專利名稱：狐米草低能重離子輻射誘變育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用低能重離子輻射誘變選育狐米草優(yōu)質(zhì)新品系的方法。
狐米草在中國引種始于上世紀(jì)80年代，國內(nèi)品種單一，且至今沒有其遺傳育種方面的報(bào)道。以往離子束輻射誘變育種的報(bào)道都集中在作物種子和微生物，而未見于植物胚性愈傷組織。美國特拉華大學(xué)的鹽生植物生物技術(shù)中心，首次進(jìn)行了狐米草組織培養(yǎng)方面的研究，并發(fā)表論文一篇(Xianggan Li et al.，1995.Plantregeneration from callus cultures of salt marsh hay，Spartina patens，and itscellular-based salt tolerance.Aquatic botany 51，103-113)，但未報(bào)道其再生效率。本方法發(fā)明人及合作者也曾就狐米草組織培養(yǎng)發(fā)表兩篇文章(蔡小寧等，2000.狐米草離體培養(yǎng)植株再生.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)16(3)，143-147；Zhou Lu et al.，2003.Effect of brassinolide on callus growth and regeneration in Spartina patens(Poaceae).Plant cell，tissueand organ culture 73，87-89)，并申請了實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模生產(chǎn)狐米草再生苗的技術(shù)專利(專利號00112526.5)。但所有工作均未涉及狐米草遺傳改良和新優(yōu)品系的篩選，而且所用組織培養(yǎng)技術(shù)操作復(fù)雜、試劑浪費(fèi)。
本項(xiàng)工作的關(guān)鍵是從大量愈傷組織中獲得胚性個(gè)體。在光照條件下，部分組織(5％左右)在生長初期出現(xiàn)綠色顆粒，立即將其與周圍白色組織小心分離并單獨(dú)培養(yǎng)，在以后一個(gè)月內(nèi)，一發(fā)現(xiàn)白色組織，即立刻切除。兩個(gè)月后，將其它并未轉(zhuǎn)綠的組織塊全部清除。
綠色致密組織即胚性愈傷組織，在新的激素配比下繼代，每月更換一次培養(yǎng)基，材料即以1∶8的比例迅速擴(kuò)繁。
本方法中所用愈傷組織誘導(dǎo)與胚性材料繼代培養(yǎng)基的基本成分均為MS基本元素(Sigma成品)4.6g/L+蔗糖30g/L+Phytagel瓊脂糖2g/L激素配比分別為誘導(dǎo)培養(yǎng)基2，4-D2.0mg/L+IAA 1.0mg/L繼代培養(yǎng)基NAA 1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L+BA 0.5mg/L2.低能重離子輻射將胚性愈傷組織從繼代培養(yǎng)基上取出，在2％滅菌的DMSO水溶液中浸泡45min，在超凈工作室內(nèi)晾去表面水跡，之后放入離子束注入機(jī)靶室中。以能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻射材料。注入機(jī)每工作10s，間息10s。注入前靶室須抽真空。輻射后的材料重新接到繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)3個(gè)月，約27.4％的組織能夠存活。
3.組織分化與幼苗的生長將輻射后恢復(fù)生長的胚性愈傷組織接入芽分化培養(yǎng)基，待幼芽長至4cm高以上時(shí)將其從組織塊上切下，接入根分化培養(yǎng)基。剩余的組織塊可繼續(xù)誘導(dǎo)新芽。本方法中采用的芽分化培養(yǎng)基基本成分同前，激素為BA 3mg/L；根分化培養(yǎng)基基本成分改為2.3g/L+蔗糖15g/L+Phytagel瓊脂糖2g/L，不另加激素。
當(dāng)根長至1cm以上時(shí)，即可將幼苗移栽到氣候可人工控制的封閉溫室中。苗床基質(zhì)以鋸木屑與碳渣(10∶1)為主。幼苗栽種密度為15株/m2。以人工方式每周澆灌一次改進(jìn)的Hoagland營養(yǎng)液或人工海水，平時(shí)以自動(dòng)滴灌自來水保持基質(zhì)濕潤。
溫室中夏季(6～8月)日最高溫平均34.5℃，日最高光照強(qiáng)度平均583.9μmols-1m-2；冬季(12～2月)日最低溫平均5.7℃，日最高光照強(qiáng)度平均217.5μmols-1m-2；年平均濕度72.7％。
改進(jìn)的Hoagland營養(yǎng)液和人工海水配方為

運(yùn)用本方法，每塊反綠的胚性愈傷組織可以分化出3～4批幼苗，共計(jì)30株左右。幼苗在苗床上成活率達(dá)95％以上。
4.植株品質(zhì)性狀比較與DNA檢測在苗床上生長3個(gè)月以后，分別測定每株再生苗的株高、節(jié)間距、葉長、葉寬、莖粗、分蘗數(shù)、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比、粗蛋白含量等品質(zhì)性狀指標(biāo)，并用單因素方差分析與未經(jīng)輻射愈傷組織形成的原始再生苗相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行對照。對發(fā)生正向變異的樣本標(biāo)記，用CTAB法提取DNA，用Operon引物A18，A10，A4，A3，Bi0，C2，C11，D7對每個(gè)標(biāo)記樣本進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，比較DNA變異情況。
經(jīng)過本方法中N+輻射處理后，約73.7％的再生植株能檢測到品質(zhì)指標(biāo)的差異，其中正向變異占1/3。在出現(xiàn)正向變異的樣本中又有64.9％左右的植株發(fā)生DNA的變異(約占總數(shù)的15.1％)。
5.將品質(zhì)明顯改良并且DNA也發(fā)生變異的植株移栽入新的苗床，作為新的種質(zhì)資源保存。本發(fā)明的效果在于1)首次建立了一套完整的狐米草誘變育種程序。2)在愈傷組織繼代中，白色非胚性組織被徹底剔除。已有實(shí)驗(yàn)證明占據(jù)多數(shù)的白色組織分化再生能力極差，基本沒有利用價(jià)值。僅擴(kuò)繁綠色胚性組織可以大大節(jié)省勞動(dòng)力和試劑，且因綠色組織不存在粘液化、褐化等問題，有利于操作簡單化。較以往培養(yǎng)基配方，在繼代培養(yǎng)基中省去了椰子汁，在芽分化培養(yǎng)基中省去了IAA，在根分化培養(yǎng)基中省去了全部激素和活性炭，且基本元素和蔗糖也減少了一半。改變后的配方對胚性愈傷組織生長沒有影響，但可以簡化操作和節(jié)省試劑。3)將植物胚性愈傷組織作為低能重離子輻射的受體，該材料分裂旺盛，對輻射較休眠的種子更加敏感，容易產(chǎn)生突變。4)再生苗栽種于相對封閉的溫室中，光照、氣溫、濕度等氣候因子可人工控制，可盡量減少環(huán)境因子對植株生長發(fā)育的影響。5)能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻射對狐米草胚性愈傷組織誘變突變率很高，同時(shí)通過將再生苗各品質(zhì)性狀進(jìn)行量化比較，容易發(fā)現(xiàn)細(xì)微的差異，能夠?yàn)楹撞葸z傳育種準(zhǔn)備大量突變材料。
本項(xiàng)發(fā)明能夠在較短時(shí)間內(nèi)為濱海灘涂牧場建設(shè)和濕地恢復(fù)提供優(yōu)良種質(zhì)資源。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1.取狐米草種子100顆，切除非胚端后萌發(fā)，共獲得61株幼苗。取無菌幼苗莖基部在含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、2，4-D2.0mg/L、IAA1.0mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，并從中分離出綠色胚性組織4份，放入含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、NAA 1.0mg/L、2，4-D0.5mg/L、BA0.5mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。擴(kuò)繁到一定數(shù)量后，從中選出20塊組織浸入2％DMSO溶液45min，晾去表面水跡后施以能量為20KeV，劑量為10.4×1015ions cm-2的N+輻射?；謴?fù)培養(yǎng)3個(gè)月后，6塊組織存活。將之轉(zhuǎn)入含MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、BA3mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的芽分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽，再將芽切下，轉(zhuǎn)到含MS基本元素2.3g/L、蔗糖15g/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的根分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出根?？傆?jì)獲得再生苗150多株。在南京大學(xué)智能溫室中生長3個(gè)月后進(jìn)行品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)有92株出現(xiàn)了一項(xiàng)或多項(xiàng)指標(biāo)變異，其中正向變異樣本29株，而正向變異樣本中又有19個(gè)樣本出現(xiàn)了DNA變異。其中有一株在株高、節(jié)間距、葉長、葉寬、莖粗、分蘗數(shù)、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比與原始狐米草均無明顯差異，但粗蛋白含量高達(dá)6.5％(鮮重比)，為原始狐米草的1.8倍，原始狐米草對應(yīng)引物C11擴(kuò)增產(chǎn)物中250bp的片段在該株中消失，說明已發(fā)生了遺傳學(xué)上的變異。該株系因營養(yǎng)價(jià)值明顯提高而被認(rèn)為是一個(gè)適合灘涂牧場建設(shè)的優(yōu)質(zhì)新品系，并保存在南京大學(xué)溫室中。實(shí)例2.取狐米草種子100顆，切除非胚端后萌發(fā)，共獲得78株幼苗。取無菌幼苗莖基部在含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、2，4-D2.0mg/L、IAA1.0mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，并從中分離出綠色胚性組織6份，放入含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、NAA1.0mg/L、2，4-D0.5mg/L、BA0.5mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。擴(kuò)繁到一定數(shù)量后，從中選出30塊組織浸入2％DMSO溶液45min，晾去表面水跡后施以能量為20KeV，劑量為10.4×1015ions cm-2的N+輻射。恢復(fù)培養(yǎng)3個(gè)月后，8塊組織存活。將之轉(zhuǎn)入含MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、BA3mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的芽分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽，再將芽切下，轉(zhuǎn)到含MS基本元素2.3g/L、蔗糖15g/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的根分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出根。總計(jì)獲得再生苗200多株。在南京大學(xué)智能溫室中生長3個(gè)月后進(jìn)行品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)有152株出現(xiàn)了一項(xiàng)或多項(xiàng)指標(biāo)變異，其中正向變異樣本57株，而正向變異樣本中又有28個(gè)樣本出現(xiàn)了DNA變異。其中有一株葉長、莖粗、地上/地下生物量之比無明顯變化，但株高、節(jié)間距、葉寬、分蘗數(shù)、地上生物量、地下生物量和粗蛋白含量依次為原始植株的1.7、1.5、1.3、3.1、5.4、5.9和1.4倍，引物A10對原始狐米草的擴(kuò)增產(chǎn)物中1200bp和700bp兩個(gè)片段在該株系中同時(shí)消失。該新品系由于植株高大健壯容易建群而被認(rèn)為適合于灘涂濕地恢復(fù)，并也作為新優(yōu)品系保存在南京大學(xué)溫室中。
權(quán)利要求
1.一種狐米草誘變育種的方法，其特征是利用能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻照狐米草胚性愈傷組織，誘導(dǎo)胚性細(xì)胞產(chǎn)生突變，在分化形成的再生苗中，篩選品質(zhì)性狀改良并且遺傳物質(zhì)已經(jīng)發(fā)生改變，能夠穩(wěn)定遺傳的新優(yōu)品系，其技術(shù)方法為(1)將狐米草種子非胚端切除以提高種子萌發(fā)率，在改良的繼代培養(yǎng)基上僅擴(kuò)繁狐米草胚性愈傷組織；(2)以能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻照狐米草胚性愈傷組織，誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性細(xì)胞的突變；(3)在改良的分化培養(yǎng)上，從受輻射后恢復(fù)活力的胚性愈傷組織上分化獲得再生苗，并栽種于環(huán)境相對封閉，光照、氣溫、濕度等氣候因子人為控制的溫室中；(4)檢測再生植株株高、節(jié)間距、葉長、葉寬、莖粗、分蘗數(shù)、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比以及粗蛋白含量，篩選品質(zhì)性狀改良的株系；(5)在品質(zhì)改良的株系中，用RAPD檢測DNA，篩選遺傳物質(zhì)已經(jīng)發(fā)生變異，能夠穩(wěn)定遺傳的新優(yōu)品系。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。通過低能重離子輻照狐米草胚性愈傷組織，導(dǎo)致胚性細(xì)胞遺傳物質(zhì)的突變，受輻射材料分化形成的再生苗在氣候人工控制的封閉溫室中長大后，經(jīng)過生物量、粗蛋白含量等10項(xiàng)性狀指標(biāo)的檢測，篩選出品質(zhì)明顯改良的株系，在此基礎(chǔ)上再比較DNA變異情況，最終篩選到品質(zhì)性狀明顯改善并且遺傳基礎(chǔ)已經(jīng)發(fā)生變異，能夠穩(wěn)定遺傳的優(yōu)質(zhì)新品系。為濱海灘涂牧場建設(shè)和濕地恢復(fù)提供優(yōu)良種質(zhì)資源。
文檔編號A01H1/06GK1442043SQ0311320
公開日2003年9月17日 申請日期2003年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月16日
發(fā)明者欽佩, 周長芳, 朱曉佳 申請人:南京大學(xué)