專利名稱：一種改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥苗端轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域和植物基因工程領(lǐng)域；主要涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥苗端轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1984年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草(Leone A et al，1991)以來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)日益得到廣泛的應(yīng)用，它對分子遺傳學(xué)研究和植物的改良都有特別重要的意義。
植物基因的轉(zhuǎn)化方法主要包括直接的基因轉(zhuǎn)移(Sato T et al，1992)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Finlay C A et al，1989)。直接的基因轉(zhuǎn)移主要包括PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電激介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移以及基因槍(Wates M M et al，1995)轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化都有成功的例證，但也有共同的、明顯的缺點一是原生質(zhì)體的培養(yǎng)、再生受基因型限制；二是原生質(zhì)體再生過程常常會產(chǎn)生變異，轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)很高比例的不育株和白化苗?；驑屴D(zhuǎn)化法避開了原生質(zhì)體再生培養(yǎng)的困難和克服了當(dāng)時所認(rèn)為的農(nóng)桿菌宿主的限制。在問世后即獲得了廣泛的應(yīng)用?？蛇m用于不同的物種以及同一種物種的不同品種。用這種方法轉(zhuǎn)化成功的植物包括幾乎所有的主要禾谷類作物，如小麥、玉米、水稻、大麥、高梁等等。但是，基因槍轉(zhuǎn)化方法也有明顯的缺點，轉(zhuǎn)化效率絕大多數(shù)在0.1％-1％的范圍內(nèi)，需要昂貴的儀器。
農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移具有操作簡單、成本低、整合位點較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)化效率高、整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異較小等優(yōu)點。該方法自1983年創(chuàng)建以來，在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用。雖然單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，但后來隨著對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞原理的深入認(rèn)識，通過添加外源信號物質(zhì)如乙酰丁香酮(AS)及其衍生物等也可以實現(xiàn)農(nóng)桿菌對單子葉植物的轉(zhuǎn)化。近年來在玉米(Grimsley et al，1987，Yuji et al，1996)、水稻(Chan et al，1993，Hiei et al.1994，1997)、大麥(Tingayet al.1997，Wu et al.1998，1999)、圓蔥(Eady et al，1996)和小麥等(Cheng etal.1997；Xia et al.1999；Weir et al.2003；Wu et al.2004；Xue et al.2004)都有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功的報道。
雖然人們已經(jīng)實現(xiàn)了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥的突破，但由于小麥離體培養(yǎng)具有很強(qiáng)的惰性，再生頻率低，受基因型的影響大，而且組織培養(yǎng)過程中易發(fā)生體細(xì)胞無性系變異等原因，使得通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化法得到轉(zhuǎn)基因小麥仍然受到很大的限制。急需發(fā)展新的轉(zhuǎn)化方法。Woolston(1988)，Dale(1989)，Marks(1990)，Chen和Dale(1992)，Mahalakshmi和Khurana(1995)等雖然都采用1到4天幼苗葉基、干種子生長點做為農(nóng)桿菌的感染的外植體，在體外實現(xiàn)了農(nóng)桿菌的高效感染，但所采用的目的基因為大麥黃矮病毒完整序列，所感染的少數(shù)小麥體細(xì)胞可以合成完整的大麥黃矮病毒顆粒，進(jìn)一步再感染其它未被農(nóng)桿菌感染的小麥細(xì)胞，目的基因并不一定整合到小麥基因組，而出現(xiàn)瞬時表達(dá)現(xiàn)象，農(nóng)桿菌的真實轉(zhuǎn)化率可能被過高估計，在他們的文章中均無后代轉(zhuǎn)基因的分子生物證據(jù)似乎也能說這一問題。但可以肯定的是小麥幼苗生長點細(xì)胞在人工創(chuàng)造傷口時可被農(nóng)桿菌感染。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種改良的通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥苗端轉(zhuǎn)化方法，以獲得高頻率的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行小麥的基因工程改良。該方法可以避免誘導(dǎo)愈傷組織以及幼胚和愈傷組織培養(yǎng)中引起的不利變異，操作相對簡單，不需要進(jìn)行無菌操作，整個工作周期短，受季節(jié)的限制小，可以在較短的時間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株，可以在一定程度上克服基因型的限制。
本發(fā)明建立一種改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥苗端轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟(1)種子的消毒、萌發(fā)與春化，(2)含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸，(3)苗端轉(zhuǎn)化，(4)轉(zhuǎn)化植株的移栽土培、抗性篩選，(5)轉(zhuǎn)基因植株及子代植株的鑒定，(6)小苗生根和移栽技術(shù)。
本發(fā)明中，種子的消毒與萌發(fā)是指小麥種子置于滅菌的燒杯中，75％乙醇浸泡30s；無菌水沖洗3次，5min/次；0.1％升汞浸泡10min；無菌水沖洗5次，5min/次；將種子整齊擺放于鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，濾紙用無菌水潤濕，所用種子均為背面朝上，胚朝向同一個方向；室溫下黑暗培養(yǎng)2-3天，于4℃春化處理20-30天，當(dāng)胚芽鞘長至一定長度(2cm～4cm)后即可用于轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明中，含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸是指挑取YEP培養(yǎng)基玻璃平板上帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒，帶有目的基因和/或選擇標(biāo)記基因)或共整合載體(T-DNA區(qū)含有目的基因和/或選擇標(biāo)記基因)的根癌農(nóng)桿菌(如AGL1、EHA105)單菌落，接種于含附加抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm震蕩培養(yǎng)，經(jīng)2-3次活化，當(dāng)菌液OD600＝1.2時，4℃、5000rpm離心3min收集菌體，去上清，用適量200μM的乙酰丁香酮溶液重懸菌體至OD600＝0.6，加入0.02％的表面活性劑L77，即可用于轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明中，苗端轉(zhuǎn)化是指用潔凈刀片沿胚根向胚芽鞘伸長的方向45度角向下切斷維管束，然后刀片轉(zhuǎn)為水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或損傷生長點部位，刀片順勢延伸，在葉片距生長點1cm-2cm處切斷整個胚芽鞘，留下1cm-2cm幼葉，用于光合作用，維持植株生長，整個過程無需在無菌條件下操作。將重懸的菌液滴至切口處，每棵4μl，然后將幼苗置于潔凈培養(yǎng)皿中正常光照下恢復(fù)生長。
本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化植株的移栽土培、抗性篩選是指待幼苗恢復(fù)生長后移栽至花盆中進(jìn)行土培，進(jìn)行正常的管理。長出3-4片新葉時，噴灑適宜濃度的選擇劑或進(jìn)行其它方式的篩選。未轉(zhuǎn)化的植株由于缺乏對篩選的抵抗能力，在以后的生長中會逐漸死亡。而轉(zhuǎn)基因植株具有對篩選的抗性，在篩選后仍然能夠存活和生長。通過篩選，大部分的非轉(zhuǎn)化植株最終都會死亡，這樣留存下來的轉(zhuǎn)化植株絕大部分都是轉(zhuǎn)基因陽性植株。在適宜的生長條件下，轉(zhuǎn)基因植株就會正常的發(fā)育結(jié)實。
本發(fā)明中，轉(zhuǎn)基因植株及子代植株的鑒定是指采用合適的方法(如CTAB法)提取轉(zhuǎn)化植株葉片的DNA，利用PCR技術(shù)對目的基因進(jìn)行檢測，然后用Southern Blotting的方法對PCR陽性的植株再次進(jìn)行鑒定，最終確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。同時進(jìn)行Northern，Western及其它方式的鑒定。結(jié)果詳見附圖及實施例。
利用本發(fā)明中的一種改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥苗端轉(zhuǎn)化方法可以簡單、快速、高效地獲得轉(zhuǎn)基因植株，排除體細(xì)胞無性系變異對轉(zhuǎn)基因植株的影響，克服基因型對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的限制，是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的一種實用方法。


圖1質(zhì)粒pBLGC的T-DNA區(qū)域。
圖2轉(zhuǎn)基因植株煙2801和雜種11號T0的β-1，3葡聚糖酶基因的PCR及PCR-Southern分析(探針為隨機(jī)引物標(biāo)記的β-1，3葡聚糖酶基因擴(kuò)增片段和λDNA/HindIII+EcoR I)M分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/HindIII+EcoR I；+質(zhì)粒DNA擴(kuò)增片段(1.1kb)；9，15轉(zhuǎn)基因植株；C11非轉(zhuǎn)基因植株雜種11號。
圖3轉(zhuǎn)基因植株煙2801和雜種11T1代β-1，3葡聚糖酶基因的PCR及PCR-Southern分析(探針為隨機(jī)引物標(biāo)記的β-1，3葡聚糖酶基因擴(kuò)增片段和λDNA/HindIII+EcoRI)M分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/Hind III+EcoRI；+質(zhì)粒DNA擴(kuò)增片段(1.322kb)；2，7，9，10，11，12，13轉(zhuǎn)基因陽性植株；C11非轉(zhuǎn)基因植株雜種11號。圖4轉(zhuǎn)基因植株煙2801和T0代(A)和T1(B)β-1，3葡聚糖酶基因的Southern分析。Fig.4 Southern hybridization of the T0(A)and T1(B)transgenic Yan2801 wheat24 and 36Two individuals of T0transgenic plants.PpBLGC digested with EcoRIand SalI.34-2 and 34-3Two individuals from No.34A T0transgenic plant.MMolecular weight marker(DNA/HindIII-EcoRI)。
圖5轉(zhuǎn)基因植株煙2801 34(2)-10(A)和未轉(zhuǎn)基因的煙2801對照植株(B)對白粉病的不同敏感性。
圖6煙2801轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因的煙2801對照植株T2代的Northern雜交分析ANorthern blotting結(jié)果.B分析植株的rRNA.6，9，1034-2-6，34-2-9，34-2-10。
圖7 1-7號重組質(zhì)粒pBI-abmlo基因插入方向的鑒定MMarker，1pBI 121的BamH I酶切，2-8重組質(zhì)粒pBI-abmlo的BamHI、Sal I雙酶切。
圖8 pBI-abmlo DNA質(zhì)粒T-DNA區(qū)示意圖LB、RB為T-DNA左右邊際序列，Pnos、Tnos為nos基因的啟動子和終止子，35S為35S啟動子，mlo為大麥mlo反義基因，gus為大腸桿菌葡萄糖苷酸酶基因。
圖9轉(zhuǎn)基因植株T1代的Mlo基因的PCR及PCR-Southern分析(探針同圖3)M分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/HindIII+EcoR I；+質(zhì)粒DNA擴(kuò)增片段(1.322kb)；1，2，5，6，7，8，11，12，13IIIY2-19后代中的轉(zhuǎn)基因陽性植株。
圖10轉(zhuǎn)大麥Mlo基因植株的基因組Southern雜交分析M分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/Hind III、EcoR I；+HindIIII、EcoRI雙酶切的陽性質(zhì)粒；(a)煙優(yōu)361T0代1，19，42轉(zhuǎn)基因植株；C11非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢焹?yōu)361(b)體細(xì)胞雜種11號T0代3，5轉(zhuǎn)基因植株；Y3非轉(zhuǎn)基因?qū)φ阵w細(xì)胞雜種11號(c)煙優(yōu)2801T1代11-1，11-2IIIY2-11的兩個后代；19-7，19-8IIIY2-19的兩個后代；Y2非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢焹?yōu)2801。
圖11煙2801轉(zhuǎn)基因株系IIIY2-11的F2代(A)和未轉(zhuǎn)基因的對照(B)對白粉病的不同敏感性。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明
實例1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的β-1，3葡聚糖酶-幾丁質(zhì)酶基因苗端轉(zhuǎn)化小麥獲得抗白粉病轉(zhuǎn)基因后代1、苗端轉(zhuǎn)化將農(nóng)桿菌菌株(EHA105農(nóng)桿菌菌株，其中所含β-1，3葡聚糖酶-幾丁質(zhì)酶基因的植物雙價表達(dá)載體，圖1)接種到20mL含有50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃、170r/min振蕩培養(yǎng)至OD值1.2左右，10000r/min離心3分鐘，棄上清液。用加有100μmol/L AS的MB2(Xue et al.，2004)液體培養(yǎng)基重懸菌體，稀釋至OD值0.6左右。
小麥種子經(jīng)升汞表面消毒后室溫萌發(fā)2-3天，于4℃春化處理30天，幼苗長到2-4cm后，用潔凈刀片沿胚根向胚芽鞘伸長的方向45度角向下切斷維管束，然后刀片轉(zhuǎn)為水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或損傷生長點部位，刀片順勢延伸，在葉片距生長點1cm-2cm處切斷整個胚芽鞘，留下1cm-2cm幼葉，用于光合作用，維持植株生長；用tip從切口處滴加帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌液，在弱光潮濕條件下20℃左右恢復(fù)生長5-6天，新葉片長出后移栽正常管理。
2、轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株及對照小麥的基因組總DNA，β-1，3葡聚糖酶基因的PCR檢測引物為P1 GCGGATCCGACCATGGCTGCTATCACACTC，P2CGGTCGACCTCACATCTCACTTACGAGA，擴(kuò)增片段長度為1.1kb。20μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包含1U Taq酶，兩種引物各250ng，250μM的dNTP。程序為94℃預(yù)變性3min，94℃1min，60℃ 2min，72℃ 2min循環(huán)35次，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色并照相。
3、轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Shouthern及總基因組Southern雜交取陽性植株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠80V穩(wěn)壓電泳1-2h后，按分子克隆中的方法(molecular cloning)將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，以Pharmacia公司的Random primelabeling and detection system kit實驗程序，進(jìn)行β-1，3葡聚糖酶基因的特異擴(kuò)增片段的標(biāo)記、雜交、洗滌、封閉、結(jié)合抗體、曝光顯影。
總基因組Southern雜交取陽性質(zhì)粒DNA 0.1μg，轉(zhuǎn)基因及陰性對照小麥的基因組DNA 30μg，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I+EcoRI酶切后，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，于4℃ 15V穩(wěn)壓電泳16-18h，按以上方法進(jìn)行探針標(biāo)記和雜交。
4、轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性選取轉(zhuǎn)基因植株的后代種子在溫室及田間種植，用未轉(zhuǎn)基因的植株間隔做對照。對以上植株作白粉病接種，并在苗圃的中央用高感白粉病的品種Huixianhong做白粉病的誘發(fā)區(qū)，按病斑的多少計反應(yīng)型?？垢袠?biāo)準(zhǔn)分為4級，0級為免疫；1級為高抗，基部葉有1-3處病斑；2級為中抗，中部葉有少量病斑；3、4級為中、高感，上部葉及穗部有較多及大量的病斑。
5、抗白粉病轉(zhuǎn)基因植株的Northern雜交分別取34(2)-1的10個單株，在幼苗期按Xue et al.(2004)的方法分離其總RNA，按1.3.2的方法進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離，Northern blot印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與P32隨機(jī)標(biāo)記的葡聚糖基因雜交，洗滌、顯影、曝光。
結(jié)果利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苗端轉(zhuǎn)化，分別對三種基因型的小麥(煙2801、煙361和體細(xì)胞雜種11號)，進(jìn)行幾丁質(zhì)酶-β-1，3葡聚糖酶雙價基因的轉(zhuǎn)化。待轉(zhuǎn)化的種子首先進(jìn)行低溫春化處理，當(dāng)胚芽鞘長2～4cm時切去胚芽鞘及一半的子葉進(jìn)行農(nóng)桿菌對生長點的轉(zhuǎn)化處理(圖2)。通過PCR和Southern blot檢測驗證(圖3)共獲得27株T0代陽性植株，其平均轉(zhuǎn)化率為9.82％。T1代部分陽性植株的檢測結(jié)果發(fā)生明顯的分離(圖4)。對T2代白粉病抗性的調(diào)查結(jié)果表明，部分陽性轉(zhuǎn)基因植株比對照的抗性提高2-3級(圖6)。Northern雜交證明(圖5)，抗性植株的β-1，3葡聚糖酶基因可正常轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果表明，目的基因己整合到小麥基因組中并可在其后代遺傳和表達(dá)。
實例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥Mlo反義基因轉(zhuǎn)化小麥獲得抗白粉病后代1、大麥Mlo基因的分離1.1、幼苗RNA的提取取常溫光照培養(yǎng)七日大麥幼苗材料20g，采用Pietro et al(2002)報道的一步法提取總RNA。
1.2、RT-PCR取2ug大麥總RNA，用大連寶生物公司的RNA PCR Kit(AMV)Ver2.1試劑盒，按廠商要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，PCR引物根據(jù)報道的MLO基因序列設(shè)計(Buschgas et al.1997)。引物IGTGCATCTGCGTGTGCGTA；引物IICAGAAACTTGTCTCATCCCTG1.3、PCR產(chǎn)物的克隆pBSKS(一)質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRV酶切后，參考Woolston，C.J et al(1988)報道的方法制備T-載體。mlo-PCR產(chǎn)物與T-載體16℃連接(2.8∶1)，轉(zhuǎn)化DH5a，籃白斑篩選重組子，利用EcoR I和Hind III酶切確定是否為重組子。
1.4、重組子的測序及插入片段方向的簽定.
重組子克隆中的mlo片段由大連寶生物公司進(jìn)行雙向測序，根據(jù)其序列與已發(fā)表的序列(Buschgas et al.1997)對比，經(jīng)Pst I和Sal I酶切確定其插入方向(圖7)。
2、大麥mlo反義表達(dá)載體的構(gòu)建2.1、mlo基因片段的分離及末端補(bǔ)平pBS-mlo質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切，電泳分離切取1.7kb的mlo片段，用MBI公司的DNA凝膠回收試劑盒，按廠方說明回收DNA，利用寶生物公司DNA平末端連接試劑盒，按廠商說明補(bǔ)平其DNA末端。
2.2、pBI121.2質(zhì)粒載體的制備pBI121.2質(zhì)粒DNA經(jīng)Sma I完全酶切后，用CIAP脫磷，回收DNA。.
2.3、連接及重組子篩選.
mlo基因片段與pBI121.2載體DNA以1∶1摩爾比在16℃連接12小時，轉(zhuǎn)化新制備的感受態(tài)DH10B，涂Kan平板篩選轉(zhuǎn)化子。將平板上的菌落依次用牙簽點到兩個Kan平板上，生長過夜后，將其中一個進(jìn)行菌落原位雜交，轉(zhuǎn)尼龍膜，另一個4℃保存，利用ECl試劑盒標(biāo)記mlo基因片段，與轉(zhuǎn)移好并經(jīng)變性，洗滌固定后的尼龍膜雜交，常規(guī)曝光，沖洗x光片。方法參見Amersham-Phamarcia，(UK)的使用手冊。
選取7個強(qiáng)陽性克隆，提取其質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI和SalI雙酶切簽定，然后轉(zhuǎn)進(jìn)農(nóng)桿菌。
3、小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化3.1、苗端轉(zhuǎn)化法將以上農(nóng)桿菌菌株接種到20mL含有50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃、170r/min振蕩培養(yǎng)12-24h，10000r/min離心3分鐘，棄上清液。用加有100μmol/L AS的MB2(Xue et al.，2004)液體培養(yǎng)基重懸菌體，稀釋至OD值1.0左右。
小麥種子體細(xì)胞雜種11號，煙優(yōu)2801和煙優(yōu)361經(jīng)升汞表面消毒后室溫萌發(fā)2-3天，于4℃春化處理30天，幼苗長到2-5cm后用潔凈刀片沿胚根向胚芽鞘伸長的方向45度角向下切斷維管束，然后刀片轉(zhuǎn)為水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或損傷生長點部位，刀片順勢延伸，在葉片距生長點1cm-2cm處切斷整個胚芽鞘，留下1cm-2cm幼葉，用于光合作用，維持植株生長，切去胚的上半部分及一半的子葉，露出并且損傷生長點，用tip從切口處滴加帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌液，在弱光潮濕條件下20℃左右恢復(fù)生長5-6天，新葉片長出后移栽正常管理。
3.2、轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析檢測大麥Mlo基因的PCR引物為上游引物5‘TATCCCTGCTCCTCATCGT3’；下游引物5‘CGGACCTCCTCCTGTCGTTA3’，擴(kuò)增片段長度為1.32kb.。PCR擴(kuò)增體系為20μl，反應(yīng)體系包含1uTaq酶，兩種引物各250ng，250μM的dNTP。具體反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，94℃ 1min，56.7℃ 2min，72℃ 2min循環(huán)35次，72℃延伸7min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色并照相。
3.3、轉(zhuǎn)基因植株的基因組Southern雜交陽性質(zhì)粒DNA 0.1μg，轉(zhuǎn)基因及陰性對照小麥的基因組DNA 30μg，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII+EcoRI雙酶切后，4℃經(jīng)0.8％的瓊脂糖凝膠分離，15V穩(wěn)壓電泳16-18h，進(jìn)行Southern blot，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以Pharmacia公司的Random prime labelingand detection system kit實驗程序，進(jìn)行大麥Mlo基因的特異擴(kuò)增片段的標(biāo)記、雜交、洗滌、封閉、結(jié)合抗體、曝光顯影。
3.4、轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析選取轉(zhuǎn)基因植株的后代種子在溫室及田間種植，用未轉(zhuǎn)基因的植株間隔做對照。對以上植株作白粉病接種，并在苗圃的中央用高感白粉病的品種輝縣紅做白粉病的誘發(fā)區(qū)，按病斑的多少計反應(yīng)型?？垢袠?biāo)準(zhǔn)分為4級，0級為免疫；1級為高抗，基部葉有1-3處病斑；2級為中抗，中部葉有少量病斑；3、4級為中、高感，部葉及穗部有較多及大量的病斑，按植株發(fā)病情況統(tǒng)計反應(yīng)級數(shù)。
表1T0代轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性分析體細(xì)胞雜種11號 煙優(yōu)2801 煙優(yōu)361對照植株 陽性轉(zhuǎn)基對照植株 陽性轉(zhuǎn)基 對照植株陽性轉(zhuǎn)基因植株因植株 因植株反應(yīng)級數(shù) 4.10 3.512.761.20 2.50 1.73結(jié)果 利用RT-PCR技術(shù)從大麥斯特林幼葉總RNA中分離到MLO基因cDNA完整編碼區(qū)，反向連接到植物雙元載體(pBI 121.2)35S啟動子下游(圖8)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苗端轉(zhuǎn)化法獲得三種基因型(煙優(yōu)2801和煙優(yōu)361、小麥與高冰草體細(xì)胞雜種11號)的轉(zhuǎn)基因小麥。通過對T0、T1代植株大麥Mlo基因的PCR(見圖3)，PCR-Southern blot(見圖9)，Southern blot檢測(見圖10)，525個T0植株中有72株P(guān)CR、PCR-Southern blot陽性，轉(zhuǎn)化率達(dá)到13.71％，Southern blot雜交可以證明大麥MLO基因片段已整合到小麥基因組中(見圖10)。對部分T1代陽性植株的檢測表明目的基因可單考貝整合到小麥基因組中(見圖10)。三種基因型的小麥都獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并已經(jīng)遺傳至T2代。溫室及大田的白粉病抗性調(diào)查結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株比其對照具有更強(qiáng)的抗性(見表1，圖11)。
權(quán)利要求
1.一種改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥苗端轉(zhuǎn)化方法，包含種子的消毒、萌發(fā)與春化；含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸；苗端轉(zhuǎn)化；幼苗的恢復(fù)生長以及移至土中栽培獲得該轉(zhuǎn)基因植株的子代；鑒定轉(zhuǎn)基因植株及分析子代的遺傳特性；其特征在于1)、種子的消毒、萌發(fā)及低溫處理；2)、幼苗長到適宜階段后經(jīng)切割，暴露或損傷生長點部位；3)、將含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液滴至幼苗切口處；上述消毒的種子萌發(fā)后進(jìn)行低溫處理，是指小麥種子在黑暗下培養(yǎng)2-3天、4℃春化20-30天。幼苗長到適宜階段后經(jīng)切割，暴露或損傷生長點部位是指對2cm～4cm長的幼苗用潔凈刀片沿胚根向胚芽鞘伸長方向45度角向下切斷維管束，然后刀片轉(zhuǎn)為水平方向切去胚芽及胚的上半部分，暴露或損傷生長點部位，刀片順勢延伸，在葉片距生長點部位1cm-2cm處切斷整個胚芽鞘，留下幼葉基部，用于光合作用，維持植株生長，整個過程無需在無菌條件下操作；含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸是指挑取YEP培養(yǎng)基玻璃平板上帶有雙元載體即Mini-Ti質(zhì)?！獛в心康幕蚝?或選擇標(biāo)記基因或共整合載體即T-DNA區(qū)含有目的基因和/或選擇標(biāo)記基因的根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于含附加抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm震蕩培養(yǎng)，經(jīng)2-3次活化，當(dāng)菌液OD600＝1.2時，4℃、5000rpm離心3min收集菌體，去上清，用100～200μM的乙酰丁香酮溶液(acetosyringone，AS)重懸菌體至OD600＝0.6，加入質(zhì)量百分比為0.02％的表面活性劑L77，即可用于轉(zhuǎn)化；將重懸的菌液滴至幼苗切口處，每株4μl，然后將幼苗置于潔凈培養(yǎng)皿中正常光照下恢復(fù)生長。
2.如權(quán)利要求1所述的一種改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的小麥材料為經(jīng)4℃處理25天；所述的切割是指切去胚芽及胚的上半部分，留下1cm-2cm幼葉；所述的露出或損傷生長點部位是指在解剖鏡下能夠清晰地觀察到被部分葉原基包圍的生長錐或裸露及損傷的生長錐；所述根癌農(nóng)桿菌是帶有目的基因的AGL1和EHA105菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開一種改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥苗端轉(zhuǎn)化方法，主要步驟包括1)種子萌發(fā)后在4℃春化20－30天；2)含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸；3)對適宜大小的幼苗進(jìn)行切割，暴露或損傷生長點部位；4)將含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液滴至幼苗切口處；5)幼苗恢復(fù)生長以及移至土中栽培和抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株及子代；6)轉(zhuǎn)基因植株及子代的鑒定。本發(fā)明中的方法無需無菌操作，可以簡單、快速、高效地獲得轉(zhuǎn)基因植株，排除體細(xì)胞無性系變異對轉(zhuǎn)基因植株的影響，克服基因型對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的限制，對于小麥基因功能的驗證及基因工程育種具有重要的作用及廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H1/00GK1633839SQ20041007577
公開日2005年7月6日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者夏光敏, 陳惠民, 趙雙宜, 趙慶臻, 劉恒, 趙同金 申請人:山東大學(xué)