專利名稱：快速獲得馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體地說是涉及以馬鈴薯試管薯為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)快速獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的方法。
背景技術(shù)：
在我國和世界上，馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。由于馬鈴薯為同源四倍體無性繁殖作物，其基因分離復(fù)雜、隱性基因表現(xiàn)頻率較低、花粉常常出現(xiàn)不育、雜交結(jié)實(shí)較難，通過常規(guī)育種方法進(jìn)行改良耗時(shí)較長，且難度較大。因此，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯的遺傳改良具有重要的意義。
在本發(fā)明做出以前，馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化主要是通過農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)法而實(shí)現(xiàn)的。自從證明馬鈴薯對農(nóng)桿菌侵染比較敏感之后，已有許多實(shí)驗(yàn)表明用農(nóng)桿菌侵染能夠得到正常的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已日趨成熟，以馬鈴薯莖段、葉片、塊莖、微型薯、下胚軸、子葉、愈傷組織和試管薯為受體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化均已獲得成功。但農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化仍存在以下問題有待解決如轉(zhuǎn)化程序復(fù)雜，即先經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷組織，再誘導(dǎo)分化，分化芽后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根(De Block M，Theor Appl Genet，1988，76767-774)；基因型的限制，不同品種間轉(zhuǎn)化頻率差別較大(Stiekema W J等，Plant Cell Rep，1988，747-50；Tavazza R，等，Plant Sci，1988，59175-181；Sheerman S和Bevan M W.Plant Cell Rep，1988，713-16；Wenzler H等，Plant Science，1989，6379-85)；轉(zhuǎn)化頻率較低，大多數(shù)低于20％(Ishida B K等，Plant Cell Rep，1989，8325-328；Visser R G F等，Plant Mol Biol，1989，12329-337)；周期較長，一般為5-8周(Beaujean A等，Journal of Experimental Bot，1998，491589-1595；Trujillo C等，Plant Cell Rep，2001，20637-641)和非整倍體(如染色體數(shù)為47或49條)轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生(Ooms G等，Theor Appl Genet，1987，73744-750；Ishida B K，等，Plant Cell Rep，1989，8325-328)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的缺陷，以CaMV 35S啟動(dòng)子和馬鈴薯塊莖特異蛋白class I patatin基因SK24-1(謝從華等，GenBank accessionAF498099)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBSAP為轉(zhuǎn)化載體，建立一種快速獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明以馬鈴薯試管薯為轉(zhuǎn)基因的受體，該試管薯的快速繁殖技術(shù)已經(jīng)由本申請的主要發(fā)明人柳俊和謝從華于2002年10月11日提出了一項(xiàng)發(fā)明專利申請“一種高效生產(chǎn)馬鈴薯試管薯的方法及其培養(yǎng)盒”(專利申請?zhí)枮?2131125.0)。利用該發(fā)明能夠在短期內(nèi)誘導(dǎo)任何能結(jié)薯的馬鈴薯獲得大量的試管薯，從而為建立馬鈴薯試管薯高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。更進(jìn)一步地以下的描述詳細(xì)地公開本發(fā)明創(chuàng)造，本發(fā)明的要點(diǎn)是一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯試管薯遺傳轉(zhuǎn)化方法。其特征在于A、以馬鈴薯試管薯為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生；B、將所述的外植體與所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，將目的基因pBSAP導(dǎo)入馬鈴薯受體；C、所述的馬鈴薯受體不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)步驟直接轉(zhuǎn)入固體分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)出抗性芽；D、將所述的抗性芽轉(zhuǎn)入選擇性生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長出正常的根，獲得馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株；E、借助PCR、PCR--Southern和Northern雜交方法鑒別轉(zhuǎn)基因植株，最終獲得完整的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。
上述外植體是指將所述的馬鈴薯試管薯切成一定厚度的薄片，先將該薄片置于所述的農(nóng)桿菌菌液中浸染，再將浸染后的薄片轉(zhuǎn)入所述的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該固體培養(yǎng)基按以下配制MS基本培養(yǎng)基附加1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、0.5mg/L 6-芐基氨基嘌呤(BA)和1-3mg/L玉米素(ZR)、30g/L蔗糖，pH＝5.8。
以上所述的最佳固體培養(yǎng)基按以下配比配制MS基本培養(yǎng)基附加1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、0.5mg/L6-芐基氨基嘌呤(BA)和2mg/L玉米素(ZR)、30g/L蔗糖，pH＝5.8。
所述的培養(yǎng)條件如下在28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到如上所述的培養(yǎng)基附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、溫度23±1℃下培養(yǎng)，至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，進(jìn)一步培育成完整的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。
具體操作步驟如下將含有表達(dá)載體pBSAP的農(nóng)桿菌LBA4404接種于附加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB(Sambrook J等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)培養(yǎng)基中，于28℃、240r/min搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5左右。然后于5000r/min離心6分鐘，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。將馬鈴薯試管薯切成1-2mm厚的小圓片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入MS附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、2mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH＝5.8的固體分化培養(yǎng)基中，于28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的同種培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、溫度23±1℃下培養(yǎng)。至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇性生根培養(yǎng)基上，10天后長出正常的根。從而獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株。
轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR、PCR-Southern雜交檢測按Edwards K等(Nucl Acids Res，1991，191349)報(bào)道的方法從轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中提取植物總DNA。用轉(zhuǎn)化植株的總DNA為模板，未轉(zhuǎn)化植株作為負(fù)對照，以nptII基因的兩個(gè)引物5-GCTATGACTGGGCACAACAG-3和5-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃，3分鐘；94℃，45秒，50℃，45秒，72℃，1分鐘，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為676bp。PCR產(chǎn)物電泳后轉(zhuǎn)至尼龍膜，質(zhì)粒pBSAP PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳回收的676bp片段，經(jīng)地高辛(DIG)標(biāo)記后作為探針進(jìn)行雜交。采用Roche公司生產(chǎn)的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記、膜雜交和顯色處理。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。
轉(zhuǎn)基因植株Northern雜交檢測用異硫氰酸胍法(Chomczynski P等，Anal Biochem，1987，162156-159)抽提轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和對照的總RNA，以DIG標(biāo)記的反義patatin mRNA探針與總RNA雜交。探針標(biāo)記、Northern雜交及檢測采用Roche公司生產(chǎn)的DIG Northern雜交及檢測試劑盒。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。
本發(fā)明的效果是應(yīng)用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對大多數(shù)馬鈴薯四倍體栽培品種和二倍體種可在3-4周(個(gè)別材料為5周)內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株，對基因型的依賴性較小，不同基因型之間差異較小，轉(zhuǎn)化周期短(一般為3-4周)，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)40％以上，比目前利用馬鈴薯葉片、莖段和塊莖等其它外植體的轉(zhuǎn)化頻率提高了20％以上。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化步驟簡單，植株再生不需經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)步驟(沒有傳統(tǒng)的脫分化過程)，從試管薯薄片上可直接再生小芽。即一步培養(yǎng)法可獲得轉(zhuǎn)基因植株。這樣不僅縮短了成株的培養(yǎng)時(shí)間，而且也節(jié)約了培養(yǎng)成本。本發(fā)明的效果再現(xiàn)性(重復(fù)性)好，經(jīng)過分子生物學(xué)和遺傳性檢驗(yàn)，在轉(zhuǎn)基因植株中檢測不到染色體數(shù)目的其他變異。表1顯示了兩個(gè)馬鈴薯四倍體栽培品種“鄂馬鈴薯3號(hào)”和“甘農(nóng)薯2號(hào)”在四種植株再生培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化頻率的比較，其中以培養(yǎng)基編號(hào)為SRM3的轉(zhuǎn)化頻率最高。
表1“鄂馬鈴薯3號(hào)”和“甘農(nóng)薯2號(hào)”在不同培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化頻率培養(yǎng)基1)接種外植體數(shù)(塊)2)再生芽的外植體數(shù)(塊) 轉(zhuǎn)化頻率(％)3)G2E3 G2 E3G2E3SRM1 8472 40 4.6 0.0SRM2 100 82 22 1022.0 11.9SRM3 7590 33 4143.9 45.5SRM4 9792 28 3228.4 34.3注1)培養(yǎng)基組成如下SRM1為MS培養(yǎng)基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、30g/L蔗糖，pH5.8。SRM2為MS培養(yǎng)基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、1mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH5.8。SRM3為MS培養(yǎng)基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/LBA、2mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH5.8。SRM4為MS培養(yǎng)基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、3mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH5.8。
2)G2和E3分別代表馬鈴薯品種“甘農(nóng)薯2號(hào)”和“鄂馬鈴薯3號(hào)”。
3)轉(zhuǎn)化頻率為3周后能產(chǎn)生卡那霉素抗性芽的外植體數(shù)占接種的總外植體數(shù)的百分?jǐn)?shù)。
附圖及其說明


圖1是本發(fā)明方法中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯試管薯轉(zhuǎn)基因流程圖；圖2是本發(fā)明中馬鈴薯栽培品種“鄂馬鈴薯3號(hào)”轉(zhuǎn)基因試管薯薄片在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上直接再生小芽的情形；圖3是本發(fā)明中馬鈴薯栽培品種“鄂馬鈴薯3號(hào)”轉(zhuǎn)基因植株在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上生根。圖中數(shù)字1表示未轉(zhuǎn)基因的對照“鄂馬鈴薯3號(hào)”；數(shù)字2-5表示4個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯單株的特征；
圖4是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因“鄂馬鈴薯3號(hào)”植株的PCR檢測。圖中數(shù)字1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA markerΦX174 Hae III digest(TaKaRa)；數(shù)字2表示質(zhì)粒陽性對照；數(shù)字3表示未轉(zhuǎn)基因植株的陰性對照；數(shù)字4-13表示10個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯單株；圖5是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因“鄂馬鈴薯3號(hào)”植株P(guān)CR-Southern雜交檢測。圖中數(shù)字1表示質(zhì)粒陽性對照；數(shù)字2表示未轉(zhuǎn)基因的陰性對照；數(shù)字3-10表示8個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯單株。
圖6“鄂馬鈴薯3號(hào)”轉(zhuǎn)基因植株Northern雜交檢測。圖中數(shù)字1表示未轉(zhuǎn)基因的陰性對照；數(shù)字2-9表示8個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯單株。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將含有表達(dá)載體pBSAP的農(nóng)桿菌LBA4404接種于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培養(yǎng)基中，于28℃、240r/min搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5左右。然后于5000r/min離心6分鐘，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。在無菌條件下將馬鈴薯四倍體栽培品種“鄂馬鈴薯3號(hào)”試管薯切成1-2mm厚的小圓片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入編號(hào)為SRM3的固體分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成及配比如下MS培養(yǎng)基大量成分和微量成分，附加1mg/L IAA、0.2mg/L GA3、0.5mg/L BA、2mg/L玉米素、30g/L蔗糖，pH＝5.8。于28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的同種培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3周，從塊莖薄片上開始直接再生出抗性小芽(如圖2所示)。至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇性生根培養(yǎng)基上，10天后長出正常的根(如圖3所示)。共接種90塊外植體，產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)為41塊，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)45.5％。以抗性植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~片的總DNA為模板，npt II基因的兩個(gè)特異引物5-GCTATGACTGGGCACAACAG-3和5-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到676bp的特異性擴(kuò)增條帶，而未轉(zhuǎn)化的植株中無該片段的產(chǎn)生(如圖4所示)。為了進(jìn)一步鑒定PCR產(chǎn)物是否為676bp的nptII基因片段，排除假陽性的存在，將PCR產(chǎn)物電泳轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Southern雜交，以質(zhì)粒正對照擴(kuò)增產(chǎn)物回收的片段作為探針，結(jié)果表明產(chǎn)物確實(shí)是目的基因片段(如圖5所示)，從而證明此反義class I patatin基因SK24-1已成功地整合到馬鈴薯基因組中。Northern雜交分析表明此反義class I patatin基因SK24-1在轉(zhuǎn)基因植株中已正常轉(zhuǎn)錄(如圖6所示)。
實(shí)施例2將含有表達(dá)載體pBSAP的農(nóng)桿菌LBA4404接種于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培養(yǎng)基中，于28℃、240r/min搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5左右。然后于5000r/min離心6分鐘，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。在無菌條件下將馬鈴薯四倍體栽培品種“甘農(nóng)薯2號(hào)”試管薯切成1-2mm厚的小圓片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入編號(hào)為SRM3(見實(shí)例1)的固體分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成及配比、蔗糖濃度和pH與實(shí)施1所述相同。于28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的同種培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培養(yǎng)。至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇性生根培養(yǎng)基上，10天后長出正常的根。共接種75塊外植體，產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)為33塊，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)43.9％。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、PCR-Southern blot和Northern雜交與實(shí)施例1所述結(jié)果相同。
實(shí)施例3將含有表達(dá)載體pBSAP的農(nóng)桿菌LBA4404接種于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培養(yǎng)基中，于28℃、240r/min搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5左右。然后于5000r/min離心6分鐘，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。在無菌條件下將馬鈴薯四倍體栽培品種“N552”試管薯切成1-2mm厚的小圓片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入編號(hào)為SRM3(見實(shí)例1)的固體分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成及配比、蔗糖濃度和pH與實(shí)施1所述相同。于28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的同種培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培養(yǎng)。至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇性生根培養(yǎng)基上，10天后長出正常的根。共接種101塊外植體，產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)為41塊，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)40.6％。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、PCR-Southern blot和Northern雜交與實(shí)施例1所述結(jié)果相同。
實(shí)施例4將含有表達(dá)載體pBSAP的農(nóng)桿菌LBA4404接種于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培養(yǎng)基中，于28℃、240r/min搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5左右。然后于5000r/min離心6分鐘，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。在無菌條件下將馬鈴薯二倍體品系“81-15”試管薯切成1-2mm厚的小圓片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入編號(hào)為SRM3(見實(shí)例1)的固體分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成及配比、蔗糖濃度和pH與實(shí)施1所述相同。于28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的同種培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培養(yǎng)。至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇性生根培養(yǎng)基上，10天后長出正常的根。共接種89塊外植體，產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)為41塊，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)41.6％。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、PCR-Southern blot和Northern雜交與實(shí)施例1所述結(jié)果相同。
實(shí)施例5將含有表達(dá)載體pBSAP的農(nóng)桿菌LBA4404接種于加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培養(yǎng)基中，于28℃、240r/min搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5左右。然后于5000r/min離心6分鐘，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。在無菌條件下將馬鈴薯二倍體品系“3*”試管薯切成1-2mm厚的小圓片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入編號(hào)為SRM3(見實(shí)例1)的固體分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成及配比、蔗糖濃度和pH與實(shí)施1所述相同。于28℃暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的同種培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、23±1℃下培養(yǎng)。至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇性生根培養(yǎng)基上，10天后長出正常的根。共接種85塊外植體，產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)為35塊，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)41.2％。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、PCR-Southern blot和Northern雜交與實(shí)施例1所述結(jié)果相同。
表2 不同馬鈴薯品種在編號(hào)為SRM31)培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化頻率品種(品系) 倍性 接種外植體數(shù)(個(gè)) 再生芽的外植體數(shù)(個(gè)) 轉(zhuǎn)化頻率名稱 (％)1)鄂馬鈴薯3號(hào)四倍體9041 45.5甘農(nóng)薯2號(hào) 四倍體7533 43.9N552 四倍體101 41 40.681-15 二倍體8941 41.63#二倍體8535 41.2注表中SRM3培養(yǎng)基的成分同表1中1)所描述的SRM3培養(yǎng)基成分相同。
權(quán)利要求
1.一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯試管薯遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于A、以馬鈴薯試管薯為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生；B、將所述的外植體與所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，將目的基因pBSAP導(dǎo)入馬鈴薯受體；C、所述的馬鈴薯受體不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)步驟直接轉(zhuǎn)入固體分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)出抗性芽；D、將所述的抗性芽轉(zhuǎn)入選擇性生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長出正常的根，獲得馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株；E、借助PCR、PCR--Southern和Northern雜交方法鑒別轉(zhuǎn)基因植株，最終獲得完整的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上述外植體是指將所述的馬鈴薯試管薯切成一定厚度的薄片，先將該薄片置于所述的農(nóng)桿菌菌液中浸染，再將浸染后的薄片轉(zhuǎn)入所述的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該固體培養(yǎng)基按以下配制MS基本培養(yǎng)基附加1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、0.5mg/L 6-芐基氨基嘌呤(BA)和1-3mg/L玉米素(ZR)、30g/L蔗糖，pH＝5.8。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)條件如下在282暗培養(yǎng)2天。然后再轉(zhuǎn)移到如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基附加75mg/L卡那霉素和400mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度2000lx、光周期16h/d、溫度23±1℃下培養(yǎng)，至抗性芽長出達(dá)1cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基附加50mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，進(jìn)一步培育成完整的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基按以下配制MS基本培養(yǎng)基附加1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、0.5mg/L 6-芐基氨基嘌呤(BA)和2mg/L玉米素(ZR)、30g/L蔗糖，pH＝5.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯試管薯遺傳轉(zhuǎn)化方法。其特征是以馬鈴薯試管薯為外植體，通過農(nóng)桿菌浸染、培養(yǎng)，將目的基因?qū)腭R鈴薯受體，不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)步驟直接轉(zhuǎn)入固體分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)出抗性芽，再轉(zhuǎn)入選擇性生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)長出正常的根，獲得馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株。借助PCR、PCR－Southern和Northern雜交的方法鑒別轉(zhuǎn)基因植株，最終獲得完整的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。本發(fā)明轉(zhuǎn)化步驟簡單，對基因型的依賴性較小，轉(zhuǎn)化周期短，重復(fù)性好。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)40％以上，與利用葉片、莖段和塊莖等其它外植體轉(zhuǎn)化的馬鈴薯相比，其轉(zhuǎn)化頻率提高了20％以上。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1519324SQ03118508
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月23日
發(fā)明者謝從華, 柳俊, 司懷軍 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)