專利名稱：鹽生杜氏藻(6－4)光裂合酶及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)耐鹽相關(guān)蛋白-(6-4)光裂合酶的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的耐鹽相關(guān)蛋白。
背景技術(shù)：
目前，世界人口不斷增加，而可耕種土地卻不斷減少。然而，地球上還有許多因鹽堿化而無法有效利用的土地資源。為了有效地利用這些鹽堿化的土地資源，人們一直在尋找既適應(yīng)生長而具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物品種。然而，迄今為止沒有十分合適的植物品種。
另一種開發(fā)耐鹽堿植物的方法是對已有的植物品種，尤其是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物品種進(jìn)行改良。然而，傳統(tǒng)的植物改良方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、并且缺乏針對性。
為了有效地、針對性地改善植物品種的耐鹽性，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)與耐鹽性有關(guān)的基因和蛋白。
此外，隨著世界工業(yè)的迅猛發(fā)展，大量溫室氣體的釋放導(dǎo)致全球變暖，特別是氯氟烴(氟利昂，chlorofluorocarbons，CFCs)等化學(xué)物質(zhì)的大量使用，大氣平流層臭氧濃度日益下降，地面太陽輻射(特別是UV-B，280-320nm)的增強(qiáng)。近地表太陽UV-B輻射強(qiáng)度的增加對生活在地球生物圈中的各種生物以及它們的生存環(huán)境的質(zhì)量都將產(chǎn)生深刻的影響。UV-B輻射對人類、動物的直接影響主要體現(xiàn)在眼和皮膚這些易受太陽照射的部位。而對植物則主要是光合作用系統(tǒng)的傷害，因此太陽UV-B輻射對植物的危害大于對人體健康的影響。為了有效和針對性地提高生物體的抗紫外線特性，迫切需要開發(fā)抗紫外線相關(guān)的基因與蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的鹽生杜氏藻耐鹽相關(guān)蛋白(6-4)光裂合酶以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物耐鹽性方面的用途。
鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)屬綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、多毛藻科、杜氏藻屬，主要生長于高鹽度水體中。細(xì)胞形態(tài)通常為卵圓形，當(dāng)外界滲透壓發(fā)生變化時(shí)，其形態(tài)可變?yōu)榍蛐沃良忓N形。它具有兩條等長的鞭毛和一個杯狀葉綠體，在葉綠體的外緣可積累大量的β-胡蘿卜素小滴，是細(xì)胞呈橙紅色。細(xì)胞無細(xì)胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。鹽生杜氏藻與衣藻(Chlamydomonas)具有較近的親緣關(guān)系。本發(fā)明人通過多年對鹽生杜氏藻的研究，發(fā)現(xiàn)了鹽生杜氏藻中與耐鹽性有關(guān)的蛋白-(6-4)光裂合酶，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的(6-4)光裂合酶(或簡稱為“光裂合酶”)，該酶源自鹽生杜氏藻的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(6-4)光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該酶是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％相同性(a)編碼上述鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1800位的序列；(b)具有SEQ IDNO1中1-1803位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1803個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的化合物，以及抑制鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在(6-4)光裂合酶的方法，它包括將樣品與(6-4)光裂合酶的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在(6-4)光裂合酶。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的激動劑，或者篩選抑制鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第九方面，提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法可改善植物耐鹽性和/或抗紫外性，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有(6-4)光裂合酶DNA編碼序列，所述的(6-4)光裂合酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(6-4)光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。
(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使(6-4)光裂合酶DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入(6-4)光裂合酶DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1是GST-(6-4)光裂合酶融合蛋白的表達(dá)電泳圖。其中泳道M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1是JM109同條件IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)；泳道2為pGEX-4T-1的轉(zhuǎn)化菌同條件誘導(dǎo)4小時(shí)；泳道3為pGEX-4T-1/6-4轉(zhuǎn)化菌無誘導(dǎo)；泳道4為pGEX-4T-1/6-4轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)2小時(shí)；泳道5為pGEX-4T-1/6-4轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)4小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，術(shù)語“(6-4)光裂合酶[(6-4)Photolyase-Like Protein]”、“(6-4)光裂合酶多肽”或“耐鹽相關(guān)蛋白(6-4)光裂合酶”可互換使用，都指具有鹽生杜氏藻耐鹽相關(guān)蛋白(6-4)光裂合酶氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐鹽相關(guān)蛋白(6-4)光裂合酶。
在本發(fā)明中，“光裂合酶”指“(6-4)光裂合酶”，除非特別指出。
(6-4)光裂合酶催化的反應(yīng)如下
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的(6-4)光裂合酶或多肽”是指(6-4)光裂合酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化(6-4)光裂合酶?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶”指具有鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的可溶性片段。通常，該片段具有鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶保守性變異多肽”指與SEQ IDNO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼(6-4)光裂合酶的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或(6-4)光裂合酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的(6-4)光裂合酶。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得耐鹽性提高的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進(jìn)或?qū)?6-4)光裂合酶功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶篩選多肽庫可用于尋找有價(jià)值的能抑制或刺激鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的分子，也包括那些并不影響鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶的抗體可用于檢測樣品中的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶。例如通過定量檢測鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶，并利用(6-4)光裂合酶與鹽濃度的相關(guān)性，可以確定鹽生杜氏藻生產(chǎn)環(huán)境中鹽濃度。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶水平的測試方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶水平，可用于解釋鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶在耐鹽性方面重要性。
一種檢測檢測樣品中是否存在(6-4)光裂合酶的方法是利用(6-4)光裂合酶的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與(6-4)光裂合酶特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在(6-4)光裂合酶。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用(6-4)光裂合酶特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(6-4)光裂合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從鹽生杜氏藻cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1803個堿基，其開放讀框位于1-1800位，編碼全長為600個氨基酸的鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶(SEQ ID NO2)。(6-4)光裂合酶為改善植物的耐鹽性和耐紫外性提供了新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的克隆1.鹽生杜氏藻的采集(Collection)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)購自武漢水生生物研究所藻種庫。
2.Poly A+RNA的分離(Poly A+RNA isolation)用Trizol試劑(Gibco，NY，USA)提取鹽生杜氏藻的總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的試劑盒操作說明書抽取鹽生杜氏藻的mRNA。
3.鹽生杜氏藻cDNA文庫的構(gòu)建(Cloning of Full-length cDNA)使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的試劑盒說明書，以λTriplEX2為載體，構(gòu)建鹽生杜氏藻的cDNA噬菌體文庫。
4.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)通過對大量不同物種(包括如擬南芥、果蠅、非洲爪蟾等)的(6-4)光裂合酶進(jìn)行比較，確定了部分氨基酸保守序列。據(jù)此設(shè)計(jì)引物，采用RACE方法(Gibco試劑盒，NY，USA)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行(1)使用引物，以Poly A+RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增以寡核苷酸5′ATGGCAAGGGAGGCAGGAGTGGA 3′(SEQ ID NO3)為正向引物；寡核苷酸5′GAGGGACATCGGTGGCTGTGAAT 3′(SEQ ID NO4)為反向引物，以Poly A+RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃5分鐘，隨后94℃30秒、55℃30秒、72℃ 1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得的片段長度約為0.5kb，回收片段連接到購買的T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序，測得一個506bp序列。
將該序列及其編碼蛋白質(zhì)序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥的(6-4)光裂合酶基因有較高的同源性，證實(shí)了引物的正確。
(2).RACE根據(jù)以上序列分析設(shè)計(jì)5’RACE引物5’GGTGCCTCTTTGAAGCCCATCTCCT 3’(SEQ ID NO5)；3’RACE引物5’ATTCACAGCCACCGATGTCCCTC 3’(SEQ ID NO6)；使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照操作手冊進(jìn)行，得到鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的5’和3’端序列。
(3).PCR擴(kuò)增得到(6-4)光裂合酶基因編碼區(qū)(過程同(1))。
在拼接得到全長(包括完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物以寡核苷酸CGCGGATCCATGCTGAGGTGCGCA(SEQ ID NO7)為正向引物；寡核苷酸CCGCTCGAGTTACTGGCACCTTTTCTT(SEQ ID NO8)為反向引物，以用常規(guī)方法抽提的鹽生杜氏藻總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序。結(jié)果驗(yàn)證了鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的全長編碼序列的正確性。
鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因全長序列如SEQ ID NO1所示，其中讀框位置是1-1800位。
atgctgaggt gcgcacaacc taagtatgca cctttgaagc gccaggcctt caaccagaaa60ttgaataggc ttgtggcagc agcccgcacc cctagcaaat catcttcaac atcaaggatg120gcctcaacat caagtggaca gcaaggccgc tctatcttgt ggtttagaaa gggcctgcgg180ctccacgaca accctgctct cagagatgcc tgcacagggt ctgctgctgt gttccctatc240ttcatcattg atccgtactt ccttcaaaaa tccaataaca aggttggtgt aaaccgctat300cagttccttt tggagagctt gagcgacctg aattcgagcc tgactagtct tggctcccaa360ctcctggttt tgagaggtac cccagaggag gtgataccaa gagttctgcg cgactggagc420atcaagaagc tctgctatga gattgacacg gagccatacg ctaaggcccg agatgctcgt480gtagatgaca tggcaaggga ggcaggagtg gaggtcaaaa agcactggag ccacacacta540tatgatacag acatgctagt gcgagaaaac aaagggaagg caccactgac catgcaggcg600tttgagaagt tggtagaccg tgttggccac cccctcaccg ctctgcctgc ccccacggct660cgccttcctc cggttgatgt cagcctgcca ggcatcaagg acgcagaagt gggagtcccc720acgtggcagg agatgggctt caaagaggca cccacagcta tcttcaaggg cggagagacg780gaggccctga agaggctgga acattacatg aaagacacaa agtgggyggc ctcgtttgag840aagccttcca ccgacccctc agccttcaca gagccctcca ccactgcgct gtccccatac900ctcaagtttg gatgcctgtc tgcacgcttc tttcaccaaa ggctgctgga tgtgtaccgc960cttcacccca agcattcaca gccaccgatg tccctccgag ggcagctgct gtggcgagag1020ttcttctata cattgggctc acacacccca aactttgacc gcatagcagg caaccccatc1080tgccgacaga ttacttggga cacaaaccca gccctgctca aggcttggcg agatggggcc1140actggttatc catggattga tgctgcgatg acccaactga gggaatgggg ctggatgcac1200cacctggcac gccactctgt ggcttgcttc ctcaccaggg gggacctgta cctgagctgg1260
gagtctggca aggaggtgtt cgaggagttg ctcctggatg cagactattt cattaatgca1320gcaaactgga tgtggctgag tgccagcgcg ttctttgcac aatactttag agtgtacagc1380cctgttgtgt ttggcaagaa gtatgacaag gagggcgcct acatccggaa gttcttgcca1440gtgctgaagg acatgcccgc aaagtacatc tatgagccat ggactgcgcc gaaagaagtc1500cagcagcgcg ccaactgtat cataggccgg gactaccctg ctcccattgt ggaccatgca1560gttgcaagca aagaatgcat agccagaatg ggagctgcgt acaaagccac aaacaccggg1620ggcagtgcag gcaaagcctc ccctgcaaaa gcggcctctt ctggtgacgc cggcacttct1680gcatcagcag gagcgccatc ttcgtccaag aagaccacag gcaagcgggc agcatctgca1740gaccaaggtg gcaagcgtca aaagactctg gaggagtcga tgacgaagaa aaggtgccag1800taa 1803(SEQ ID NO1)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因編碼一個由600個氨基酸構(gòu)成(6-4)光裂合酶，其序列如SEQ ID NO2所示。
MLRCAQPKYA PLKSQAFNQK LNRLVAAART PSKSSSTSRM ASTSSGQQGR SILWFRKGLR60LHDNPALRDA CTGSAAVFPI FIIDPYFLQK SNNKVGVNRY QFLLESLSDL NSSLTSLGSQ120LLVLRGTPEE VIPRVLRDWS IKKLCYEIDT EPYAKARDAR VDDMAREAGV EVKKHWSHTL180YDTDMLVREN KGKAPLTMQA FEKLVDRVGH PLTALPAPTA RLPPVDVSLP GIKDAEVGVP240TWQEMGFKEA PTAIFKGGET EALKRLEHYM KDTKWVASFE KPSTDPSAFT EPSTTALSPY300LKFGCLSARF FHQRLLDVYR LHPKHSQPPM SLRGQLLWRE FFYTLGSHTP NFDRIAGNPI360CRQITWDTNP ALLKAWRDGA TGYPWIDAAM TQLREWGWMH RLARHSVACF LTRGDLYLSW420ESGKEVFEEL LLDADYFINA ANWMWLSASA FFAQYFRVYS PVVFGKKYDK EGAYIRKFLP480VLKDMPAKYI YEPWTAPKEV QQRANCIIGR DYPAPIVDHA VASKECIARM GAAYKATNTG540GSAGKASPAK AASSGDAGTS ASAGAPSSSK KTTGKRAASA DQGGKRQKTL EESMTKKRCQ600實(shí)施例2鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因全長序列及其編碼蛋白用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank cdstranslations+PDB+SwissProt+PIR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在核酸數(shù)據(jù)庫中沒有明顯的相似序列。只是在1243bp到1332bp這90個核苷酸序列總能擊中光裂合酶/藍(lán)光受體家族的成員。在氨基酸水平上，它與擬南芥(Arabidopsis thaliana)的(6-4)光裂合酶mRNA全編碼序列(GenBankAccession No.X66412)有52％的相同性，它與非洲爪蟾(Xenopus laevis)的(6-4)光裂合酶蛋白(GenBank Accession No.BAA97126)有53％的相同性。
將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶蛋白的氨基酸在blocks數(shù)據(jù)庫(http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列中存在(6-4)光裂合酶蛋白的所有模塊，對應(yīng)模塊號為IPB002081A、IPB002081B、IPBO02081C、IPBO02081D、IPBO02081E、IPBO02081F，分布如下
IPB006050A 54-64IPB006050B 145-158IPB006050C 282-309IPB006050D 386-434IPB006050E 457-481在該氨基酸序列中存在(6-4)光裂合酶蛋白功能模塊，因此可預(yù)見其具有(6-4)光裂合酶蛋白的相應(yīng)功能。
實(shí)施例3鹽生杜氏藻cDNA文庫大規(guī)模測序和表達(dá)譜芯片的構(gòu)建(High ThroughputSequencing of cDNA Library and Construction of Expression Microarray)對所得的鹽生杜氏藻cDNA文庫中的克隆進(jìn)行序列測定，用所測得的靶序列構(gòu)建表達(dá)譜芯片。將測序所得的克隆子溶解于3×SSC溶液中，使用Cartesian公司的Cartesian 7500點(diǎn)樣儀及TeleChem公司的硅烷化玻片，按公司提供的使用說明書操作。點(diǎn)樣后玻片經(jīng)水合、干燥、UV交連，再分別用SDS、水處理10分鐘，晾干備用。
實(shí)施例4鹽生杜氏藻表達(dá)譜芯片的篩選(Screening of the Expression Microarry)使用0.5mol/l、1.5mol/l、4.5mol/l濃度的NaCl溶液分別處理鹽生杜氏藻2小時(shí)后，提取不同鹽濃度處理后的鹽生杜氏藻mRNA，分別用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標(biāo)記，與表達(dá)譜芯片雜交，用General Scanning公司的ScanArray 3000掃描芯片，用Axon公司的Genepix 3.01軟件分析熒光信號強(qiáng)度。
表達(dá)譜芯片雜交結(jié)果顯示，有若干基因的表達(dá)量與鹽生杜氏藻的生長鹽濃度呈高度相關(guān)。其中，(6-4)光裂合酶基因?yàn)槠渲幸粭l。其具體數(shù)據(jù)分為三組第一組為cy5(4M)、cy3(1.5M)標(biāo)記的；第二組為cy5(4M)、cy3(0.5M)標(biāo)記的；第三組為cy5(1.5M)、cy3(0.5M)標(biāo)記的。三組標(biāo)記熒光信號強(qiáng)度的自然對數(shù)1n(cy5/cy3)的平均值為0.4，這說明隨著鹽濃度的變化，該基因的表達(dá)差異在1.5倍左右。
綜上所述，(6-4)光裂合酶為一未見報(bào)道的新型耐鹽相關(guān)蛋白。
實(shí)施例5鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的全長編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(對應(yīng)于SEQ ID NO1中最前20bp和最后20bp)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因cDNA克隆至中間載體pBluescript(購自Stratagene公司)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI 121(購自Clontech公司)，在保證閱讀框的前提下鑒定好的表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，獲得陽性克隆，用于轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
實(shí)施例6利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草按如下步驟轉(zhuǎn)化煙草(1)用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的實(shí)施例5中制備的農(nóng)桿菌陽性克隆，接種于2M LYEB液體(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；(2)室溫下4,000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2 MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600在0.5左右；(4)取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌液；(6)把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時(shí)；(7)將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+羧卞青霉素250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；(8)約20天后可見分化芽長出，帶芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
初步結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入鹽生杜氏藻藻烯醇酶基因的煙草的耐鹽性略高于對照煙草。
實(shí)施例7鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的全長編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼讀框的引物，正向引物為
CGCGGATCCATGCTGAGGTGCGCA(SEQ ID NO7)反向引物為CCGCTCGAGTTACTGGCACCTTTTCTT(SEQ ID NO8)并在正反引物上分別引入BamH I以及Xho I限制性酶切位點(diǎn)。鹽生杜氏藻藻烯醇酶基因的全長基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后和酶切后，將鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶cDNA克隆至中間載體(pBluescript)，進(jìn)一步克隆到原核表達(dá)載體pEGX-4T-1(購自ANERSHAM PHARMACIA公司)，在保證閱讀框正確的前提下鑒定表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌(JM109)感受態(tài)細(xì)胞中，形成表達(dá)載體pEGX-4T-1/6-4，挑選克隆子，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI、Xhol雙酶切驗(yàn)證。
實(shí)施例8鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的功能鑒定(1)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測對實(shí)施例7中獲得的轉(zhuǎn)化帶pEGX-4T-1/6-4的大腸桿菌，按1％體積接種到新的含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37攝氏度劇烈震蕩培養(yǎng)3～5h，至其OD600為0.6時(shí)，加IPTG至終濃度為1mmol/l，再培養(yǎng)1～4h，每隔1h分別取樣1ml離心，40μl無菌水重懸，加入等體積樣品緩沖液，沸水煮5min，冷卻后取20微升進(jìn)行8％的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并同時(shí)設(shè)置大腸桿菌JM109空白對照和pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌對照。
融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測用IPTG誘導(dǎo)無轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109、轉(zhuǎn)化了載體pGEX-4T-1和轉(zhuǎn)化了載體pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌，它們與無誘導(dǎo)的含質(zhì)粒pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌的總蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖。其中含質(zhì)粒pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，其細(xì)胞裂解物在對應(yīng)于約90KDa處有一明顯的GST-(6-4)光裂合酶條帶，分子量與預(yù)測值相符(圖1)。
(2)鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因的功能鑒定各挑取對照菌(含質(zhì)粒pGEX-4T-1)和陽性菌(含質(zhì)粒pGEX-4T-1/6-4的大腸桿菌)的單菌落，分別在2ml含抗生素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中37攝氏度培養(yǎng)過夜。吸取10ul培養(yǎng)物加到2ml新鮮的LB(含Amp)中37攝氏度繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時(shí)后，再加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2～3小時(shí)。在2個無菌的1.5ml的離心管中加入1ml無菌的LB培養(yǎng)基，分別吸取10ul培養(yǎng)物稀釋到管中，振蕩混勻。吸取100ul的稀釋液涂布在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，每個樣品涂布3個培養(yǎng)皿，分別取1個作為對照。將剩余的4個培養(yǎng)皿，放置在紫外光下照射(打開培養(yǎng)皿的蓋子)，時(shí)間為30秒。照射完畢后，立即蓋上蓋子，每個樣品取出1個用牛皮紙包嚴(yán)，不要透光，暗處37攝氏度培養(yǎng)過夜。剩余的2個和對照一起放到光下，37攝氏度培養(yǎng)過夜。計(jì)算菌落數(shù)，根據(jù)對照計(jì)算存活菌落數(shù)及存活率。
結(jié)果使得含有(6-4)光裂合酶基因表達(dá)載體的菌種具有比不含此質(zhì)粒的菌種在紫外線下具有更高的存活率(約提高50％)，這表明分離出的(6-4)光裂合酶具有修復(fù)DNA的活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>四川川大光耀生物工程有限公司<120>鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶及其編碼序列<130>037214<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1803<212>DNA<213>鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)<400>1atgctgaggt gcgcacaacc taagtatgca cctttgaagc gccaggcctt caaccagaaa60ttgaataggc ttgtggcagc agcccgcacc cctagcaaat catcttcaac atcaaggatg120gcctcaacat caagtggaca gcaaggccgc tctatcttgt ggtttagaaa gggcctgcgg180ctccacgaca accctgctct cagagatgcc tgcacagggt ctgctgctgt gttccctatc240ttcatcattg atccgtactt ccttcaaaaa tccaataaca aggttggtgt aaaccgctat300cagttccttt tggagagctt gagcgacctg aattcgagcc tgactagtct tggctcccaa360ctcctggttt tgagaggtac cccagaggag gtgataccaa gagttctgcg cgactggagc420atcaagaagc tctgctatga gattgacacg gagccatacg ctaaggcccg agatgctcgt480gtagatgaca tggcaaggga ggcaggagtg gaggtcaaaa agcactggag ccacacacta540tatgatacag acatgctagt gcgagaaaac aaagggaagg caccactgac catgcaggcg600tttgagaagt tggtagaccg tgttggccac cccctcaccg ctctgcctgc ccccacggct660cgccttcctc cggttgatgt cagcctgcca ggcatcaagg acgcagaagt gggagtcccc720acgtggcagg agatgggctt caaagaggca cccacagcta tcttcaaggg cggagagacg780gaggccctga agaggctgga acattacatg aaagacacaa agtgggyggc ctcgtttgag840aagccttcca ccgacccctc agccttcaca gagccctcca ccactgcgct gtccccatac900ctcaagtttg gatgcctgtc tgcacgcttc tttcaccaaa ggctgctgga tgtgtaccgc960
cttcacccca agcattcaca gccaccgatg tccctccgag ggcagctgct gtggcgagag 1020ttcttctata cattgggctc acacacccca aactttgacc gcatagcagg caaccccatc 1080tgccgacaga ttacttggga cacaaaccca gccctgctca aggcttggcg agatggggcc 1140actggttatc catggattga tgctgcgatg acccaactga gggaatgggg ctggatgcac 1200cacctggcac gccactctgt ggcttgcttc ctcaccaggg gggacctgta cctgagctgg 1260gagtctggca aggaggtgtt cgaggagttg ctcctggatg cagactattt cattaatgca 1320gcaaactgga tgtggctgag tgccagcgcg ttctttgcac aatactttag agtgtacagc 1380cctgttgtgt ttggcaagaa gtatgacaag gagggcgcct acatccggaa gttcttgcca 1440gtgctgaagg acatgcccgc aaagtacatc tatgagccat ggactgcgcc gaaagaagtc 1500cagcagcgcg ccaactgtat cataggccgg gactaccctg ctcccattgt ggaccatgca 1560gttgcaagca aagaatgcat agccagaatg ggagctgcgt acaaagccac aaacaccggg 1620ggcagtgcag gcaaagcctc ccctgcaaaa gcggcctctt ctggtgacgc cggcacttct 1680gcatcagcag gagcgccatc ttcgtccaag aagaccacag gcaagcgggc agcatctgca 1740gaccaaggtg gcaagcgtca aaagactctg gaggagtcga tgacgaagaa aaggtgccag 1800taa 1803<210>2<211>600<212>PRT<213>鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)<400>2Met Leu Arg Cys Ala Gln Pro Lys Tyr Ala Pro Leu Lys Ser Gln Ala1 5 10 15Phe Asn Gln Lys Leu Asn Arg Leu Val Ala Ala Ala Arg Thr Pro Ser20 25 30Lys Ser Ser Ser Thr Ser Arg Met Ala Ser Thr Ser Ser Gly Gln Gln35 40 45
Gly Arg Ser Ile Leu Trp Phe Arg Lys Gly Leu Arg Leu His Asp Asn50 55 60Pro Ala Leu Arg Asp Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Phe Pro Ile65 70 75 80Phe Ile Ile Asp Pro Tyr Phe Leu Gln Lys Ser Asn Asn Lys Val Gly85 90 95Val Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Leu Glu Ser Leu Ser Asp Leu Asn Ser100105 110Ser Leu Thr Ser Leu Gly Ser Gln Leu Leu Val Leu Arg Gly Thr Pro115120 125Glu Glu Val Ile Pro Arg Val Leu Arg Asp Trp Ser Ile Lys Lys Leu130135 140Cys Tyr Glu Ile Asp Thr Glu Pro Tyr Ala Lys Ala Arg Asp Ala Arg145150 155 160Val Asp Asp Met Ala Arg Glu Ala Gly Val Glu Val Lys Lys His Trp165170 175Ser His Thr Leu Tyr Asp Thr Asp Met Leu Val Arg Glu Asn Lys Gly180185 190Lys Ala Pro Leu Thr Met Gln Ala Phe Glu Lys Leu Val Asp Arg Val195200 205Gly His Pro Leu Thr Ala Leu Pro Ala Pro Thr Ala Arg Leu Pro Pro210215 220Val Asp Val Ser Leu Pro Gly Ile Lys Asp Ala Glu Val Gly Val Pro225230 235 240
Thr Trp Gln Glu Met Gly Phe Lys Glu Ala Pro Thr Ala Ile Phe Lys245 250 255Gly Gly Glu Thr Glu Ala Leu Lys Arg Leu Glu His Tyr Met Lys Asp260 265 270Thr Lys Trp Val Ala Ser Phe Glu Lys Pro Ser Thr Asp Pro Ser Ala275 280 285Phe Thr Glu Pro Ser Thr Thr Ala Leu Ser Pro Tyr Leu Lys Phe Gly290 295 300Cys Leu Ser Ala Arg Phe Phe His Gln Arg Leu Leu Asp Val Tyr Arg305 310 315 320Leu His Pro Lys His Ser Gln Pro Pro Met Ser Leu Arg Gly Gln Leu325 330 335Leu Trp Arg Glu Phe Phe Tyr Thr Leu Gly Ser His Thr Pro Asn Phe340 345 350Asp Arg Ile Ala Gly Asn Pro Ile Cys Arg Gln Ile Thr Trp Asp Thr355 360 365Asn Pro Ala Leu Leu Lys Ala Trp Arg Asp Gly Ala Thr Gly Tyr Pro370 375 380Trp Ile Asp Ala Ala Met Thr Gln Leu Arg Glu Trp Gly Trp Met His385 390 395 400Arg Leu Ala Arg His Ser Val Ala Cys Phe Leu Thr Arg Gly Asp Leu405 410 415Tyr Leu Ser Trp Glu Ser Gly Lys Glu Val Phe Glu Glu Leu Leu Leu420 425 430
Asp Ala Asp Tyr Phe Ile Asn Ala Ala Asn Trp Met Trp Leu Ser Ala435440 445Ser Ala Phe Phe Ala Gln Tyr Phe Arg Val Tyr Ser Pro Val Val Phe450455 460Gly Lys Lys Tyr Asp Lys Glu Gly Ala Tyr Ile Arg Lys Phe Leu Pro465470 475 480Val Leu Lys Asp Met Pro Ala Lys Tyr Ile Tyr Glu Pro Trp Thr Ala485490 495Pro Lys Glu Val Gln Gln Arg Ala Asn Cys Ile Ile Gly Arg Asp Tyr500505 510Pro Ala Pro Ile Val Asp His Ala Val Ala Ser Lys Glu Cys Ile Ala515520 525Arg Met Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Thr Asn Thr Gly Gly Ser Ala Gly530535 540Lys Ala Ser Pro Ala Lys Ala Ala Ser Ser Gly Asp Ala Gly Thr Ser545550 555 560Ala Ser Ala Gly Ala Pro Ser Ser Ser Lys Lys Thr Thr Gly Lys Arg565570 575Ala Ala Ser Ala Asp Gln Gly Gly Lys Arg Gln Lys Thr Leu Glu Glu580585 590Ser Met Thr Lys Lys Arg Cys Gln595600<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atggcaaggg aggcaggagt gga23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>8ccgctcgagt tactggcacc ttttctt2權(quán)利要求
1.一種分離的鹽生杜氏藻光裂合酶，其特征在于，該酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的酶，其特征在于，該光裂合酶是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述的鹽生杜氏藻光裂合酶的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1800位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1803位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鹽生杜氏藻光裂合酶。
9.一種改善植物耐鹽性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有光裂合酶DNA編碼序列，所述的光裂合酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有光裂合酶功能的由(a)衍生的多肽。(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使光裂合酶DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入光裂合酶DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該光裂合酶是具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的耐鹽相關(guān)蛋白－鹽生杜氏藻(6－4)光裂合酶，編碼(6－4)光裂合酶的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種(6－4)光裂合酶的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種(6－4)光裂合酶的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了此(6－4)光裂合酶用于改善植物耐鹽性和抗紫外性的方法。
文檔編號A01H1/06GK1624120SQ20031010902
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者曹毅, 蔣彥, 楊滔, 曾昌耀 申請人:四川川大光耀生物工程有限公司