專利名稱：簡便高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米轉(zhuǎn)基因的方法。
背景技術(shù)：
應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)牒线m受體獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株是轉(zhuǎn)基因的重要環(huán)節(jié)。在玉米轉(zhuǎn)基因研究上，已開拓建立了多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，包括基因槍法、PEG法、電擊法、超聲波介導(dǎo)法、花粉管通道法等，分別適應(yīng)于不同的受體，并取得了一定成效，但這些技術(shù)在組織培養(yǎng)、受體選擇、轉(zhuǎn)化效率等不同方面存在各種不同的缺陷，為實(shí)驗(yàn)操作帶來了諸多不便。
眾所周知，組織培養(yǎng)工作量較大，需要大量的專業(yè)人員從事繁重的工作。傳統(tǒng)農(nóng)桿菌方法就是建立在組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上的，并且在組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞脫分化和再分化中產(chǎn)生的體細(xì)胞變異以及轉(zhuǎn)基因株的育性降低或喪失，會干擾轉(zhuǎn)基因植株的分析及利用?；驑尫m然具備受體類型廣泛、基因槍轉(zhuǎn)化無宿主限制等優(yōu)點(diǎn)，但不可避免要經(jīng)過組織培養(yǎng)過程。同時，玉米的組織培養(yǎng)、愈傷分化較水稻、小麥等植物困難，玉米組織培養(yǎng)受基因型的限制較大，受體范圍較小，所以，以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、超聲波及電擊法在玉米上的應(yīng)用受到了很大限制，而花粉管通道法雖然可避免組織培養(yǎng)過程而直接獲得轉(zhuǎn)化種子，但轉(zhuǎn)化效率低，因此，建立和開拓一種新的不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)的簡便高效的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題提供一種簡便高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)基因方法。
本發(fā)明方法的特點(diǎn)是利用含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液感染玉米雌幼穗花絲進(jìn)行玉米原位轉(zhuǎn)化，先損傷花絲和雌幼穗，并用含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液涂抹或滴注以感染損傷部位，然后進(jìn)行授粉，感染，反復(fù)處理3-4次，通過對當(dāng)代種子的抗性篩選和分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明方法在技術(shù)上的優(yōu)點(diǎn)如下1、本發(fā)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)在玉米上實(shí)現(xiàn)原位轉(zhuǎn)化，將農(nóng)桿菌感染花絲和雌幼穗，通過授精，直接實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，這樣就有效地避免了組織培養(yǎng)和植株再生的繁雜過程，又可借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因進(jìn)入配子細(xì)胞或合子胚細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)外源基因在受體細(xì)胞基因組的整合，從而簡便快捷地實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，且轉(zhuǎn)化的后代可直接成株。
2、在受體選擇上，本發(fā)明適合各種玉米品種，操作過程中不存在基因型差異，可以方便廣大科研工作者從事玉米轉(zhuǎn)基因研究，同時，本發(fā)明僅需要常規(guī)儀器和常規(guī)試劑即可完成，操作簡便。
3、在轉(zhuǎn)化效率上，玉米為穗狀花序，雌穗花絲易于受粉，一次授粉即可實(shí)現(xiàn)整穗受粉，不象自花授粉的水稻、小麥農(nóng)桿菌感染那樣，需每朵小花分別操作，工作量大，玉米每個果穗結(jié)實(shí)通常可以達(dá)200粒以上種子，通過原位轉(zhuǎn)化可以獲得大量的種子，即使轉(zhuǎn)化效率稍低，但通過對當(dāng)代種子的抗性篩選和分子檢測，即可獲得有效的轉(zhuǎn)基因植株。因此，本發(fā)明方法在玉米上更具有獨(dú)特的應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例方法的工藝流程如下外源基因→Ti質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建→農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液制備→原位轉(zhuǎn)化→轉(zhuǎn)化體的篩選→轉(zhuǎn)化體的鑒定→轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施步驟如下1、目的基因的確定和載體構(gòu)建。
選定相關(guān)的目的基因，利用pCAMBIA1300或者pBI121等Ti質(zhì)粒構(gòu)建玉米表達(dá)載體。
2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的制備。
通過三親雜交的方法或者直接轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株。
(1)三親雜交方法，各取培養(yǎng)好的三種菌液根癌農(nóng)桿菌LBA4404、大腸桿菌HB101(pRK2013)、大腸桿菌DH5α(構(gòu)建的載體表達(dá)質(zhì)粒)各500ul混合入1.5mldorf管中，室溫5000rpm離心10min，收集菌體，用LB培養(yǎng)基洗滌2次，再離心，收集菌體，重新懸于100ulLB中。轉(zhuǎn)移到放有纖維素酯的微孔濾膜(孔徑為0.45um)的LB平板上，28℃培養(yǎng)過夜。取一接種環(huán)混合培養(yǎng)物，懸浮于100ulLB中，稀釋100倍，取各稀釋液100ul涂布于含有Rifr、Strr、Kmr的LB平板上，28℃培養(yǎng)2天。與此同時，把三種菌液分別涂布在含3種抗性的平板上，作為對照。
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液的制備，挑選一個經(jīng)三親交配的土壤根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于含鏈霉素(Str)25ug/ml，利福平(Rif)50ug/ml和卡那霉素(Kan)50ug/ml的5mlLB液體培養(yǎng)基中，28℃下200r/min振蕩培養(yǎng)28h，至細(xì)菌處于對數(shù)生長時期(OD600＝0.8～1.0)，室溫5000rpm離心10min。棄上清，沉淀的菌體用含150umol/L AS的MR液體培養(yǎng)基中，該液體培養(yǎng)基含1/5MS大量元素+MS其它成分+2，4-D1mg/L+10mmol/L果糖+10mmol/L葡萄糖+30g/L蔗糖，pH5.3，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2h，以誘導(dǎo)細(xì)菌vir基因表達(dá)，此菌液即為轉(zhuǎn)化工程菌液。
3、農(nóng)桿菌原位轉(zhuǎn)化 當(dāng)玉米花絲長到2厘米時，下午5點(diǎn)到7點(diǎn)之間用剪刀把花絲貼近包葉剪平，用利器穿透苞葉，刺傷幼穗，然后用消毒過的棉花蘸2ml制備好的菌液均勻涂抹花絲，同時外面套上隔離袋，防止混雜，然后次日上午9點(diǎn)至11點(diǎn)之間進(jìn)行授粉，下午5點(diǎn)至7點(diǎn)再進(jìn)行一次重復(fù)涂抹菌液，次日再進(jìn)行授粉一到兩次。反復(fù)處理3-4次。
3、轉(zhuǎn)化體篩選 收獲成熟種子，通過潮霉素或除草劑抗性選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選，例如我們采用了潮霉素選擇標(biāo)記，首先對未轉(zhuǎn)化玉米植株進(jìn)行抗性實(shí)驗(yàn)，確定玉米耐受潮霉素的臨界濃度，我們篩選得到玉米整粒種子潮霉素抗性篩選濃度為55mg/L。我們利用無菌水進(jìn)行轉(zhuǎn)化種子浸種6小時，置于含55mg/L潮霉素MS培養(yǎng)基上發(fā)芽和抗性篩選，經(jīng)篩選，15000粒原位轉(zhuǎn)化，當(dāng)代(T1代)種子的抗潮霉素頻率為8.6‰。
5、轉(zhuǎn)化體的鑒定 利用潮霉素基因設(shè)計PCR引物，對抗性株的葉片進(jìn)行PCR檢測，以明確外源潮霉素基因是否存在于抗性株的細(xì)胞內(nèi)。同時可以利用Southern雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的鑒定，從而篩選出玉米轉(zhuǎn)基因株。本研究結(jié)果顯示原位T1代轉(zhuǎn)化株P(guān)CR陽性率達(dá)3.6‰。證明該方法是一種簡便高效的玉米轉(zhuǎn)基因方法。
權(quán)利要求
1.簡便高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)基因方法，其特征是利用含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液感染玉米雌幼穗花絲進(jìn)行玉米原位轉(zhuǎn)化，所述玉米原位轉(zhuǎn)化是先損傷花絲和雌幼穗，并用含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液涂抹或滴注以感染損傷部位，然后進(jìn)行授粉，感染，反復(fù)處理3-4次，通過對當(dāng)代種子的抗性篩選和分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述玉米原位轉(zhuǎn)化是當(dāng)玉米花絲長到2厘米時，下午5點(diǎn)到7點(diǎn)之間用剪刀把花絲貼近包葉剪平，用利器穿透苞葉，刺傷幼穗，然后用消毒過的棉花蘸2ml制備好的菌液均勻涂抹花絲，同時外面套上隔離袋，防止混雜，然后次日上午9點(diǎn)至11點(diǎn)之間進(jìn)行授粉，下午5點(diǎn)至7點(diǎn)再進(jìn)行一次重復(fù)涂抹菌液，次日再進(jìn)行授粉一到兩次，反復(fù)處理3-4次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述抗性篩選是對所收獲的成熟種子，通過潮霉素或除草劑抗性選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述轉(zhuǎn)化體的鑒定是利用潮霉素基因設(shè)計PCR引物，對抗性株的葉片進(jìn)行PCR檢測，以明確外源潮霉素基因是否存在于抗性株的細(xì)胞內(nèi)；同時利用Southern雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的鑒定，篩選出玉米轉(zhuǎn)基因株。
全文摘要
簡便高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)基因方法，其特征是利用含有外源基因的農(nóng)桿菌菌液感染玉米雌幼穗花絲進(jìn)行玉米原位轉(zhuǎn)化，所述玉米原位轉(zhuǎn)化是先損傷花絲和雌幼穗，并用含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液涂抹或滴注以感染損傷部位，然后進(jìn)行授粉，感染，反復(fù)處理3－4次，通過對當(dāng)代種子的抗性篩選和分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明方法避免了組織培養(yǎng)和植株再生的繁雜過程，簡便快捷，轉(zhuǎn)化的后代可直接成株。
文檔編號A01H1/00GK1602672SQ20041006561
公開日2005年4月6日 申請日期2004年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日
發(fā)明者程備久, 朱蘇文, 項艷, 張永風(fēng), 王洲, 談應(yīng)權(quán), 馬慶, 韓國民, 葉輝, 程郢 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)