專利名稱：小麥抗赤霉病種質(zhì)創(chuàng)制新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及小麥抗赤霉病細(xì)胞工程育種新方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)了雙層培養(yǎng)基、即愈傷組織培養(yǎng)基為上層和供菌體生長(zhǎng)的馬鈴薯蔗糖下層培養(yǎng)基，對(duì)外植體進(jìn)行抗性和突變體的篩選，從而獲得抗赤霉病的小麥優(yōu)質(zhì)品種。
近年來(lái)，一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用細(xì)胞培養(yǎng)篩選小麥抗赤霉病突變體可能是很有希望的。抗病突變體細(xì)胞選擇與植株水平選擇相比較，具有群體大、周期短、效率高的優(yōu)點(diǎn)，而且還可以解決缺乏抗源的病害、兼抗多種病害等難題。目前，用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗病突變體篩選的實(shí)驗(yàn)體系，主要包括活菌接種選擇體系、利用溫度敏感型病原接種選擇、原位篩選法、無(wú)選擇壓力法選擇和抗毒素篩選體系。在這些體系中，抗毒素細(xì)胞選擇體系較為成熟，只是在一些具體的技術(shù)參數(shù)上有待完善；另外，選擇體系的技術(shù)思路和原始材料的選擇尚有革新的空間。
中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所長(zhǎng)期從事小麥核質(zhì)雜種育種新技術(shù)研究，在創(chuàng)制和研究異源細(xì)胞質(zhì)小麥的遺傳變異過(guò)程中，采用田間植株麥穗單花定位注射接種法和室內(nèi)離體麥穗接種鑒定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)偏凸山羊草和粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)能誘發(fā)并提高部分小麥的赤霉病抗性。如粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)鑒26小麥×歐柔的雜種子一代表現(xiàn)為抗病，病小穗率為5.60％、穗軸侵染率為1.06％；而其反交組合歐柔×粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)鑒26的子一代表現(xiàn)為中抗→中感，病小穗率為11.2％、穗軸侵染率為12.94％。偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥和節(jié)節(jié)麥細(xì)胞質(zhì)小麥也有類似的研究結(jié)果。中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所是國(guó)內(nèi)較早開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)篩選小麥抗赤霉病突變體研究的單位之一，是“七五”、“八五”國(guó)家攻關(guān)相關(guān)項(xiàng)目和“八五”、“九五”中國(guó)科學(xué)院重大項(xiàng)目相關(guān)課題的主要承擔(dān)者之一。中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所曾與黑龍江省合江地區(qū)農(nóng)科所合作，從偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥和粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥中選出抗或中抗赤霉病的新品系7個(gè)；之后，中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所又選出抗或中抗赤霉病的新品系18個(gè)，并參加了相關(guān)不同地區(qū)的抗病性鑒定。這些研究結(jié)果為細(xì)胞培養(yǎng)篩選小麥抗赤霉病突變體研究奠定了材料和相關(guān)的技術(shù)方法基礎(chǔ)，也為從植株個(gè)體和群體水平鑒定抗赤霉病突變體材料奠定了必要的技術(shù)方法基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是建立以偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥和粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥為材料、采用抗病原菌毒素細(xì)胞選擇技術(shù)，高效篩選小麥抗赤霉病突變體和育種材料的新方法。
用生物測(cè)定法鑒定供用毒素液的毒性強(qiáng)弱以小麥發(fā)芽種子在高壓滅菌毒素液和活菌毒素液中(設(shè)置無(wú)毒素液對(duì)照)胚根生長(zhǎng)、胚芽生長(zhǎng)的抑制率為參數(shù)，確定不同赤霉病菌株毒素的毒性強(qiáng)弱，確定及用于毒素篩選(誘導(dǎo)、分化、綠苗)的最佳菌種和毒素溶液。如發(fā)芽力正常的晉2148小麥品種的種子置于不同菌種的毒素液中發(fā)芽時(shí)，菌株M-10和SF-1的毒素液完全抑制了種子發(fā)芽和根生長(zhǎng)；菌株76F17的毒素液雖然對(duì)種子發(fā)芽、生根也有抑制作用，但毒性明顯較弱，約有50％種子的芽和根可以不同程度的生長(zhǎng)。
2、以甲基硫菌靈和多菌靈為抑菌劑。根據(jù)抑菌劑的毒性和既能有效抑制赤霉菌菌絲體生長(zhǎng)、又不影響愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生，45-55mg/L的多菌靈為首選。
3、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/L 2，4-D。培養(yǎng)基中添加毒素液的體積比例為25％、30％、50％、70％，分化培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基中都補(bǔ)加毒素液。雙層培養(yǎng)基的下層培養(yǎng)基為馬鈴薯、蔗糖培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下接種赤霉病菌絲體，25℃恒溫培養(yǎng)24-72小時(shí)；上層培養(yǎng)基為MS+2mg/L 2，4-D+抑菌劑，加入時(shí)的溫度為45℃。配置好后放入4℃冰箱保存，72小時(shí)后用于實(shí)驗(yàn)，包括用于赤霉病菌株培養(yǎng)和用于愈傷組織的誘導(dǎo)、分化的培養(yǎng)基外植體接種。
4、選擇幼穗、幼胚為接種的外植體。所取幼穗長(zhǎng)5-10mm，在室內(nèi)剝?nèi)ダ先~、僅留一片心葉，用70％酒精消毒1分鐘、01％升汞消毒5分鐘，將幼穗切成3mm長(zhǎng)小段接種于(上層)培養(yǎng)基。幼胚取自幼嫩種子，用70％酒精消毒1分鐘、01％升汞消毒8分鐘，剝出幼胚、盾片朝上接種于(上層)培養(yǎng)基。鑒于幼穗對(duì)毒素較敏感，更適合于作離體抗性鑒定和篩選的培養(yǎng)材料。
5、根據(jù)赤霉菌毒素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)、存活、分化的抑制作用參數(shù)，抗性的最佳鑒定時(shí)間和突變體的最佳篩選期確定在外植體接種7-14天以后。
6、根據(jù)赤霉菌毒素對(duì)植株分化的影響(以毒素培養(yǎng)基上愈傷組織分化率和綠苗率為參數(shù))，確定30％-50％的毒素濃度為適宜的篩選濃度。
7、細(xì)胞水平抗性鑒定(毒素培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率)與植株水平鑒定(麥穗單花定位注射接種鑒定--離體室內(nèi)接種鑒定、田間植株接種鑒定)的關(guān)系分析。結(jié)論為細(xì)胞水平抗毒素能力較強(qiáng)的材料，植株水平抗病性也較強(qiáng)。如在70％濃度的毒素培養(yǎng)基上愈傷組織的相對(duì)誘導(dǎo)率(與不含毒素培養(yǎng)基)，晉2148為53.6％、VDKP2282為92.9％；植株抗性鑒定，晉2148表現(xiàn)感病、VDKP2282表現(xiàn)為中抗水平。
8、用于植株抗赤霉病鑒定的離體麥穗單花定位注射接種技術(shù)在抽穗到始花期階段，自劍葉節(jié)下斷剪取麥穗，放入特制的接種箱內(nèi)，接種禾谷鐮刀菌株M-10、SF-1所培養(yǎng)的分生孢子液。用滴管將分生孢子液滴入麥穗中部經(jīng)剪穎、標(biāo)記的一朵小花內(nèi)，置于25℃和高濕條件下。接種8-10天后比較病穗率和反應(yīng)級(jí)。
田間植株麥穗接種鑒定技術(shù)在抽穗到始花期階段，選取抽穗期一致的穗子，以上述離體單花定位注射方法接種，套袋噴水保濕，15天后調(diào)查病害發(fā)生情況，以病小穗率和穗軸浸染率進(jìn)行評(píng)價(jià)。
發(fā)病區(qū)田間抗病鑒定根據(jù)供試材料的生態(tài)特點(diǎn)，參加黑龍江省佳木斯地區(qū)、湖北省襄樊地區(qū)、江蘇省南京地區(qū)等地的小麥赤霉病抗病鑒定圃統(tǒng)一試驗(yàn)，采用一般通用的田間鑒定方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)就篩選或選擇效率而言具有群體大、周期短、效率高的優(yōu)點(diǎn)；而且還可以解決缺乏抗源的病害、兼抗多種病害等難題。
在組織培養(yǎng)與篩選技術(shù)上方面中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所建立了赤霉病菌株選擇、毒素篩選與鑒定、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體選擇、基于最佳選擇的培養(yǎng)時(shí)間界定和綠苗分化等完整的技術(shù)方法體系。近年來(lái)，又探索出一種更為有效的篩選鑒定技術(shù)，即雙層培養(yǎng)與活菌毒素篩選相結(jié)合的方法，活菌毒素篩選與滅菌提取毒素篩選相比，其有效性更接近于自然浸染狀態(tài)，只是這種方法要選擇好抑菌劑并控制好其濃度(達(dá)到真菌生長(zhǎng)與選擇壓力的協(xié)調(diào))。
在材料選擇上核質(zhì)雜種小麥與一般的小麥材料不同，一部分核質(zhì)組合的赤霉病抗性具有細(xì)胞質(zhì)正效應(yīng)；核質(zhì)雜種材料的誘變頻率比常規(guī)品種高。部分核質(zhì)雜種小麥不但幼穗愈傷組織細(xì)胞抗赤霉病能力明顯超過(guò)常規(guī)小麥品種(系)，而且在毒素培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率和綠苗率也明顯提高，有利于篩選并獲得抗赤霉病突變體植株。
植株的抗病性鑒定技術(shù)試驗(yàn)條件易于控制，簡(jiǎn)易方便，結(jié)果較穩(wěn)定能較好地鑒別材料的抗病性。
實(shí)施例材料偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥VDKP系統(tǒng)技術(shù)抗赤霉菌毒素細(xì)胞篩選小麥抗赤霉病新種質(zhì)265-1-9用于抗性細(xì)胞突變體篩選與鑒定的毒素來(lái)源于三個(gè)菌種M-10、SF-1、76F17。用于接種誘導(dǎo)愈傷組織的外植體為幼穗，幼穗先置于含或不含毒素的培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2，4-D)上誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，存活下來(lái)的愈傷組織連續(xù)移植到毒素濃度逐次提高的培養(yǎng)基上，進(jìn)行繼代多次細(xì)胞篩選，培養(yǎng)基中添加粗毒素的比例按體積計(jì)算分別為25％、30％、50％、70％；分化培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基中都補(bǔ)加毒素液。
以VDKP2282和VDKP2301為材料(偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥新品系)、以抗病品種蘇麥3號(hào)為對(duì)照，依據(jù)幼穗在30％赤霉菌毒素培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2，4-D+毒素)上的愈傷組織誘導(dǎo)率和存活率參數(shù)，并經(jīng)兩次重復(fù)細(xì)胞抗赤霉菌毒素篩選和抗病性鑒定，獲得小麥抗赤霉病突變新株系265和VDKP2301-1?？剐澡b定結(jié)果為株系265的抗赤霉病反應(yīng)級(jí)為1.8，略高于VDKP2282(反應(yīng)級(jí)為2.01)。
以抗赤霉病新株系265和VDKP2301-1為材料、以抗病品種蘇麥3號(hào)和感病品種歐柔為對(duì)照，設(shè)計(jì)毒素濃度梯度為30％→50％→70％的抗病突變體的篩選和鑒定培養(yǎng)基，通過(guò)幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)、突變、分化和綠苗，得到一批抗病性很強(qiáng)的突變體，其中來(lái)源于新株系265的突變系265-1在田間鑒定試驗(yàn)中表現(xiàn)最為突出。
在溫室中，從突變系265-1的群體中鑒定并選擇出高抗單株265-1-9；繼而進(jìn)行大田的重復(fù)鑒定，得到了相同的結(jié)果接種病菌孢子后，只有接種的小穗上長(zhǎng)出少量菌絲，不擴(kuò)展到穗軸和上下部臨近的小穗上；并且，株系內(nèi)各單株間的抗性表現(xiàn)一致。
以抗病品種蘇麥3號(hào)和感病品種歐柔為對(duì)照，采用離體麥穗單花定位注射接種技術(shù)3次重復(fù)鑒定抗病突變系265-1-9的抗性強(qiáng)弱與等級(jí)，結(jié)果見(jiàn)下表，突變系265-1-9的抗赤霉病能力明顯超過(guò)VDKP2282和抗病對(duì)照品種蘇麥3號(hào)。

權(quán)利要求
1.一種小麥抗赤霉病細(xì)胞工程育種的方法，該方法的具體步驟如下a.選擇禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)或其毒素液作為細(xì)胞篩選劑；b.以甲基硫菌靈，多菌靈為抑菌劑；c.由愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+2mg/L 2，4-D和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基組成的雙層培養(yǎng)基；d.將幼穗或幼胚作為外植體接種于雙層培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性和突變體篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的細(xì)胞篩選劑包括M-10，SF-1，76F17和病原菌的毒素液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抑菌劑首選45-55mg/L的多菌靈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有病原菌毒素液的MS+2mg/L2，4-D的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的病原體毒素液的濃度范圍為30％至50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雙層培養(yǎng)基，上層為含有毒素液、抑菌劑的愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，下層為M-10，SF-1或76F17菌體生長(zhǎng)時(shí)所需要的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，外植體接種于雙層培養(yǎng)基7至14天后進(jìn)行抗體和突變體的篩選。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及小麥抗赤霉病細(xì)胞工程育種新方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)了雙層培養(yǎng)基、即愈傷組織培養(yǎng)基為上層和供菌體生長(zhǎng)的馬鈴薯蔗糖下層培養(yǎng)基，對(duì)外植體進(jìn)行抗性和突變體的篩選，從而獲得抗赤霉病的小麥優(yōu)質(zhì)品種。
文檔編號(hào)A01H1/04GK1446455SQ0210788
公開(kāi)日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者劉春光, 侯寧, 劉根齊, 吳郁文, 張翠蘭, 張炎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所