一種香蕉不定芽的化學誘變方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種香蕉不定芽的化學誘變方法，首先配置PH值3.0的磷酸鹽緩沖液，用PH值3.0的磷酸鹽緩沖液配置誘變劑疊氮化鈉溶液。選擇香蕉不定芽的第3～4代叢生不定芽切成單個不定芽，放入疊氮化鈉溶液中浸泡進行誘變，誘變后轉接到增殖培養(yǎng)基，放入無菌培養(yǎng)室進行恢復培養(yǎng)，恢復培養(yǎng)時間約20天。將恢復培養(yǎng)后存活的不定芽轉入生根培養(yǎng)基壯苗生根，生根培養(yǎng)時間約25天。將生根苗轉至育苗棚煉苗5天，然后假植沙槽壯苗生根，20天后定植于育苗杯中。當試管苗長到10片葉時，進行變異株的篩選。本發(fā)明的有益效果是對于香蕉的育種，具有誘變頻率高、范圍廣、分離快、易穩(wěn)定的特點。
【專利說明】一種香蕉不定芽的化學誘變方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農作物選育種【技術領域】，涉及一種香蕉不定芽的化學誘變方法。

【背景技術】
[0002] 香蕉（Musa spp.)是一種重要的熱帶亞熱帶水果，在我國廣東、廣西、福建、海南、 云南及臺灣等省區(qū)都有較大的栽培面積。香蕉的主栽品種絕大多數(shù)為三倍體，難以通過傳 統(tǒng)的雜交育種方式獲得優(yōu)質、高產、抗性強的優(yōu)良新品種。利用誘變育種、基因工程等技術 及多種技術相結合的方式來選育香蕉新品種成為必要。
[0003] 化學誘變具有易操作、誘變劑量易控制、對基因組損傷小、突變率高等特點，近年 來成為廣泛應用的誘變育種技術。自從Spence在1965年首先發(fā)現(xiàn)疊氮化鈉（NaN3)對大麥 的誘變作用以來，國內外的許多研究者對NaN3在農作物上的誘變作用進行了廣泛的研究， 證明NaN3是一種有效的化學誘變劑。但NaN3對香蕉不定芽的誘變鮮有報道。本試驗系統(tǒng) 研究了 NaN3對香蕉不定芽的誘變及其誘變效果，為香蕉的選育種工作提供依據(jù)。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種香蕉不定芽的化學誘變方法，本發(fā)明的有益效果是對 于香蕉的育種，具有誘變頻率高、范圍廣、分離快、易穩(wěn)定的特點。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術方案是按照以下步驟進行：
[0006] 步驟1 :配置PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液；
[0007] 甲液：取濃磷酸4. 2ml，加水IOOOml溶解搖勻；
[0008] 乙液：稱磷酸氫二鈉17. 9g，加水IOOOml溶解搖勻；
[0009] 取甲液IOOOml與乙液IOOOml混合，即甲液：乙液=1 :1混合均勻，可得PH值3.0 的磷酸鹽緩沖液。
[0010] 步驟2 :準備誘變劑疊氮化鈉溶液；
[0011] 1、用PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液配置濃度為0? 15g/L、0. 20g/L、0. 25g/L的疊氮化 鈉溶液。
[0012] 2、分別取不同濃度的疊氮化鈉溶液IlOml裝入體積為220ml的潔凈培養(yǎng)瓶中，蓋 好瓶蓋。
[0013] 3、取120ml自來水裝入體積為220ml的潔凈培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋，做為清洗用的無 菌水。
[0014] 4、將以上裝有疊氮化鈉誘變液和無菌水的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋內高溫消毒，溫 度設定為l〇5°C，時間設定為30分鐘，滅菌后取出放入無菌室冷卻備用。
[0015] 步驟3 :香蕉不定芽的誘變處理；
[0016] 1、選擇生長基本一致、健壯的巴西、農科1號、抗枯5號第3?4代叢生不定芽，在 超凈工作臺內切成單個不定芽。
[0017] 2、將切好后的單個不定芽放入不同濃度的疊氮化鈉溶液中，每瓶浸30個左右芽。 巴西的誘變處理是0. 15g/L浸泡3h，或者0. 20g/L浸泡2h ;農科1號、抗枯5號的誘變處理 是0. 15g/L浸泡3h，或者0. 25g/L浸泡2h。
[0018] 3、每隔15分鐘左右晃動培養(yǎng)瓶一次，使不定芽浸泡均勻。
[0019] 4、時間到后，將浸泡后的不定芽放入消毒后的無菌水中清洗3遍。
[0020] 5、將清洗后的不定芽轉接到增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 3mg/L+NAA 0? 3mg/L+Ad 5mg/ L+蔗糖30g/L，PH5. 8)上，每瓶接種5?6個芽。
[0021] 6、將誘變后的不定芽放入無菌培養(yǎng)室進行恢復培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，光照強度 lOOOlx，每日光照8h，恢復培養(yǎng)時間約20天。
[0022] 步驟4 :香蕉不定芽誘變后的生根培養(yǎng)；
[0023] 將恢復培養(yǎng)后存活的不定芽轉入生根培養(yǎng)基（1/2MS+IBA 1.0mg/L+NAA0.2mg/ L+蔗糖30g/L+碳粉2g/L，PH5. 8)，放入無菌培養(yǎng)室壯苗生根，培養(yǎng)溫度28°C，光照強度 20001x，每日光照12h，生根培養(yǎng)時間約25天。
[0024] 步驟5 :生根苗的移栽和管理；
[0025] 1、將生根苗（瓶苗）轉至育苗棚煉苗5天。
[0026] 2、練苗結束后，將生根苗從瓶中取出，用清水將苗根部附著的培養(yǎng)基清洗干凈。
[0027] 3、將清洗后的生根苗移栽到沙槽進行假植壯苗生根。
[0028] 4、約20天后將假植苗定植于規(guī)格為12cmX IOcm育苗杯中。
[0029] 5、加強肥水管理和病蟲害防治。
[0030] 步驟6 :誘變后變異株的篩選
[0031] 當試管苗長到10片葉時，進行變異株的篩選。從誘變后的試管苗群體中篩選高大 型、矮化型、畸葉型、花葉型、窄葉型、密節(jié)型、青桿型等變異株。變異株性狀特征主要表現(xiàn)如 下：
[0032] 正常株：植株生長正常，葉片輪生，節(jié)間距均勻適中，葉片綠色。
[0033] 高大型：生長速度較快，植株較高、粗壯，葉片節(jié)間距較大。
[0034] 矮化型：植株較矮、粗壯，葉柄短，葉片密生，葉片較厚，葉色較濃綠。
[0035] 畸葉型：在葉片中間出現(xiàn)一些變異的小葉片，或葉片生長不正常。
[0036] 花葉型：葉片出現(xiàn)黃白色條紋、缺綠斑塊，或不均勻分布花紋。
[0037] 窄葉型：葉片較窄，葉片較少且薄，部分葉片葉脈兩側不對稱，假莖較細。
[0038] 密節(jié)型：葉片節(jié)間距很短，葉片密集在植株頂部，葉柄較短。
[0039] 青桿型：假莖淺綠色或黃綠色，葉片多且薄，葉色淡綠，植株較脆弱，易折斷。

【具體實施方式】
[0040] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0041] 一、材料與方法
[0042] (一）實驗材料
[0043] 以香蕉品種巴西、農科1號、抗枯5號為材料，材料來源于東堯市香蕉蔬菜研究所 建立的香蕉種質資源圃。
[0044] (二）實驗方法
[0045] 從資源圃中挖取性狀優(yōu)良、長勢健壯的香蕉吸芽苗，切取生長點消毒后建立外植 體。將外植體接種于誘導培養(yǎng)基誘導不定芽的分化，分化的不定芽轉移到增殖培養(yǎng)基進行 擴繁，經3?4代繼代增殖培養(yǎng)后獲得大量不定芽，選擇大小一致的不定芽進行化學誘變處 理。用適宜誘變濃度誘變后的巴西不定芽接種于增殖培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)1代，轉入生根培養(yǎng) 基生根培養(yǎng)，然后移栽到育苗杯進行變異情況調查。
[0046] 1、外植體的建立
[0047] 將資源圃選取的帶劍葉的優(yōu)良吸芽帶回實驗室，用刀削去葉片和部分假莖，只留 帶生長點的8?IOcm長的莖段，剝去外部葉鞘，最后只留帶生長點的2?3cm長作為外植 體材料。接著用75%的酒精泡lmin，取出用滅菌后的無菌水清洗1遍，用0. 1 %次氯酸鈉處 理20min，無菌水清洗3次。在無菌碟中用手術刀將材料進一步修整，削去褐變外圍，使假 莖部分保留0.5cm左右，球莖部分保留Icm左右。然后將外植體接種于誘導培養(yǎng)基（MS+Ad 5mg/L+蔗糖30g/L，PH5. 8)。培養(yǎng)溫度為26°C，暗培養(yǎng)。30天左右腋芽從葉鞘基部長出，即 獲得第1代不定芽。
[0048] 2、增殖培養(yǎng)
[0049] 將獲得的第1代不定芽切出，接種于增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 3mg/L+NAA0. 3mg/L+Ad 5mg/L+蔗糖30g/L，PH5. 8)，15d左右繼代1次，如此可使不定芽獲得不斷的分化增殖。培 養(yǎng)溫度28°C，光照強度lOOOlx，每日光照8h。繼代3?4代，選取長勢相對一致的不定芽作 為實驗材料。
[0050] 3、化學誘變
[0051] 將繼代到3?4代的香蕉不定芽分別浸泡到不同濃度的疊氮化鈉溶液中，浸泡時 間分別為3小時和2小時，通過實驗得到香蕉不定芽誘變的適宜誘變濃度。再用適宜誘變 濃度對香蕉不定芽進行化學誘變，然后將誘變后的香蕉不定芽接種于增殖培養(yǎng)基（同上） 進行恢復培養(yǎng)。
[0052] 4、生根培養(yǎng)
[0053] 將恢復后的香蕉不定芽轉入生根培養(yǎng)基（1/2MS+IBA l.Omg/L+NAA 0.2mg/L+蔗 糖30g/L+碳粉2g/L，PH5. 8)進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28°C，光照強度為20001x，每日光 照為12h。
[0054] 5、二級苗培養(yǎng)
[0055] 將生根苗（瓶苗）轉至育苗棚煉苗5天。練苗結束后，將生根苗從瓶中取出，用清 水將苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，然后移栽到沙槽進行假植壯苗生根，約30天后將假植苗定 植于規(guī)格為12cmXl〇Cm育苗杯中。肥水管理和病蟲害防治同日常管理，當試管苗長到10 片葉時，進行變異株的觀察和調查。
[0056] (三）數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
[0057] 接種株數(shù)指接種于培養(yǎng)基上的不定芽總數(shù)，死亡株數(shù)指接種于培養(yǎng)基上死亡的不 定芽總數(shù)，分化株數(shù)接種于培養(yǎng)基上分化有不定芽的不定芽總數(shù)，有效芽數(shù)指培養(yǎng)基上有 效的不定芽總數(shù)，芽高指瓶內不定芽的平均株高，變異株數(shù)指誘變后群體高大型、矮化型、 畸葉型、花葉型、窄葉型、密節(jié)型、青桿型等不同類型變異株數(shù)的總和。調查數(shù)據(jù)使用SPSS 進行統(tǒng)計和方差分析。各指標計算公式如下。
[0058] 致死率％ =死亡株數(shù)/接種株數(shù)X 100%
[0059] 分化率％ =分化株數(shù)/接種株數(shù)X 100%
[0060] 增殖系數(shù)=有效芽數(shù)/接種株數(shù)
[0061] 變異率％ =變異株數(shù)/群體株數(shù)X 100%
[0062] 二、PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液配置方法研究
[0063] 大多數(shù)植物應用NaN3進行化學誘變時，都是將NaN3溶解于PH值3. 0的磷酸緩沖 液。因此，研究PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液的配置方法及其對香蕉組培苗的影響至關重要。
[0064] (一）PH值3. 0磷酸鹽緩沖液配制方法研究
[0065] 1、實驗方法
[0066] 通過google搜索"磷酸鹽緩沖液"關鍵詞，檢索得到PH值為2. 0的磷酸鹽緩沖液 配制方法，如下，未查到PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液配制方法。
[0067] 磷酸鹽緩沖液（PH2. 0)
[0068] 甲液：取磷酸16. 6ml，加水至1000ml，搖勻。
[0069] 乙液：取磷酸氫二鈉71. 6g，加水使溶解成1000ml。
[0070] 取上述甲液72. 5ml與乙液27. 5ml混合，搖勻，即得PH值為2. 0的磷酸鹽緩沖液。
[0071] 參考以上資料中PH2. 0磷酸鹽緩沖液配制方法，取甲液60ml分別與30ml、40ml、 50ml、55ml、60ml、65ml、70ml、80ml乙液混勻，用美國生產的IQ150便攜式PH計測定不同體 積比的混合液的PH值。
[0072] 2、試驗結果
[0073] 表1甲液和乙液不同體積比混合液的PH值
[0074]

【權利要求】
1. 一種香蕉不定芽的化學誘變方法，其特征在于，按照以下步驟進行： 步驟1 :配置PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液； 步驟2 :準備誘變劑疊氮化鈉溶液； 步驟3 :香蕉不定芽的誘變處理； 1) 選擇巴西、農科1號、抗枯5號三個品種的第3?4代叢生不定芽，在超凈工作臺內 切成單個不定芽； 2) 將切好后的單個不定芽放入疊氮化鈉溶液中進行誘變處理,每瓶浸30個芽； 3) 每隔15分鐘左右晃動培養(yǎng)瓶一次，使不定芽浸泡均勻； 4) 時間到后，將浸泡后的不定芽放入消毒后的無菌水中清洗3遍； 5) 將清洗后的不定芽轉接到增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種5?6個芽； 6) 將誘變后的不定芽放入無菌培養(yǎng)室進行恢復培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 °C，光照強度 lOOOlx，每日光照8h，恢復培養(yǎng)時間約20天； 步驟4 :香蕉不定芽誘變后的生根培養(yǎng)； 將恢復培養(yǎng)后存活的不定芽轉入生根培養(yǎng)基，放入無菌培養(yǎng)室壯苗生根，培養(yǎng)溫度 28°C，光照強度20001x，每日光照12h，生根培養(yǎng)時間約25天； 步驟5:生根苗的移栽和管理； 1) 將生根苗轉至育苗棚煉苗5天； 2) 練苗結束后，將生根苗從瓶中取出，用清水將苗根部附著的培養(yǎng)基清洗干凈； 3) 將清洗后的生根苗移栽到沙槽進行假植壯苗生根； 4) 20天后將假植苗定植于規(guī)格為12cmX 10cm育苗杯中； 步驟6 :誘變后變異株的篩選； 當試管苗長到10片葉時，進行變異株的篩選。
2. 按照權利要求1所述一種香蕉不定芽的化學誘變方法，其特征在于：所述步驟1中， 配置PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液方法為： 甲液：取濃磷酸4. 2ml，加水1000ml溶解搖勻； 乙液：稱磷酸氫二鈉17. 9g，加水1000ml溶解搖勻； 甲液：乙液=1 :1混合均勻，可得PH值3.0的磷酸鹽緩沖液。
3. 按照權利要求1所述一種香蕉不定芽的化學誘變方法，其特征在于：所述步驟2中 誘變劑疊氮化鈉溶液是用PH值3. 0的磷酸鹽緩沖液配置成的濃度為0. 15g/L、0. 20g/L、 0. 25g/L的疊氮化鈉溶液。
4. 按照權利要求1所述一種香蕉不定芽的化學誘變方法，其特征在于：所述步驟3中， 巴西的誘變處理是〇. 15g/L浸泡3h，或者0. 20g/L浸泡2h ;農科1號、抗枯5號的誘變處理 是0. 15g/L浸泡3h，或者0. 25g/L浸泡2h。
5. 按照權利要求1所述一種香蕉不定芽的化學誘變方法，其特征在于：所述步驟3中 增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA 3mg/L+NAA 0? 3mg/L+Ad 5mg/L+ 蔗糖 30g/L，PH5. 8。
6. 按照權利要求1所述一種香蕉不定芽的化學誘變方法，其特征在于：所述步驟4中 生根培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA 1. Omg/L+NAA 0? 2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 碳粉 2g/L，PH5. 8。
【文檔編號】A01G1/00GK104365474SQ201410657745
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權日:2014年11月18日
【發(fā)明者】李洪波, 呂順, 劉文清, 曾莉莎, 劉建平, 何建齊, 韓秀香, 杜彩嫻 申請人:東莞市香蕉蔬菜研究所