專利名稱：一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，屬于微生物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植物保護(hù)、防除農(nóng)作物雜草的技術(shù)領(lǐng)域，專用于農(nóng)田雜草的生物防除。
二、技術(shù)背景目前，國內(nèi)防治草害主要還是依賴于化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)品，而且其使用量和面積還在不斷擴(kuò)大。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易國際化，全國農(nóng)藥行業(yè)正面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，新品種化學(xué)農(nóng)藥的高額研制開發(fā)成本阻礙了農(nóng)藥工業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。另一方面，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，已經(jīng)和正在造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，直接危害到人畜健康和影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，尋求新的防治手段，降低化學(xué)農(nóng)藥的使用，成為一個迫在眉睫的關(guān)鍵。發(fā)展生物防治技術(shù)，特別是以生物農(nóng)藥替代化學(xué)農(nóng)藥，以在世界范圍內(nèi)形成共識，引起了大家的關(guān)注。生物農(nóng)藥新品的研制開發(fā)，比化學(xué)農(nóng)藥所需投入較少，且周期短，符合國情。生物農(nóng)藥的開發(fā)和利用，正成為農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化和農(nóng)業(yè)可持續(xù)的標(biāo)志性技術(shù)。展望未來，生物農(nóng)藥將作為一種高新技術(shù)，在保護(hù)環(huán)境，保證人類健康，在農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展中，發(fā)揮愈來愈重要的作用。目前，作為生物農(nóng)藥的一個主要組成部分，國內(nèi)尚沒有一種產(chǎn)業(yè)化的生物除草劑，而綠色食品和有機(jī)食品的生產(chǎn)卻迫切需求無污染的生物除草劑解決雜草問題。
波斯婆婆納(Veronica persica Poir)、馬唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)、紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum Spreng.)和蒼耳(Xanthium occidentale Bertol.)是世界性的惡性雜草，對農(nóng)田和生態(tài)環(huán)境造成了極為嚴(yán)重的危害。
波斯婆婆納是麥類、油菜等夏熟作物田的惡性雜草，對棉、玉米、大豆等幼苗生長也危害嚴(yán)重，蔬菜田、果園、草坪和園藝作物田中也常有發(fā)生。波斯婆婆納的分布范圍廣泛，我國長江流域及華北地區(qū)均有其發(fā)生和危害的報道，另外它也是歐洲、西亞和美洲農(nóng)田的惡性雜草。該雜草繁殖能力強(qiáng)，生長速度快，生長期長，耐藥性強(qiáng)，人工、機(jī)械和化學(xué)防除比較困難。
馬唐是玉米、棉花、甘薯、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的惡性雜草，對棉花、煙草、麻類、甘蔗等幼苗生長危害嚴(yán)重，也是蔬菜田、果園、草坪和園藝作物田的優(yōu)勢雜草。甚至也是南方陸稻田的主要危害性雜草。馬唐的分布范圍廣泛，是世界熱帶和溫帶地區(qū)廣布種。該雜草繁殖能力強(qiáng)，生長速度快，生長期長，消耗地力，遮光，耐藥性強(qiáng)。
紫莖澤蘭入侵農(nóng)田、草地、草原、路邊、宅旁、經(jīng)濟(jì)林地和森林，以其異株克生作用的特性，較快形成優(yōu)勢種群，已經(jīng)給農(nóng)、林、牧業(yè)生產(chǎn)及多種經(jīng)營造成極大的損失。自20世紀(jì)40年代傳入我國以來，已經(jīng)西南地區(qū)的云南、貴州、四川、廣西和重慶廣泛分布和危害，并仍在以每年大約60公里的速度，隨西南風(fēng)向東和向北方向傳播擴(kuò)散。
蒼耳是旱地重要的危害性雜草，其植株高大，對作物生長造成嚴(yán)重影響。主要分布發(fā)生在東北、華北、華中、華東、華南和西南等地區(qū)，主要危害玉米、棉花、大豆、甘薯、蔬菜等旱地作物。
發(fā)明人在雜草生物防治的研究過程中發(fā)現(xiàn)這四種雜草在自然界存在自然發(fā)病的植株，對這四種雜草的寄生真菌進(jìn)行篩選研究，最終分離到四種菌株，并對這四種菌種的培養(yǎng)條件、大批量生產(chǎn)方法、安全性及致病性均已進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，結(jié)果表明，這四種菌株均有潛力發(fā)展成為生物除草劑。它們分別為膠胞炭疽菌婆婆納專化型(Colletotrichum gloeosporioides f.sp.weronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)、紫莖澤蘭鏈格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)、馬唐雙曲孢霉屬(Nakataea Hara)菌株以及百日草鏈格孢(Alternaria zinniae Pape)菌株。
目前，國內(nèi)外除針對馬唐的生物真菌在美國有所報道外(與本權(quán)力要求書所指馬唐生防菌株不同)，波斯婆婆納和紫莖澤蘭的生物除草劑尚未見報道。而有關(guān)這四種生防真菌大批量生產(chǎn)的方法更是鮮見報道。生物除草劑要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)成本是至關(guān)重要的因素。從經(jīng)濟(jì)因素方面考慮，要求培養(yǎng)基組分簡單、價格便宜、原料可大量獲得，并且生產(chǎn)過程易于操作，勞動量降到最低。因而，研究生物除草劑的大批量生產(chǎn)工藝和方法，是生物除草劑研究中的核心關(guān)鍵內(nèi)容，一方面，一株優(yōu)良生防菌株為達(dá)到商業(yè)化進(jìn)程，必須能夠有一套較為完整齊全的大批量生產(chǎn)工藝，另一方面，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，為了保證農(nóng)產(chǎn)品在價格上有競爭力，要求使用的生物除草劑價格便宜。
現(xiàn)在已經(jīng)商品化或正在生產(chǎn)上使用的真菌除草劑，多是經(jīng)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的。固體發(fā)酵，生產(chǎn)周期相對較長，因而生物除草劑工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法是液體發(fā)酵，這種方法不需要對現(xiàn)有的工業(yè)發(fā)酵設(shè)備做多少改進(jìn)就可以直接利用標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵和下游處理裝置進(jìn)行。北美四種商業(yè)化的生物除草劑中，Collego、Devine和BioMal是通過深層液體發(fā)酵生產(chǎn)的。但是生物除草劑的除草活性單元往往是真菌有活力的部分，例如菌絲體、分生孢子、厚垣孢子等無性繁殖體，而通過液體發(fā)酵生產(chǎn)的分生孢子等真菌活性部分在發(fā)酵液中保藏，活力衰退較快。例如生物除草劑Devine是第一個被作為生物除草劑研制的，它的侵染單元為液體發(fā)酵獲得的新鮮的厚垣孢子懸浮劑，必須像新鮮牛奶一樣貯藏，并且只有六個星期的貨架期，致使其商業(yè)化進(jìn)程被延遲，直至上個世紀(jì)80年代初才被商業(yè)化。此外，為了得到高濃度的生物除草劑，需要經(jīng)過過濾濃縮、脫水干燥等一系列步驟，整個工藝流程復(fù)雜，需要專用設(shè)備，增加了成本。
與同期化學(xué)除草劑的發(fā)展速度相比較，生物除草劑的發(fā)展速度無疑緩慢，經(jīng)濟(jì)高效的大批量生產(chǎn)方法一直是阻礙生物除草劑發(fā)展的瓶頸因子。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，針對真菌菌株的生物學(xué)與產(chǎn)孢特性，通過對培養(yǎng)發(fā)酵方法、培養(yǎng)基的種類、pH和水分含量及培養(yǎng)時間、光照、溫度等一系列研究，克服阻礙生物除草劑發(fā)展的瓶頸因子，探索最經(jīng)濟(jì)有效的大批量生產(chǎn)生物除草劑的工藝。
技術(shù)方案一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，采用液體-固體聯(lián)合發(fā)酵的方法，其具體工藝流程如下將生物除草劑真菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，在15-30℃條件下，培養(yǎng)5-7d，獲得一級種菌后；切取一級種菌培養(yǎng)物小塊，接種到液體培養(yǎng)基中，15-35℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)3-10d，振搖速度為20-180轉(zhuǎn)/min，待菌絲團(tuán)長滿后，獲得二級液體種菌，即菌體懸浮液；固體培養(yǎng)基由麥麩或米糠和其它一種、兩種或三種農(nóng)副產(chǎn)品組成，麥麩或米糠干重∶其它組分干重＝1∶0.1-9，按比例稱取固體培養(yǎng)基干料后，加入干料重的0.3-3.0倍水，拌勻滅菌；在無菌環(huán)境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養(yǎng)基上，好氣培養(yǎng)，溫度15-35℃，無菌條件下固體發(fā)酵生產(chǎn)3-8d，獲得大批量的生物除草劑。
上述的一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，二級液體種菌最好用粉碎機(jī)粉碎獲得菌體懸浮液；固體培養(yǎng)的條件最好增加20W波長365nm黑光燈、日光燈或紫外光燈間隙照射。
上述液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的農(nóng)副產(chǎn)品原料為工業(yè)下腳料的農(nóng)副基礎(chǔ)產(chǎn)品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆餅粉、玉米淀粉、豆餅粉、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農(nóng)副產(chǎn)品，以及多種樹木的鋸末屑。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和積極效果1、比較純固體發(fā)酵，本發(fā)明方法可誘導(dǎo)生產(chǎn)至少5倍以上的生物除草劑產(chǎn)品，并使固體發(fā)酵時間縮短2-7d。發(fā)明人在對生物除草劑的大批量生產(chǎn)研制過程中，發(fā)現(xiàn)有些生物除草劑能夠通過液體發(fā)酵生產(chǎn)，有些能通過固體發(fā)酵生產(chǎn)獲得。通過液體發(fā)酵生產(chǎn)的生物除草劑保存在發(fā)酵液中，活力衰退較快，六個星期后基本喪失。而要將生物除草劑從發(fā)酵液中分離出來，技術(shù)難度需求較高，需要一系列額外的高值設(shè)備，需要另行增加很大的資金。對于生物除草劑這樣一項風(fēng)險性較大，國內(nèi)目前尚無一項研制成功先例的研究技術(shù)，研制之初，不可能找到足夠的資金支持。這無疑將限制此項技術(shù)的深入研究。真菌通過固體發(fā)酵生產(chǎn)能夠克服從發(fā)酵液中收獲生物除草劑困難的缺點，但是，發(fā)酵過程相對較長，并且真菌在其中長勢極不均勻，造成原材料極大的浪費。因此嘗試?yán)靡后w-固體發(fā)酵相結(jié)合的培養(yǎng)方式，即通過液體發(fā)酵獲得的液體菌種，能夠均勻接種到固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基上長勢均勻，能充分利用原材料物，并使固體發(fā)酵時間縮短2-7d。生物除草劑菌種在固體培養(yǎng)基上固態(tài)發(fā)酵的溫度較寬，在15-35℃的條件下生長，均能獲得大量的生物除草劑；對光照的要求不嚴(yán)格，在自然光照、全光照及全黑暗條件下，均能正常生長獲得生物除草劑，并在特殊光源(黑光燈、紫外燈)照射下可誘導(dǎo)生產(chǎn)至少5倍以上的生物除草劑產(chǎn)品。
2、本發(fā)明所選用的培養(yǎng)基的營養(yǎng)全面。本發(fā)明所用的液體和固體培養(yǎng)基為工業(yè)下腳料的農(nóng)副基礎(chǔ)產(chǎn)品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、玉米淀粉、豆餅粉、甘油、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農(nóng)副產(chǎn)品，以及多種樹木的殘屑鋸末。這些發(fā)酵培養(yǎng)基價格低廉，來源充足，被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的效率高。所選用的培養(yǎng)基的營養(yǎng)全面，含有豐富的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、無氮浸出物、粗灰分以及鈣、磷等元素。在制備發(fā)酵培養(yǎng)基時合理配制能夠滿足菌種生長、繁殖。
3、適宜的起始含水量，使得培養(yǎng)基有合適的疏松度，顆粒間存在一定空隙，有助于菌體從培養(yǎng)基獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞，從而促進(jìn)生長繁殖。過高的含水量會導(dǎo)致培養(yǎng)基黏結(jié)成團(tuán)，多孔性降低，影響氧的傳遞；含水量過低，則使培養(yǎng)基膨脹程度降低，水的活度低，從而抑制菌體生長。真菌在適宜的環(huán)境下先進(jìn)行營養(yǎng)生長，然后在條件不適宜時進(jìn)行生殖生長。因此，在配制培養(yǎng)基時要掌握好水分的加入量，水分加入過少，濕度過小，真菌的營養(yǎng)生長不充分，生殖生長有限。但是培養(yǎng)基濕度過大時，又容易造成培養(yǎng)基通氣差，在發(fā)酵過程中受細(xì)菌污染，真菌的營養(yǎng)生長同樣受抑，也不利于生殖生長的進(jìn)行。而在加水適宜時，真菌的營養(yǎng)生長充分，將不利于細(xì)菌生長導(dǎo)致污染。研究發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵培養(yǎng)基按比例稱取干料并拌勻，再按干料重量∶水的重量＝1∶0.3-3的比例加水拌勻，能夠得到松緊適宜的固體培養(yǎng)基，適合菌種生長。
4、本發(fā)明所選用的液體和固體培養(yǎng)基均可大量獲得，價廉、操作方便、產(chǎn)孢效率高，利于生產(chǎn)成本的控制。固態(tài)發(fā)酵試驗的基質(zhì)采用麩皮、米糠等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品。麩皮為小麥面粉加工的副產(chǎn)物，含有豐富的碳水化合物和含氮化合物，并含有多種維生素，質(zhì)地疏松，利于通氣，是微生物生長繁殖的優(yōu)良基質(zhì)；且原料來源廣泛，價格低廉。
5、工藝簡單易行。液體-固體聯(lián)合發(fā)酵方法結(jié)合了液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種發(fā)酵方法的長處，省卻了一系列從液體發(fā)酵液中收獲生物除草劑接種體所需的繁復(fù)工藝和固態(tài)發(fā)酵時間較長的缺點，液體發(fā)酵種菌均勻接種于固體培養(yǎng)基上，使發(fā)酵原料轉(zhuǎn)化為生物除草劑的比例增高，減少了原料的浪費，縮短了整個發(fā)酵的周期。而且，生產(chǎn)出來的分生孢子吸附在干燥的固體培養(yǎng)基基質(zhì)中，后處理工藝簡單易行，制劑容易存放。
具體實施例方式
實施例1膠孢炭疽菌婆婆納?；途闝Z-97a(專利申請?zhí)枮?0112506.0)，它的除草活性成分為該菌的分生孢子。具體實施方法如下菌株QZ-97a在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，接種到玉米粉黃豆粉蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7d，用粉碎機(jī)粉碎獲得菌體懸浮液。固體培養(yǎng)基由麥麩、黃豆粉和甘薯粉按干重比7∶2∶1稱取后，加入干料重的1.5倍水，拌勻滅菌。在無菌環(huán)境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養(yǎng)基上，在自制的培養(yǎng)箱中好氣培養(yǎng)3-7d，房間的溫度用空調(diào)控制20℃，每克干物質(zhì)生產(chǎn)的孢子量可達(dá)到7.8×109個/克以上，過篩后，能獲得孢子量在1010個/克以上的孢子粉。這個數(shù)量足以滿足在大田使用的同時，保證產(chǎn)品的生產(chǎn)成本保持低廉。液-固體聯(lián)合發(fā)酵較純固體發(fā)酵產(chǎn)孢量至少多出5倍，且固體發(fā)酵時間縮短2-7d。上述實施方法中固體培養(yǎng)基、發(fā)酵周期、不同水分含量試驗及結(jié)果如下配制10組固體培養(yǎng)基，1.麥麩50克；2.麥麩25克+豆粕25克；3.麥麩25克+米糠25克；4.麥麩35克+玉米粉15克；5.米糠50克；6.米糠15克+豆粕35克；7.麥麩30+鋸末15克+魚粉5克；8.鋸末15克+豆粕35克；9.麥麩35克+豆渣15克；10.麥麩35克+黃豆粉10克+甘薯粉5克。每組培養(yǎng)基中各加入碳酸鈣1.5克、蔗糖1.5克、水40ml混勻滅菌，接種二級液體種菌后進(jìn)行產(chǎn)孢。固體培養(yǎng)基產(chǎn)孢完畢后，于30℃烘箱中烘干，取0.1g加入100ml水，用碾缽充分磨碎后，計數(shù)孢子數(shù)(表1)。
表1固體培養(yǎng)基對菌株QZ-97a產(chǎn)孢的影響產(chǎn)孢量 顯著水平培養(yǎng)基109個/克 Significance levelSolid mediaConidia yields 0.05 0.01麥麩+玉米粉 6.67±0.30 b BC麥麩+鋸末+魚粉 7.41±1.20 a A麥麩 6.99±0.42 b AB麥麩+米糠6.76±0.54 b B麥麩+豆餅粉 6.38±0.45 c BC米糠 5.79±0.53 d D米糠+豆餅粉 7.24±0.79 a A鋸末+豆餅粉 5.46±0.26 d D麥麩+豆渣6.12±0.75 b C麥麩+黃豆粉+甘薯粉 7.80±0.65 a A表1結(jié)果表明，膠孢炭疽菌QZ-97a在供試的10種固體培養(yǎng)基上生長都能夠得到大量的分生孢子，最大的產(chǎn)孢量出現(xiàn)在麥麩黃豆粉甘薯粉固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵結(jié)束后每克干物質(zhì)孢子量達(dá)到7.8×109個。
固體培養(yǎng)基(麥麩35克、黃豆粉10克、甘薯粉5克、碳酸鈣1.5克、蔗糖1.5克)，接種菌絲體懸浮液后，固體分別培養(yǎng)生長2、3、4、5、6、7、8天。產(chǎn)孢完畢后，于30℃烘箱中烘干，取0.1g加入100ml水，用碾缽充分磨碎后，計數(shù)孢子數(shù)(表2)。
表2 發(fā)酵周期對炭疽菌QZ-97a固體發(fā)酵產(chǎn)孢的影響產(chǎn)孢量 顯著水平發(fā)酵周期(d)108個/ml 0.050.017 4.35±0.70a A9 4.20±0.19ab A8 4.08±0.35ab A6 3.99±0.32b AB5 3.57±0.44c B4 2.59±0.30d C3 1.18±0.62e D2 0.68±0.25f E表2結(jié)果表明，產(chǎn)孢量隨著時間延長，產(chǎn)孢量增大，固體發(fā)酵至第7天時產(chǎn)孢量達(dá)到最大。延長發(fā)酵時間，產(chǎn)孢量之間差異不顯著，因此，在培養(yǎng)時，固體培養(yǎng)7天即可結(jié)束培養(yǎng)，這樣至少可以縮短固體培養(yǎng)時間3天。
固體培養(yǎng)基(麥麩35克、黃豆粉10克、甘薯粉5克、碳酸鈣1.5克、蔗糖1.5克)，分別加水5、15、25、35、45、55、65、75、85、95ml，接種菌絲體懸浮液后，生長5天檢測孢子數(shù)(表3)。
表3不同水分含量對固體培養(yǎng)基產(chǎn)孢的影響水分含量 顯著水平產(chǎn)孢量109個/克(ml) 0.05 0.0195 5.3±0.70b BC85 7.2±0.63abA75 7.3±0.80a A65 6.4±0.50b AB55 6.3±0.31b AB45 6.1±0.61b AB35 5.5±0.56c BC25 4.7±0.49c BC15 4.3±0.41c C5 3.1±0.51d C培養(yǎng)基含水量是決定固體培養(yǎng)產(chǎn)孢的一個重要因子。表3中，產(chǎn)孢量隨著含水量增加而增大，在加水量為75ml時產(chǎn)孢量達(dá)到最大值，加水量繼續(xù)增大時，產(chǎn)孢量出現(xiàn)下降的趨勢。因此，在配制固體培養(yǎng)基時，掌握好固體培養(yǎng)基的含水量至關(guān)重要，以加入干料重的1.5倍時最佳。
實施例2 紫莖澤蘭鏈格孢菌利用粗代謝產(chǎn)物控制雜草，具體實施方法如下鏈格孢菌株(專利申請?zhí)枮?0112560.5)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，接種到黃豆粉玉米粉蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，用粉碎機(jī)粉碎獲得菌絲體懸浮液。固體培養(yǎng)基由玉米粉豆餅按干重比1∶1稱取后，加入干料重的0.33倍水，拌勻滅菌。在無菌環(huán)境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養(yǎng)基上，用保鮮袋密封后，適當(dāng)打孔，控溫25℃培養(yǎng)10天。培養(yǎng)結(jié)束后風(fēng)干制備粗毒素，稀釋后用針刺法測試生物活性，產(chǎn)毒能力用顯微測微尺測量病斑直徑大小(mm)表示。按此法培養(yǎng)顯著提高產(chǎn)毒量，可使葉片致病病斑直徑達(dá)4.63mm以上，固體發(fā)酵時間較純固體發(fā)酵縮短2-7d。
上述實施方法中固體培養(yǎng)基、發(fā)酵周期、不同水分含量試驗及結(jié)果如下分別用1∶1質(zhì)量比的米糠+麥麩、玉米粉+麥麩、米糠+豆餅、玉米粉+豆餅、玉米粉+黃豆粉、豆渣+甘薯粉、花生殼+花生粉、酒釀渣+棉子餅和玉米淀粉+亞麻子餅粉配制固體培養(yǎng)基。接種搖瓶振蕩培養(yǎng)的鏈格孢菌絲體，按實施例于適宜條件下固體生長產(chǎn)毒。固體培養(yǎng)結(jié)束后，風(fēng)干按流程制備粗毒素，稀釋后用針刺法測試生物活性，重復(fù)5次(表4)。
表4固體培養(yǎng)介質(zhì)對鏈格孢產(chǎn)毒量的影響病斑直徑 顯著水平培養(yǎng)基(mm) 0.05 0.01玉米粉+豆餅 2.49±0.23aA玉米粉+麥麩 1.70±0.14bB米糠+豆餅0.51±0.15dD米糠+麥麩0.55±0.10dD玉米粉+黃豆粉0.88±0.16cC豆渣+甘薯粉 0.65±0.13dD花生殼+花生粉1.63±0.12bB酒釀渣+棉子餅1.32±0.08bB玉米淀粉+亞麻子餅粉 1.25±0.11bB幾種固體培養(yǎng)介質(zhì)對鏈格孢產(chǎn)毒量的比較表明，多數(shù)固體介質(zhì)可以用來產(chǎn)毒，但鏈格孢在玉米粉和豆餅復(fù)配的固體培養(yǎng)基中產(chǎn)毒最高，可使葉片致病病斑直徑達(dá)2.49mm。因此，選用玉米粉豆餅作為鏈格孢產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)介質(zhì)。
配制玉米粉∶豆餅質(zhì)量比為1∶1的固體培養(yǎng)基，干物質(zhì)與水的比例分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按實施例接種培養(yǎng)風(fēng)干后制備粗毒素，稀釋針刺測試活性。
表5培養(yǎng)基含水量對鏈格孢產(chǎn)毒的影響病斑直徑 顯著水平干物質(zhì)重∶水重 (mm) 0.05 0.014∶12.31±0.19cC3∶14.63±0.24aA2∶13.06±0.25bB1∶11.80±0.23dD培養(yǎng)基含水量決定了鏈格孢在固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒大小，在干物質(zhì)重∶水重＝3∶1時，產(chǎn)毒量達(dá)到4.63mm，為最大值。含水量繼續(xù)增大，產(chǎn)毒量下降。
按實施例配制質(zhì)量比1∶1的玉米粉+豆餅固體培養(yǎng)基，接種后于適宜條件下分別培養(yǎng)5、10、15、20天后取樣，風(fēng)干后制備粗毒素。稀釋針刺測試活性。
表6培養(yǎng)時間對鏈格孢產(chǎn)毒量的影響顯著水平培養(yǎng)時間(d)病斑直徑0.05 0.015 4.35±0.70bB105.57±0.44aA155.59±0.30aA206.18±0.62aA固體培養(yǎng)10天，產(chǎn)毒量能夠達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加培養(yǎng)時間，對毒素的增大效果不顯著，掌握這一點，利于在實踐中把握好固體發(fā)酵的時間，省時省力。
實施例3 馬唐雙曲孢霉屬的除草活性成分為該菌的分生孢子。具體實施方法如下菌株QZ-2000(專利申請?zhí)枮?11340020.9)，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，接種到玉米粉黃豆粉蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，用粉碎機(jī)粉碎獲得菌絲體懸浮液。固體培養(yǎng)基由黃豆粉+棉子餅按干重比2∶1稱取后，加入干料重的0.6倍水，拌勻滅菌。在無菌環(huán)境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養(yǎng)基上，在自制的培養(yǎng)箱中好氣培養(yǎng)3-8天，置于20W黑光燈(波長365nm)下、日光燈照射1-3天、或紫外光燈間隙照射共計1-10小時，房間的溫度用空調(diào)控制在28℃。每克干物質(zhì)最大產(chǎn)孢量達(dá)到8.6×108個/克，較純固體發(fā)酵產(chǎn)孢量至少多出5倍，且固體發(fā)酵時間縮短2-7d。
上述實施方法中固體培養(yǎng)基、光照及不同水分含量試驗及結(jié)果如下配制質(zhì)量比2∶1的固體培養(yǎng)基(麥麩單用)，所選擇的鋸末木材有杉樹、楊樹、松樹及櫟樹，按照干料重量∶水重量＝1∶0.8配制固體培養(yǎng)基。按實施例于適宜條件下固體生長產(chǎn)孢，待菌絲鋪滿培養(yǎng)基，置于黑光燈下照射2天后測量產(chǎn)孢量。
表7固體培養(yǎng)基對菌株QZ-2000產(chǎn)孢的影響(108個/g*)杉樹楊樹 松樹麥 杉鋸+楊鋸+松鋸+ 櫟鋸+培養(yǎng)基鋸末鋸末 鋸末麩 麥麩 麥麩 麥麩 麥麩平均產(chǎn)孢量 2.5c3.4c 3.6c6.0ab 6.6ab6.9a 6.1ab 5.8b花生殼黃豆粉+ 甘薯粉+ 米糠+ 花生粉+ 魚粉+棉 豆渣+玉米粉++玉米培養(yǎng)基棉子餅 花生殼玉米粉 棉子餅 子餅 楊鋸 豆餅粉蛋白平均產(chǎn)孢量 7.1a5.2b 6.1b4.9b4.8b 6.4ab3.6b 2.66c注*數(shù)據(jù)后跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表7結(jié)果表明，多種樹材的鋸末以及多種農(nóng)副產(chǎn)品都可以用來生產(chǎn)QZ-2000的分生孢子，轉(zhuǎn)化率較高，其中又以黃豆粉+棉子餅混用產(chǎn)孢量最大，每克干物質(zhì)最大產(chǎn)孢量達(dá)到7.1×108個/克。
配制質(zhì)量比為2∶1的黃豆粉+棉子餅固體培養(yǎng)基，加水使得含水量分別是固體培養(yǎng)基干重的30％、40％、50％、60％和70％，按照實施例接種后待菌絲鋪滿培養(yǎng)基，置于黑光燈下照射2天，檢測孢子量(表8)。
表8不同含水量對固體培養(yǎng)基產(chǎn)孢的影響(108個/g*)含水量 30％ 40％ 50％ 60％ 70％平均產(chǎn)孢量3.19d5.25c7.25b7.64a5.75c注*數(shù)據(jù)后跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表8結(jié)果表明，隨著含水量增加，產(chǎn)孢量增大。含水量60％的固體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，產(chǎn)孢量為7.64×108個/g。培養(yǎng)基含水量增大到70％時，產(chǎn)孢量顯著降低。因此，在固體發(fā)酵時要掌握好水分的加入量。
配制質(zhì)量比為2∶1的黃豆粉+棉子餅固體培養(yǎng)基，含水量為固體培養(yǎng)基干重的60％。按照實施例接種后待菌絲鋪滿培養(yǎng)基時，1.加蓋置于黑光燈、紫外燈、日光燈下連續(xù)光照、12h光暗交替；距離25cm；2.去蓋置于以上各條件下；3.連續(xù)黑暗條件下處理。以室內(nèi)自然光照作為對照，室溫為25-28℃，2d后計數(shù)孢子產(chǎn)生的數(shù)量(表9)。每個處理5個重復(fù)。
表9光照對菌株QZ-2000產(chǎn)孢的影響自然 連續(xù)光照 12h光暗交替 完全處理光照紫外燈 黑光燈 日光燈 紫外燈 黑光燈 日光燈 黑暗覆蓋0.48*H 8.0B7.3C3.4FG7.9C5.4E2.6G光照0.23H敞開0.53H0 8.6A3.9F 0 6.6D2.8FG光照*表內(nèi)數(shù)據(jù)為孢子數(shù)量(×108/克)注在行、列中數(shù)據(jù)后大寫字母的表示有極顯著差異和顯著差異(P＝0.01)表9的試驗結(jié)果顯示，固體培養(yǎng)的后期光照可以極大促進(jìn)產(chǎn)孢，連續(xù)光照對產(chǎn)孢的增效大于12h光暗交替，而三種光照方式進(jìn)行比較，又以黑管燈光照對產(chǎn)孢的促進(jìn)作用最為明顯。最大產(chǎn)孢量8.6×108個/克出現(xiàn)在固體培養(yǎng)基敞開黑光燈連續(xù)光照的小組中。
實施例4 百日草鏈格孢菌株利用真菌分生孢子殺死雜草，生產(chǎn)的具體實施方式
如下百日草鏈格孢菌株(公知公用，強(qiáng)勝、郭愛民、Bruce A.Auld等，大批量生產(chǎn)百日草鏈孢菌孢子的技術(shù)，1997.中國生物防治13(4)169-172)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，接種到玉米粉黃豆粉蔗糖碳酸鈣液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4天，菌體開始沉積黑色色素時，將菌體取出過濾，并用無菌水洗去菌體代謝產(chǎn)物及剩余營養(yǎng)物，用粉碎機(jī)將菌絲體粉碎。固體培養(yǎng)基以麥麩或米糠干重∶鋸末屑干重＝1∶7稱取，再按干料重量∶水的重量＝1∶2.0的比例加水拌勻。將菌絲體懸浮液接種于固體培養(yǎng)基上，隨即置于20W黑光燈(波長365nm)下40cm處進(jìn)行12小時循環(huán)光照，室溫條件下誘導(dǎo)產(chǎn)孢，在自制的培養(yǎng)箱中好氣培養(yǎng)3-8天。每克干物質(zhì)生產(chǎn)的孢子量最大值達(dá)到3.11×107個/克，較純固體發(fā)酵產(chǎn)孢量至少多出5倍，且固體發(fā)酵時間縮短2-7d。
上述實施方法中的光照啟始時間以及液體培養(yǎng)基中氮含量對百日草鏈格孢菌產(chǎn)孢量的試驗及結(jié)果如下用每升含玉米粉17g、豆粉1g、CaCO33g的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行菌絲體發(fā)酵所得菌絲體經(jīng)過濾、洗滌、粉碎等處理后，接種在以麥麩干重∶鋸末屑干重＝1∶7，再按干料重量∶水的重量＝1∶2.0的比例加水拌勻的固體培養(yǎng)基上。分4組，每組的3個平皿，分別經(jīng)0、3、6、9小時黑暗后用黑光燈誘導(dǎo)產(chǎn)孢。
表10近紫外光照射的啟始時間對百日草鏈格孢菌產(chǎn)孢量(107/g*)的影響啟始時間 0369平均產(chǎn)孢量3.11a2.73b2.43c2.27c注數(shù)據(jù)后跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表10結(jié)果顯示，菌絲體懸浮液接種到固體培養(yǎng)基上后隨即采用20W黑光燈(波長365nm)下40cm處進(jìn)行12小時循環(huán)光照的孢子產(chǎn)量較分別間隔3、6和9個小時再施加光照的孢子產(chǎn)量顯著增加，并且間隔時間越短，產(chǎn)孢量越大。
液體培養(yǎng)基中氮含量對固體培養(yǎng)基百日草鏈格孢菌產(chǎn)孢量的影響在液體培養(yǎng)基中，豆粉所含氮量占培養(yǎng)基中氮含量的絕大部分，豆粉的含量可近似看作與培養(yǎng)基中氮含量成正比。在保持培養(yǎng)基干物質(zhì)總量不變，即玉米粉加豆粉為15g/L，CaCO3含量為3g/L的情況下，分別將豆粉的含量變?yōu)?(多加玉米粉3g/L)、3、6、9g/L4種含量。接種按實例配制的固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，最后比較每克干物質(zhì)的產(chǎn)孢量。
表11不同豆粉含量培養(yǎng)基的百日草鏈格孢菌孢子產(chǎn)量(106/g*)培養(yǎng)基中豆粉含量 0g/L 3g/L 6g/L 9g/L平均產(chǎn)孢量22.12±1.034a 17.08±1.560b 16.12±0.225b 5.36±0.149c注*為每克干物質(zhì)，數(shù)據(jù)后跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表11結(jié)果表明，液體培養(yǎng)基豆粉含量增大，即氮含量增大，固體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量顯著下降。因此，為增大固體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，在配制液體培養(yǎng)基時要控制其中的氮含量。
采用本發(fā)明上述方法培養(yǎng)其他生物除草劑如利用炭疽菌、鏈格孢等真菌能夠達(dá)到同樣的效果，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。
權(quán)利要求
1.一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，采用液體-固體聯(lián)合發(fā)酵的方法，其具體工藝流程如下將生物除草劑真菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，在15-30℃條件下，培養(yǎng)5-7d，獲得一級種菌后；切取一級種菌培養(yǎng)物小塊，接種到液體培養(yǎng)基中，15-35℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)3-10d，振搖速度為20-180轉(zhuǎn)/min，待菌絲團(tuán)長滿后，獲得二級液體種菌，即菌體懸浮液；固體培養(yǎng)基由麥麩或米糠和其它一種、兩種或三種農(nóng)副產(chǎn)品組成，麥麩或米糠干重∶其它組分干重＝1∶0.1-9，按比例稱取固體培養(yǎng)基干料后，加入干料重的0.3-3.0倍水，拌勻滅菌；在無菌環(huán)境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養(yǎng)基上，好氣培養(yǎng)，溫度15-35℃，無菌條件下固體發(fā)酵生產(chǎn)3-8d，獲得大批量的生物除草劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，二級液體種菌最好用粉碎機(jī)粉碎獲得菌體懸浮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，上述固體培養(yǎng)的條件最好增加20W波長365nm黑光燈、日光燈或紫外光燈間隙照射。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，上述液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的農(nóng)副產(chǎn)品原料為工業(yè)下腳料的農(nóng)副基礎(chǔ)產(chǎn)品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆餅粉、玉米淀粉、豆餅粉、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農(nóng)副產(chǎn)品，以及多種樹木的鋸末屑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，其特征在于，上述液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的農(nóng)副產(chǎn)品原料為工業(yè)下腳料的農(nóng)副基礎(chǔ)產(chǎn)品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆餅粉、玉米淀粉、豆餅粉、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農(nóng)副產(chǎn)品，以及多種樹木的鋸末屑。
全文摘要
本發(fā)明為一種大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法，屬于微生物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植物保護(hù)領(lǐng)域。生物除草劑，真菌菌株膠孢炭疽菌(QZ－97a)、紫莖澤蘭鏈格孢、馬唐雙曲孢霉屬菌株以及百日草鏈格孢等通過液體－固體聯(lián)合發(fā)酵的方法可以大批量生產(chǎn)獲得。液體發(fā)酵及固體發(fā)酵的培養(yǎng)基利用的是工業(yè)下腳料的農(nóng)副基礎(chǔ)產(chǎn)品，原料來源廣泛，價格低廉。適宜的起始含水量，有助于菌體從培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞，轉(zhuǎn)化率高。固體發(fā)酵的溫度范圍較寬，光照條件也很容易滿足。整個培養(yǎng)過程簡單，可操作性強(qiáng)，并不需要特殊的設(shè)備，是一種簡便大批量生產(chǎn)生物除草劑的方法。
文檔編號A01N63/00GK1486613SQ0313232
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月14日
發(fā)明者強(qiáng)勝, 朱秦, 朱云枝, 徐春鳳, 安傳福, 宋小玲, 戴寶江, 蔡建國, 強(qiáng) 勝 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司