專利名稱：一種抗稻瘟病的藥物,其制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及吳茱萸吲哚類生物堿即N-酰基-色胺及N-?；?5-羥色胺衍生物，該生物堿在制備防治或抗稻瘟病的藥物中的應用，以及以本發(fā)明化合物為有效成份的農用抗稻瘟病藥。
背景技術：
水稻是主要的糧食作物，長期以來，稻瘟病是水稻生產的嚴重障礙之一。為了控制稻瘟病的危害，人們一方面研究水稻抗稻瘟病的機理，使植物本身獲得持久抗菌素稻瘟病特性。另一方面，人們研究和開發(fā)新型的抗稻瘟病藥物，雖然有些藥物已用于稻瘟病的防治，如有機氯殺菌劑四氯苯肽(又稱稻瘟肽)，有機磷殺菌劑O-乙基-S，S-二苯基二硫代磷酸酯(又稱敵瘟磷)均有較好的防治效果，但這些農藥在自然條件下難于降解，毒性較大，易選成嚴重的環(huán)境污染，此外，長期施用某一農藥極易選成稻瘟菌產生抗藥性，為了保護環(huán)境，保護人類以及農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展急需進行高效、低毒、低殘留的環(huán)保型農藥的研制。本發(fā)明基于研制新類型的天然活性物質，通過抗稻瘟菌活性的構效關系研究，發(fā)現了吳茱萸吲哚生物堿具有抗稻瘟菌活性，且顯著強于先導物，可作為新型的抗稻瘟菌藥物。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種抗稻瘟病的藥物，其中含有治療有效量的化合物(1)至(7)中的任一化合物所示的吳茱萸吲哚類生物堿和農藥學上可接受的載體，其制備方法，以及本發(fā)明化合物在制備防治或抗稻瘟病的藥物中的應用。

發(fā)明內容
為了實現上述目的，本發(fā)明提供了如下技術方法一種抗稻瘟病的藥物，其中含有治療有效量的化合物(1)至(7)中的任一化合物所示的吳茱萸吲哚類生物堿和藥學上可接受的載體 同時，本發(fā)明還提供了化合物(1)至(7)任一化合物在制備防治或抗稻瘟病的藥物中的應用。
進一步的，本發(fā)明提供了制備權利要求1所述的藥物的方法，取吳茱萸果實和莖葉部分，粉碎成粗粉后，用95％乙醇回流提取，回收乙醇得浸膏，以5％的酸水捏溶，過濾后的酸水溶液先用石油醚脫脂后，繼以28％的氨水堿化至PH10，繼以氯仿萃取，無水硫酸鈉干燥，回收氯仿得總堿，再用不同比例的石油醚-氯仿-甲醇和石油醚-乙酸乙酯進行反復硅膠常壓柱層析(LC)，低、中壓柱層析(LPLC、MPLC)，真空柱層析(VLC)，常壓及真空干柱層析(DCC、VDCC)，得權利要求1生物堿化合物(1)至(7)，再分別取任一化合物按常規(guī)制備藥物方法制備抗稻瘟病藥物。
在制造以本發(fā)明所述的吳茱萸吲哚類生物堿為有效成分的抗稻瘟病的藥物時，可同樣使用該技術領域中已知農藥所通用的固相、液相及乳化分散劑等各種載體。并能配制成顆粒劑、粉劑、乳化劑、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑、煙霧劑等任意的劑型。同時，在各種制劑中一般可適當添加一些輔助劑。
一般而言，各制劑中有效成分的配比在乳劑及可濕性粉劑中為10％-90％；在粉劑及油劑等中為0.1％-10％；當然，也可根據不同的使用目的而適當增減。
本發(fā)明的制劑還可與其他殺菌劑、除草劑、殺蟲劑、肥料物質、土壤改良劑等配合使用。
本發(fā)明藥物施用量可根據用藥途徑、稻瘟病的嚴重程度等變化，可以一次或多次施用。
與現在的抗稻瘟病藥相比，本發(fā)明的抗稻瘟病藥具有的優(yōu)點在于以本發(fā)明的吳茱萸生物堿為有效成份的藥劑是一種新型的農用抗稻瘟病藥。這種藥劑對于防治稻瘟病顯示出較好的效果，同時該藥具有低毒、低殘留、環(huán)境相容等特點，屬新型的生物農藥。
為了更好的理解本發(fā)明，下面結合本發(fā)明的實施例進一步來說明本發(fā)明的實質性內容，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
具體實施例方式實施例1取吳茱萸果實樣品20kg，購于藥材公司的吳茱萸干燥未成熟果實生品；另取吳茱萸的莖葉部分6.8kg，粉碎成粗粉后，用95％乙醇回流提取，回收乙醇得浸膏，以5％的酸水捏溶，過濾后的酸水溶液先用石油醚脫脂后，繼以28％的氨水堿化至PH10，繼以氯仿萃取，無水硫酸鈉干燥，回收氯仿得總堿，再用不同比例的石油醚-氯仿-甲醇和石油醚-乙酸乙酯進行反復硅膠常壓柱層析(LC)，低、中壓柱層析(LPLC、MPLC)，真空柱層析(VLC)，常壓及真空干柱層析(DCC、VDCC)，得生物堿(1)至(7)。再分別取生物堿1-7任一化合物按常規(guī)制備農藥方法得吳茱萸抗稻瘟病藥物。
通過上述制備方法制備的化學式(1)至(7)的吲哚生物堿具有極強的抗稻瘟菌活性。如羥基吳茱萸堿(2)對稻瘟菌菌株P131芽管生長半抑制濃度為0.26(μg/ml)，對稻瘟菌菌株R1528芽管生長半抑制濃度為0.17(μg/ml)，其作用強度分別是先導物N-苯甲?；返?4倍(16.6μg/ml)及119倍(20.2μg/ml)。
吳茱萸吲哚生物堿的制備實例如下實施例2吳茱萸堿化合物(1)的制備用實施例1所述的方法制備得化合物1吳茱萸堿 吳茱萸堿(Evodiamine)(化合物1)，無色針晶(氯仿-甲醇)；MS m/z304(M+1，28)，303(M+，100)，288(M+1-CH3，14)，287(M-CH3，12)，258(2)，169(67)，161(22)，143(18)，134(54)；IR(KBr)cm-13227，2942，2903，1630(C＝O)，1607，1511，1450，1280，1167，746，727；1H和13C NMR(δppm，C5D5N，見表1)。
實施例3羥基吳茱萸堿(化合物2)的制備用實施例1所述的方法制備得化合物2(羥基吳茱萸堿) 羥基吳茱萸堿(Hydroxyevodiamine)(化合物2)，黃色片晶(乙醇)，m.p.165℃變紅，195℃分解；MS m/z319(M+，77)，301(M-H2O，100)，286(M-H2O-CH3)，257(16)，186(65)，134(80)；IR(KBr)cm-13404，3270，1682(C＝O)，1664(C＝O)，1516，1484，1396，1288，1232，1204，743；1H和13C NMR(δppm，DMSO，400MHz，見表1、2)。
實施例4、14-甲?；鋮擒镙谴螇A(化合物3)的制備用實施例1所述的方法制備得式(3)化合物3(14-甲酰基二氫吳茱萸次堿) 14-甲?；鋮擒镙谴螇A(14-Formyldihydrorutaecarpine)(化合物3)，MSm/z317(M+，35)，288(63)，287(100)，169(59)，148(10)，147(5)，146(18)，119(17).；1H和13C NMR(δppm，C5D5N，400MHz，見表1、2)。
實施例5吳茱萸酰胺-I(化合物4)的制備用實施例1所述的方法制備得化合物4(吳茱萸酰胺-I)
(4)吳茱萸酰胺-I(Wuchuyuamide-I)(化合物4)，無色針晶，m.p.261-262℃(CHCl3-MeOH)，[α]D240(c 0.24，C5H5N)；UV(MeOH)λmax 246nm；IR(KBr)cm-13341(OH)，3190(NH)，1699(C＝O)，1658(r-lactam)，1616，1488(C＝C)，1358，1197，1099，898，794，755；EIMS 70ev，m/z 352(M++1，38)，351(M+，97)，335(M++1-OH)，323(M+-CO，50)，305(M+-NO2，72)，203(C11H12N2O2，63)，190(82)，177(88)，159(54)，146(C8H4NO2，100)，120(87)，105(73)，77(66)，65(28)；1H和13C NMR(δppm，C5D5N，400MHz，見表3)。
實施例6、吳茱萸酰胺-II(化合物5)的制備用實施例1所述的方法制備得化合物5(吳茱萸酰胺-II5) 吳茱萸酰胺-II(Wuchuyuamide-II)(化合物5)，無色針晶，m.p.199-200°C(CHCl3-MeOH)，[α]D240(c 0.24，CHCl3)；EIMS 70ev，m/z 335(M+，75)，203(C11H12N2O2，5)，190(50)，177(567)，159(60)，146(C8H4NO2)，133(20)，101(57)，83(15)，59(100)；UV(MeOH)λmax 247nm；IR(KBr)cm-13181(NH)，1696(C＝O)，1659(r-lactam)，1613，1487(C＝C)，1358，1338，1237，1098，894，751，737；1H和13CNMR(δppm，CDCl3，400MHz，見表3)。
實施例7吳茱萸次堿(化合物6)的制備用實施例1所述的方法制備得式化合物6(吳茱萸次堿6) 吳茱萸次堿(Rutaecarpine)(化合物6)，無色針晶(氯仿-甲醇)；MS m/z287(M+，100)，286(M-H，90)，272(2)，258(14)，144(15)，IR(KBr)cm-13344，1654(C＝O)，1600，1549，1471，1402，1328，1230；1H和13C NMR(δppm，C5D5N，500MHz，見表1、2)。
實施例8、吳茱萸次堿(化合物7)的制備用實施例1所述的方法制備得式化合物7(吳茱萸次堿7) (吳茱萸酰胺，Evodiamide)(7)，EIMS m/z 307(M+，13)，164(49)，143(36)，134(100)，130(53)；IR(KBr)cm-13341，3189，1604(C＝O)，1578，1518，1403，1296，1234，1125，747；1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.67(3H，d，J＝7.2Hz，NHMe)，2.90(3H，br.s，NHMe)，3.16(2H，m，H-8)，3.50(2H，m，H-7)，5.04(1H，br.s，14-H)，6.57(1H，d，J＝8.4Hz，H-9)，6.90(1H，d，J＝6.0Hz，H-3)，7.01-7.30(6H，m，2，4，10，11，12，H-13a)，10.80(1H，s，H-13)；13C NMR(δppm，DMSO，100MHz，見表1、2)。
表1 生物堿(1)、(2)、(3)、(6)、(7)的13C化學位移(δ，ppm，DMSO)C 1 23a6a71 118.1d110.9d117.5d125.0d 110.1d2 133.3d133.5d136.1d133.2d 129.9d3 127.4d114.2d129.5d126.1d 115.1d4 127.3d131.4d134.3d126.1d 127.0d4a 119.2s117.0s127.9s120.9s 121.2s5 164.1s174.7s164.5s160.4s 169.7s7 39.5t 46.9t 44.9t 40.3t-8 19.4t 20.5t 20.2t 18.7t23.3t8a 111.4s122.5s120.6s117.2s -8b 125.8s124.5s131.8s125.2s -9 118.8d120.0d117.5d119.3d 118.2d10 120.2d120.9d119.0d119.4d 120.9d11 121.8d125.7d120.0d124.4d 122.8d12 111.5d112.8d112.2d111.9d 111.3d12a136.3s138.4s137.7s138.8s 136.2s13a130.3s126.0s137.5s127.4s 122.8d13b69.7d 161.1s63.6d 144.9s -14a148.7s149.8s137.7s147.5s 146.1sN14-C 36.4q 29.5q 162.4s - 29.8qa溶劑為C5D5N；表2生物堿(2)、(3)、(6)的1H化學位移(δ，ppm，DMSO)C 2 3a6a16.47(t，7.2) 7.16(d，7.6)7.46(t，7.3)26.91(d，4.8) 7.50(d，6.8)7.72(d，7.0)36.68(d，8.4) 7.26(d，7.2)7.68(d，10.8)46.91(d，4.8) 8.29(d，7.6)8.36(d，7.8)6- - -74.09(d，5.6) 5.48，5.08(m) 4.63(t，5.8)83.16(t，5.6) 2.63，3.35(m) 3.27(t，5.8)97.68(d，8.0) 7.13(d，8.4)7.36(d，8.0)10 7.11(t，7.2) 7.40(d，10.8) 7.20(t，7.2)11 7.30(t，7.2) 7.38(d，7.6)7.33(t，7.0)12 7.42(d，8.4) 7.24(d，7.6)7.29(d.1.8)13 11.77(s) 12.30(br.s) 9.69(br.s)N14-CH 3.43(s)9.17(s) 4.39(s)3a溶劑為C5D5N；
表3 生物堿(4)和(5)的1H和13C化學位移(δ，ppm)C4a5b1 11.65(s) - - -2 - 180.6s- 179.4s3 - 151.0s- 150.8s5α4.84(m)37.7t 4.42(m) 39.2t5β4.72(m)37.7t 4.18(m) 39.2t6α2.92(m)36.4t 2.50(m) 28.0t6β2.81(m)36.4t 2.26(m) 28.0t7 5.25(br.s) 75.9s 3.54(t，6.2)44.2d8 - 133.4s- 129.1s9 7.79(d，7.2) 124.9d7.62(m) 124.0d107.04(t，7.4) 122.3d6.88(t，7.5)122.1d117.21(m)129.5d7.21(m) 127.8126.97(d，8.0) 110.4d6.81(d，7.7)109.6d13- 143.0s- 141.6s15- 141.0s- 140.5s167.09(d，8.4) 114.3d7.07(d，7.6)113.4d177.58(m)135.2d7.31(d，7.4)134.9d187.15(t，7.6) 122.8d7.11(d，8.3)122.8d198.27(dd，6.4，1.6) 128.7d8.14(dd，6.2，1.6) 128.9d20- 116.1s- 115.5s21- 161.6s- 161.7s223.40(s)30.6q 3.51(s) 30.6qa溶劑為C5D5N；b溶劑為CDCl3實施例9可濕性粉劑將10份實施例2-8的任一化合物與5份十二烷基磺酸鈉、2份二苯甲烷、二磺酸鈉、甲醛聚合物及83份陶土混合、粉碎，即得100份粉劑。
實施例13本發(fā)明化合物對真菌菌絲生長的抑制作用該試驗為本發(fā)明合成的化合物抗稻瘟菌活性試驗之一(1)菌種稻瘟菌P131(Magnaporthe grisea P131)。
(2)培養(yǎng)基燕麥西紅柿培養(yǎng)基(Oa tomato Agar)用于稻瘟菌的培養(yǎng)。
(3)抗菌活性測定稻瘟菌液體懸浮培養(yǎng)在容積為50ml的無菌三角瓶中加入已滅菌的液體培養(yǎng)基20ml。挑取生長于固體培養(yǎng)基上稻瘟菌菌落邊緣的少許菌絲于20ml培養(yǎng)液中，在搖床上懸浮培養(yǎng)(175±5rpm)，25℃，暗，每培養(yǎng)48-72小時(不同菌種培養(yǎng)時間不同)，更換培養(yǎng)液1次(即取含菌培養(yǎng)液200μl于20ml新鮮培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng))。
用于抗菌活性測定菌液的準備取培養(yǎng)48-72小時的菌懸液，用鑷子將菌絲團搗碎，單層紗布過濾，加入2倍濃度的新鮮培養(yǎng)液將短菌絲稀釋成一定濃度，用于抗菌活性測定。
化合物濃度配制取1mg樣品，用無水乙醇完全溶解，并定容至1ml，制成1000μg/ml的母液，-20℃保存。實驗前臨時將化合物母液稀釋成不同濃度，并使溶液的乙醇濃度固定為10％。
具體操作取含96孔的微孔板，每孔加入不同濃度的化合物溶液50μl，每個濃度重復5孔，每孔加入已制備好的菌液50μl，在搖床上混均后，于655nm波長處測定各孔的光吸收值，然后避光培養(yǎng)，48小時或更長一段時間后重復測定各孔的光吸收值。
抑制率和生長半抑制率(IC50)的計算采用3倍標準差檢驗法剔除異常數據。對照光吸收值變化的平均值(ΔC)與化合物在某一濃度光吸收值變化的平均值(ΔT)之差除以對照光吸收值變化的平均值(ΔC)，再乘以100％，即為化合物在某一濃度時的抑制率。
結果表明化合物對稻瘟菌菌絲生長的半抑制濃度分別為4.31μg/ml(化合物1)，0.72μg/ml(化合物2)，3.84μg/ml(化合物3)，0.97μg/ml(化合物4)，0.84μg/ml(化合物1)，0.81μg/ml(化合物6)，1.42μg/ml(化合物7)。
實施例14本發(fā)明化合物對稻瘟菌孢子萌發(fā)和芽管生長的抑制作用。
該試驗為本發(fā)明合成的化合物抗稻瘟菌活性試驗之一(1)菌種稻瘟菌P131及S1528(Magnaporthe grisea P131 and S1528)。
(2)培養(yǎng)基燕麥西紅柿培養(yǎng)基(Oat tomato Agar)用于稻瘟菌的培養(yǎng)。
(3)抗菌活性測定稻瘟菌的培養(yǎng)和孢子懸液的制備1)涂菌用700μl無菌水將稻瘟菌的菌絲洗下，移至培養(yǎng)基上，涂布均勻，自然涼干(約30分鐘)，25℃下光照培養(yǎng)；2)洗氣生菌絲待長出氣生菌絲后(一般2天)，加入1ml無菌水，用滅菌的棉球輕輕打斷氣生菌絲，倒置涼干，覆蓋滅菌紗布，25℃光照培養(yǎng)；3)孢子懸浮液的制備長出灰色孢子后(一般1天)，用無菌水洗下孢子，用四層紗布過濾，3500rmp離心15分鐘，去掉上清液，孢子用無菌水制成孢子懸液，然后用四層紗布過濾，用Neubauer血球計數板計數，然后將孢子懸液稀釋到1×106個ml。
化合物濃度的配制取1mg樣品，用無水乙醇完全溶解，并定容至1ml，制成1000μg/ml的母液，-20℃保存。實驗前將化合物母液稀釋成不同的濃度，并使溶液的乙醇濃度固定為20％。
具體操作取化合物溶液30μl，孢子懸液30μl，于eppendorf管中混均，取10μl于載波片上，形成水滴，于相對濕度100％、25℃避光培養(yǎng)16小時，然后于顯微鏡下觀測孢子萌發(fā)和芽管生長狀況。結果見表4。
表4 生物堿對稻瘟菌菌株P131和S1528的抑制作用

權利要求
1.一種抗稻瘟病的藥物，其中含有治療有效量的化合物(1)至(7)中的任一化合物所示的吳茱萸吲哚類生物堿和農藥學上可接受的載體
2.權利要求1中化合物(1)至(7)任一化合物在制備防治或抗稻瘟病的藥物中的應用。
3.制備權利要求1所述的藥物的方法，其特征是取吳茱萸果實和莖葉部分，粉碎成粗粉后，用95％乙醇回流提取，回收乙醇得浸膏，以5％的酸水捏溶，過濾后的酸水溶液先用石油醚脫脂后，繼以28％的氨水堿化至PH10，繼以氯仿萃取，無水硫酸鈉干燥，回收氯仿得總堿，再用不同比例的石油醚-氯仿-甲醇和石油醚-乙酸乙酯進行反復硅膠常壓柱層析(LC)，低、中壓柱層析(LPLC、MPLC)，真空柱層析(VLC)，常壓及真空干柱層析(DCC、VDCC)，得權利要求1化學式(1)至(7)的生物堿化合物(1)至(7)，再分別取任一化合物按常規(guī)制備農藥方法得本發(fā)明抗稻瘟病的藥物。
全文摘要
由植物吳茱萸(Evodia rutaecarpa)中分離的吲哚類生物堿化合物,具有顯著的抗稻瘟菌活性,可用于防治水稻的稻瘟病。
文檔編號A01N43/90GK1371607SQ0211345
公開日2002年10月2日 申請日期2002年3月12日 優(yōu)先權日2002年3月12日
發(fā)明者郝小江, 左國營, 周立剛, 彭友良 申請人:中國科學院昆明植物研究所, 中國農業(yè)大學