糠粉25～30g，加入200～350ml，煮沸0.5～1小時(shí)，過濾，待濾液冷卻后加入0.2g FeSO4、1g KH2PO4、1.5g K2HPO4、2g MgSO4和20g幾丁質(zhì)，或者取鮮馬鈴薯粉25～30g、加入200～350ml水中，然后加入0.2g FeSO4、1g KH2PO4、1.5g K2HPO4、2g MgSO4和20g幾丁質(zhì)，用蒸餾水稀釋定容至1000ml，最后用檸檬酸鈉溶液調(diào)pH至6.0～6.2。
將培養(yǎng)液高壓滅菌后接種，加入無雜菌木霉孢子懸浮液1ml，含孢子1×106個(gè)/ml。于26～28℃條件下發(fā)酵1周左右，測(cè)定終點(diǎn)pH，當(dāng)pH≤5.3時(shí)過濾分離，并用草酸調(diào)pH≤4，沉降過濾分離，用三聚磷酸鈉溶液調(diào)pH5.8～6.2，即是生物殺菌劑。10℃以下低溫貯藏。
權(quán)利要求
1.一種抗灰霉病的生物殺菌劑，其特征在于由木霉接種在含麥麩或/和稻糠汁液或/和馬鈴薯以及幾丁質(zhì)的液體培養(yǎng)基上經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、分離得到的pH5.8～6.2的發(fā)酵液即是生物殺菌劑。
2.一種抗灰霉病的生物殺菌劑的制備方法，包括液體培養(yǎng)基的配制、滅菌、接種、發(fā)酵培養(yǎng)和分離，其特征在于木霉接種在pH5.7～6.5的液體培養(yǎng)基上于25～40℃條件下發(fā)酵5～10天；所述的液體培養(yǎng)基含碳源粉1～5％、幾丁質(zhì)0.5～3.5％、FeSO40.01～0.03％、KH2PO40.02～0.2％、K2HPO40.05～0.25％、MgSO40.05～0.35％、水余量；分離后的發(fā)酵液調(diào)pH5.8～6.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于木霉接種在pH6.0～6.2的液體培養(yǎng)基上于26～28℃條件下發(fā)酵6～8天；所述的液體培養(yǎng)基含碳源粉2～4％、幾丁質(zhì)1～3％、FeSO40.015～0.025％、KH2PO40.05～0.15％、K2HPO40.1～0.2％、MgSO40.1～0.3％、水余量。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于液體培養(yǎng)基含碳源粉汁液3％、幾丁質(zhì)2％、FeSO40.02％、KH2PO40.1％、K2HPO40.15％、MgSO40.2％、水余量。
全文摘要
一種抗灰霉病的生物殺菌劑，由木霉菌直接發(fā)酵制備得到的生物殺菌劑。發(fā)酵是在含麥麩或稻糠或馬鈴薯為基料、幾丁質(zhì)為誘導(dǎo)物和其他基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)基中于25～40℃條件發(fā)酵5～10天。本生物殺菌劑經(jīng)口LD
文檔編號(hào)A01N63/02GK1685834SQ200510039128
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月25日
發(fā)明者蔣立科, 岳永德, 羅曼, 花日茂, 湯鋒, 操海群 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)