專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生物材料的保存和貯存介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及通過(guò)冷凍、干燥和冷凍干燥來(lái)保存和穩(wěn)定生物材料，更具體而言，涉及用于保存生物材料的保護(hù)劑混合物和含水保存介質(zhì)，以及保存生物材料的方法和保存的生物材料組合物本身。
大多數(shù)生物材料的結(jié)構(gòu)和功能依賴(lài)于它們的水環(huán)境。因此，由于冷凍和干燥方法導(dǎo)致的它們水環(huán)境的改變經(jīng)?？赡軐?duì)生物材料產(chǎn)生劇烈的后果。此外，冷凍干燥結(jié)合了由于冷凍和干燥引起的后果。這種方法中的冷凍步驟可能具有不期望的副作用，如蛋白質(zhì)和酶的變性，以及細(xì)胞的破裂。這些作用由這些材料中冰結(jié)晶誘導(dǎo)的機(jī)械、化學(xué)和滲透壓力引起。結(jié)果，再水合時(shí)生物材料的活性徹底喪失，或者顯著地喪失，從而不能再用于其預(yù)期目的。
為了防止或減少重構(gòu)或再水合時(shí)的不利作用，使用保護(hù)劑，如冷凍保護(hù)劑或防溶劑(lyoprotectant)(冷凍干燥)。為了使這些保護(hù)劑有效，在保存期間遇到的濃度下，它們必須對(duì)生物材料無(wú)毒，并且必須和水與生物材料作用良好。各種保護(hù)劑已被用于本領(lǐng)域，并取得了不同程度的成功。這些包括魚(yú)蛋白、某些聚合物、脫脂乳、甘油、二甲基亞砜和二糖，如海藻糖。不幸的是，僅針對(duì)有限數(shù)目的系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了合適的保護(hù)劑和深低溫保藏方案。
二糖，如蔗糖和海藻糖，是天然的冷凍保護(hù)劑。海藻糖是一種特別有吸引力的冷凍保護(hù)劑，因?yàn)樗鼘?shí)際上從干旱期間保持滯生狀態(tài)的植物和動(dòng)物中分離。已證明海藻糖在環(huán)境空氣干燥和冷凍干燥中都是是一種對(duì)多種生物材料有效的保護(hù)劑。研究顯示，(參見(jiàn)Crowe，J.H.，Crowe，L.M.，和Mouriadian，R.，Cryobiology.20，346-356(1983))，在海藻糖存在下脂質(zhì)體在再水合時(shí)保持它們的功能和結(jié)構(gòu)完整性。美國(guó)專(zhuān)利5,556,771公開(kāi)了海藻糖或海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮的組合在保存反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶中的用途。美國(guó)專(zhuān)利5,512,547公開(kāi)了海藻糖用于保存肉毒桿菌神經(jīng)毒素的用途。同樣，美國(guó)專(zhuān)利4,891,319公開(kāi)了用海藻糖保護(hù)蛋白和其它生物大分子，如酶、血清、血清補(bǔ)體、抗體、抗原、熒光蛋白和疫苗成分的方法。特別地，在含水體系重量的0.05％至約20％的海藻糖的存在下，在高于冷凍溫度的條件下，干燥含有大分子和海藻糖的含水混合物。
然而，用海藻糖作為單獨(dú)的冷凍保護(hù)劑有一些缺點(diǎn)。為了通過(guò)冷凍干燥保存許多生物材料，必須使用大量海藻糖；有時(shí)需要海藻糖的濃度大于給定保存介質(zhì)的重量的60％。這一花費(fèi)昂貴。此外，海藻糖的高濃度降低體系中其它溶質(zhì)的溶解度。
因此，已經(jīng)提議使用海藻糖和聚合膠凝劑，如羧甲基纖維素或羧乙基纖維素的組合。已經(jīng)提出，對(duì)于人血，糖和聚合物的組合甚至是比純海藻糖更有效的冷凍保護(hù)劑。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,171,661；Sutton，R.L.，J.Chem.Soc.Faraday Trans.，87，3747(1991)。不幸的是，確證膠凝劑的有益作用的嘗試并不成功。(G.Spieles，I.Heschel，和G.Rau，Cryo-Letters17，43-52(1996)，J.H.Crowe，A.E.Oliver，F(xiàn).A.Hoekstra，和L.M.Crowe，Cryobiology35，20-30(1997))。而且，這種保護(hù)組合不能用于醫(yī)學(xué)目的，因?yàn)榫酆衔锬z凝劑不能被人體很好地接受。結(jié)果，這種組合并不十分有用，即便有，它也并不能提供比單獨(dú)使用海藻糖更多的實(shí)際改善。
與使用海藻糖有關(guān)的另一個(gè)更嚴(yán)重的問(wèn)題是單獨(dú)使用海藻糖保存的生物材料并不能長(zhǎng)期穩(wěn)定地貯存，特別是那些貯存在超環(huán)境溫度(superambient)和/或潮濕環(huán)境中的生物材料。換言之，用海藻糖保存的生物材料根據(jù)貯存條件的濕度和溫度可能在幾小時(shí)或幾天內(nèi)失去它們的活性。
因此，目前，用海藻糖冷凍干燥在多種貯存條件下長(zhǎng)期保存生物材料如蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞、組織、核酸、精液、血及其成分、哺乳動(dòng)物器官和食品中的使用有限，因?yàn)椴牧蠈⒔到?，并且在重?gòu)時(shí)將沒(méi)有足夠的活性。從實(shí)用的觀點(diǎn)而言，這顯然是藥品不能接受的，因?yàn)楸４娌牧系睦碛芍皇紫仁翘峁┵A存穩(wěn)定的產(chǎn)品。
目前很多的各種室溫干燥技術(shù)不能得到有效使用。這些方法，雖然比冷凍干燥簡(jiǎn)單且花費(fèi)低，但它們一般對(duì)生物材料更具破壞性。與使用冷凍干燥時(shí)相比，在室溫下使用這些方法保存的許多生物材料更傾向于整體構(gòu)象改變和發(fā)生不希望的反應(yīng)。結(jié)果，即使使用現(xiàn)在已知的保護(hù)劑，許多再水合的生物材料的活性本身就不令人滿(mǎn)意，并且顯著低于冷凍干燥保存的材料活性。
因此，需要一種能用于多種生物材料的保護(hù)劑混合物。進(jìn)一步需要一種能有效用于冷凍干燥方法和包括環(huán)境溫度干燥的干燥方法的保護(hù)劑混合物。還需要一種比現(xiàn)在使用的保護(hù)劑混合物更廉價(jià)的保護(hù)劑混合物。最后，非常重要的是，需要一種保護(hù)劑混合物，其為長(zhǎng)期、高溫和各種濕度條件下保存生物材料提供穩(wěn)定介質(zhì)，所述高溫和各種濕度可能在材料的運(yùn)輸和貯存期間遭遇，該介質(zhì)使生物材料在再水合時(shí)仍保持顯著量的活性。
本發(fā)明的保護(hù)劑混合物、含水保護(hù)介質(zhì)和所得的保護(hù)的生物材料組合物迎合了所有這些需要。
因此，本發(fā)明還提供由上述保存介質(zhì)制備保存的生物材料組合物的方法，以及保存的生物材料組合物本身。
圖2是從用不同量和摩爾比的磷酸鹽和海藻糖制備的冷凍的乳酸脫氫酶組合物恢復(fù)的百分活性的圖。
圖3是從用不同量和摩爾比的磷酸鹽和海藻糖制備的冷凍干燥的乳酸脫氫酶組合物隨時(shí)間恢復(fù)的百分活性的圖。
圖4是從用不同量和摩爾比的磷酸鹽和海藻糖制備的冷凍干燥的乳酸脫氫酶組合物隨時(shí)間恢復(fù)的百分活性的圖。
圖5是從用不同量和摩爾比的磷酸鹽和海藻糖制備的冷凍干燥的乳酸脫氫酶組合物隨時(shí)間恢復(fù)的百分活性的圖。
圖6是本發(fā)明的各種保護(hù)劑混合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。
(a)酶，如乳酸脫氫酶和果糖磷酸激酶；(b)蛋白質(zhì)，如胰島素；(c)血清補(bǔ)體；(d)疫苗；(e)組織，包括皮膚、靜脈和動(dòng)脈；(f)病毒，如腺病毒；(g)哺乳動(dòng)物器官，如肝、胰和肺；(h)血及其成分，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板；(i)細(xì)胞，包括原核細(xì)胞(包括細(xì)菌)和真核細(xì)胞；(j)精液；(k)其他生物材料，包括核酸和脂囊泡；(l)食品。
以上僅僅是無(wú)數(shù)生物材料中的一些實(shí)例，所述生物材料可以用本發(fā)明的保護(hù)劑混合物、含水保存介質(zhì)和方法制成本發(fā)明的保存的生物材料組合物。任何需要為以后使用而保存的生物材料均可以和該保護(hù)劑混合物一起使用，從而形成保存介質(zhì)，然后它可以通過(guò)本發(fā)明的保存方法保存，從而形成保存的組合物。多羥基化合物在本發(fā)明中有用的多羥基化合物包括天然和合成的單糖和多糖、其它碳水化合物，以及多元醇及它們的衍生物。這里，“多糖”定義為含有兩個(gè)或兩個(gè)以上單糖單元的糖。單獨(dú)的多羥基化合物可以單獨(dú)使用，或者和其它類(lèi)型的多羥基化合物一起使用。在眾多有用的多羥基化合物中，優(yōu)選使用單糖和多糖。在糖中，二糖如海藻糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖優(yōu)選用于本發(fā)明，其中海藻糖是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的保護(hù)劑混合物、保存介質(zhì)和保存的組合物中的多羥基化合物的存在量取決于具體的多羥基化合物，和選擇使用的生物材料，以及被保存的生物材料的質(zhì)量。對(duì)于給定的體系，這可以進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。
一般而言，當(dāng)混合物是水溶液時(shí)，本發(fā)明的保護(hù)劑混合物中多羥基化合物的存在總量為混合物重量的約5％至約60％。當(dāng)保護(hù)劑混合物是固體，例如是粉末時(shí)，多羥基化合物的存在總量應(yīng)為混合物重量的約10％至約95％，優(yōu)選為混合物重量的約20％至約95％。當(dāng)保護(hù)劑混合物是水溶液時(shí)，多羥基化合物的存在總量?jī)?yōu)選為使混合物中多羥基化合物的總量為混合物重量的約5％至約40％，尤其優(yōu)選為混合物重量的約10％至約30％。
同樣，本發(fā)明的保存介質(zhì)中多羥基化合物的存在總量應(yīng)為使含水保存介質(zhì)中多羥基化合物的總量為含水保存介質(zhì)重量的約5％至約60％。優(yōu)選地，多羥基化合物的存在總量應(yīng)為含水保存介質(zhì)重量的約5％至約40％，尤其優(yōu)選為含水保存介質(zhì)重量的約10％至約30％。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，上述范圍可以改變，例如取決于保存介質(zhì)中生物材料的量和選擇使用的保存方法。
本發(fā)明的含水保存介質(zhì)中多羥基化合物的上述用量將在液體水部分或全部除去時(shí)，導(dǎo)致含有組合物重量的約5％至約95％的多羥基化合物的保存的生物材料組合物。同樣，該量將取決于被保存的生物材料的質(zhì)量、磷酸鹽的存在量，和保存期間從體系中除去的水的量。保存的生物組合物中多羥基化合物的量可以由保護(hù)劑混合物和/或含水保存介質(zhì)中的存在量來(lái)測(cè)定?；蛘?，保存的生物材料組合物中多羥基化合物的量可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的分析方法，如柱色譜來(lái)測(cè)定。磷酸鹽離子任何來(lái)源的磷酸鹽離子均可以用于本發(fā)明的保護(hù)劑混合物、保存介質(zhì)、保存方法，和保存的組合物。盡管不希望被任何特定的理論束縛，但據(jù)信磷酸鹽離子和多羥基化合物形成復(fù)合物，它在三維超分子結(jié)構(gòu)中含有被磷酸鹽離子交聯(lián)的幾個(gè)多羥基化合物的分子。含水保存介質(zhì)比單獨(dú)含有相同量的多羥基化合物的體系具有更高的粘度，并且保存的生物材料組合物比僅含有多羥基化合物的組合物具有更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。
如前所述，磷酸鹽離子可以由任何來(lái)源提供，包括酸和鹽。優(yōu)選使用鈉鹽和鉀鹽。最優(yōu)選是鉀鹽，因?yàn)樗鼈冊(cè)诘蜏叵戮哂袠O好的溶解性，并且以無(wú)水晶體結(jié)晶。因此，磷酸鹽離子優(yōu)選通過(guò)使用鈉鹽和/或鉀鹽提供，尤其優(yōu)選使用單堿和二堿鉀磷酸鹽的混合物。
對(duì)于給定的保護(hù)劑混合物和/或保存介質(zhì)，最佳的磷酸鹽離子的量取決于幾個(gè)變量，包括要被保存的具體生物材料、保護(hù)劑混合物和/或保存介質(zhì)中多羥基化合物的量和類(lèi)型，以及體系中生物材料的量。一般而言，保護(hù)劑混合物和/或含水保存介質(zhì)中磷酸鹽離子的存在總量應(yīng)為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.025至約0.625。優(yōu)選地，磷酸鹽離子的存在量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.0375至約0.625。
磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比在整個(gè)保存過(guò)程中將保持基本恒定，導(dǎo)致具有基本相同的磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比的保存的生物材料。因此，保存的生物材料組合物中磷酸鹽離子的存在量直接從含水保存介質(zhì)中的存在量得出?；蛘?，保存的生物材料組合物中的磷酸鹽離子的存在量可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的分析方法來(lái)測(cè)定，包括離子色譜和化學(xué)發(fā)光。
有用的磷酸鹽離子的量也可以基于每摩爾多羥基化合物的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)，通過(guò)上述比乘以每摩爾所用的多羥基化合物中存在的羥基基團(tuán)的數(shù)目來(lái)測(cè)定。例如，每摩爾海藻糖和蔗糖化合物具有8摩爾羥基基團(tuán)。因此，當(dāng)海藻糖和蔗糖用作多羥基化合物時(shí)，每摩爾羥基基團(tuán)約0.025至約0.625摩爾磷酸鹽離子的比可以通過(guò)加入足量磷酸鹽離子以使磷酸鹽離子對(duì)蔗糖或海藻糖的摩爾比為約0.2至約5來(lái)獲得。對(duì)于海藻糖或蔗糖，優(yōu)選的摩爾比為約0.0375至約0.625，轉(zhuǎn)化成磷酸鹽離子對(duì)蔗糖或海藻糖的摩爾比為約0.3至約5。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷酸鹽離子在穩(wěn)定和保存給定生物材料的結(jié)構(gòu)和功能方面的有效性隨著磷酸鹽離子對(duì)羥基基團(tuán)的摩爾比從0向上增加而增加，但增加到某一點(diǎn)(最佳比)后，使用更多的磷酸鹽離子不提供或僅僅提供很少的有效性增加。如前面所討論，最佳比取決于幾個(gè)因素，包括所用生物材料的量和類(lèi)型、保存介質(zhì)中多羥基化合物的量和類(lèi)型、保存介質(zhì)的pH，和要用的保存技術(shù)。
在許多情況下，在磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比高于給定的本發(fā)明的含水保存介質(zhì)的最佳值的情況下使用磷酸鹽離子，在保存時(shí)仍導(dǎo)致相對(duì)于得自?xún)H含多羥基化合物的含水保存介質(zhì)的保存的組合物而言，具有改善的結(jié)構(gòu)和功能完整性，如再水合時(shí)改善的活性、貯存穩(wěn)定性，或費(fèi)用和加工方面的優(yōu)勢(shì)的保存的生物材料組合物。因此，優(yōu)選給定的本發(fā)明的含水保存介質(zhì)的比小于或等于再水合時(shí)獲得最佳穩(wěn)定性和活性的比，使用最佳比是最優(yōu)選的。然而，也可以使用具有大于再水合時(shí)保存的生物材料具有最佳活性所需要的比。其它成分本發(fā)明的保護(hù)劑混合物和/或含水保存介質(zhì)可以含有其它成分。例如，它們可以含有緩沖液以使介質(zhì)的pH維持在給定生物材料的最佳值上。應(yīng)注意的是，混合物和/或介質(zhì)中的磷酸鹽離子也起緩沖液的作用，所以不需要另加非磷酸鹽緩沖液。如果使用磷酸鹽緩沖液，在測(cè)定混合物和/或含水保存介質(zhì)，以及所得的保存的生物材料組合物中，磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比時(shí)，緩沖液中磷酸鹽離子的存在量應(yīng)該被包括在內(nèi)。使給定的生物材料最穩(wěn)定的pH在本領(lǐng)域中是已知的。一般而言，本發(fā)明的保存介質(zhì)的pH范圍應(yīng)為約5至約10，最優(yōu)選的pH范圍為約6至約9。
保護(hù)劑混合物和/或含水保存介質(zhì)還可以含有一種或多種抗氧化劑，如硫代硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和檸檬酸鈉。如果使用抗氧化劑，它可以以本領(lǐng)域中已知有用的量存在。
保護(hù)劑混合物和/或含水保存介質(zhì)還可以含有作為干燥劑和/或滲透壓保護(hù)劑(osmoprotectant)的其它成分，如甲醇、乙醇、甘油和DMSO。這些成分傾向于在由本發(fā)明的含水保存介質(zhì)制備的保存的生物材料組合物中降低殘留的水分或平衡滲透壓，這在一些情況下導(dǎo)致更好的貯存能力。本發(fā)明的保護(hù)劑混合物、含水保存介質(zhì)和保存的組合物的制備本發(fā)明的保護(hù)劑混合物可以如下制備。將多羥基化合物和磷酸鹽離子源以需要的比加入水溶液中。優(yōu)選在加入多羥基化合物之前將磷酸鹽離子源溶解在溶液中。如果需要，可以加熱混合物以實(shí)現(xiàn)溶解。應(yīng)徹底混合溶液，直至獲得均質(zhì)保護(hù)劑混合物。任何這一保護(hù)劑混合物可以作為水溶液得到貯存，或者可以用本領(lǐng)域已知的各種方法來(lái)生產(chǎn)固體混合物，如粉末。粉末可以是無(wú)水的或部分結(jié)晶的水合物質(zhì)。當(dāng)保護(hù)劑混合物是固體如粉末時(shí)，在用于制備本發(fā)明的含水保存介質(zhì)前它應(yīng)該用水溶液進(jìn)行重構(gòu)。然而，可以直接將固體混合物加入含有生物材料的水溶液中以形成含水介質(zhì)。
接著將水溶液形式的保護(hù)劑混合物加入生物材料的水溶液中。如果保護(hù)劑混合物在含水緩沖溶液中制備，則生物材料的水溶液優(yōu)選在相同的緩沖液中制備。然后將這兩種溶液徹底混合，從而形成本發(fā)明的含水保存介質(zhì)。如果使用抗氧化劑，一般在加入保護(hù)劑溶液之前將其加入生物材料的水溶液中。
用于本發(fā)明的含水保存介質(zhì)的生物材料的量可以根據(jù)需要而改變，這取決于例如要保存的具體生物材料、磷酸鹽離子和多羥基化合物的存在量、要采用的保存技術(shù)。
然后含水保存介質(zhì)可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的一種或多種技術(shù)進(jìn)行保存，包括冷凍、冷凍干燥、真空干燥、環(huán)境空氣干燥，和/或噴霧干燥，從而提供本發(fā)明的保存的生物材料組合物。所得的保存的生物材料組合物可以是無(wú)水的，或者可以是部分結(jié)晶的水合物質(zhì)。優(yōu)選保存的生物材料是本質(zhì)上基本上無(wú)水的。這里，“基本上無(wú)水的”意指保存的生物材料組合物含有少于10％的水，這由Karl Fisher分析測(cè)定。實(shí)施例1通過(guò)在Butterfield′s緩沖液(pH為7.2的0.6mM磷酸鉀緩沖的水)中加入預(yù)定量的多羥基化合物和磷酸鹽離子，并混合形成均質(zhì)溶液，制備水溶液形式的各種保護(hù)劑混合物。然后將給定的保護(hù)劑混合物以1∶1的質(zhì)量比加入嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)細(xì)胞溶液中，將所得的含水保護(hù)介質(zhì)徹底混合，并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。嗜酸乳桿菌細(xì)胞溶液如下制備將干物質(zhì)重量百分比為15.3％的濃嗜酸乳桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物和1.9％的硫代硫酸鈉混合，從而形成嗜酸乳桿菌細(xì)胞溶液，并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。
然后將以上述方式制備的各含水保護(hù)介質(zhì)樣品冷凍、冷凍干燥或真空干燥。
對(duì)于冷凍的樣品，通過(guò)25口徑(gauge)的注射針將含水保存介質(zhì)滴入液氮中。液滴通常形成直徑2～3mm的小球，它們?cè)诩s10秒鐘內(nèi)完全凍結(jié)。然后在室溫下的開(kāi)放環(huán)境中使這些保存的細(xì)胞組合物樣品解凍。
冷凍干燥的樣品如上述方法冷凍，將所得的小球置于Virtis 12EL冷凍干燥儀中的在不超過(guò)-45℃的溫度下預(yù)冷的架子上。另外，稱(chēng)重少量保存介質(zhì)樣品以測(cè)定它們的密度，接著在玻璃盤(pán)中冷凍干燥成一薄層。在冷凍干燥之前和之后稱(chēng)重這些樣品以計(jì)算冷凍干燥期間各樣品丟失的水的量，由此測(cè)定再水合所需要的水的量。
所有冷凍干燥的樣品都進(jìn)行以下冷凍干燥方案，其中壓力和溫度是設(shè)定點(diǎn)。在將樣品如上所述置于冷凍干燥儀中后，將冷凍干燥儀抽至壓力為0毫托(mtorr)。樣品在-45℃和0毫托下保持1200分鐘，接著將溫度和壓力在50分鐘內(nèi)分別升高到-40℃和20毫托。樣品接著在-40℃和20毫托下保持600分鐘。接著將溫度在50分鐘內(nèi)升高到-35℃，樣品接著在-35℃和20毫托下保持600分鐘。接著將溫度和壓力在50分鐘內(nèi)分別升高到-30℃和50毫托，樣品接著在-30℃和50毫托下保持600分鐘。在該時(shí)間段的終點(diǎn)，將溫度和壓力在50分鐘內(nèi)分別升高到-25℃和100毫托，樣品在-25℃和100毫托下保持600分鐘。接著將溫度在50分鐘內(nèi)升高到-20℃，樣品接著在-20℃和100毫托下保持600分鐘。然后將溫度在100分鐘內(nèi)升高到-10℃，樣品在這一溫度和100毫托下保持600分鐘。
樣品接著在50毫托下以0.5℃/min的速率升溫至最終溫度40℃。樣品接著在最終溫度和0毫托下保持1200～2400分鐘。冷凍干燥儀接著用氮?dú)夥趴?，轉(zhuǎn)移保存的細(xì)胞組合物樣品，并密封在50ml塑料離心管中，于37℃恒溫箱中貯存。
對(duì)于真空干燥的樣品，將0.2ml保存介質(zhì)置于1.8ml塑料微離心管中。接著將樣品置于Savant Instruments SVC-100H SpeedVacConcentrator真空干燥儀中，并在室溫和最終壓力為85毫托下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)約4天，從而獲得保存的細(xì)胞組合物。接著密封試管并在室溫下貯存在干燥器中。
在樣品被制備并進(jìn)行冷凍、真空干燥或冷凍干燥時(shí)，從含水保存介質(zhì)中取樣品，稀釋并用標(biāo)準(zhǔn)傾注皿培養(yǎng)技術(shù)在瓊脂培養(yǎng)基上涂板，從而測(cè)定進(jìn)行任何保存過(guò)程前的保存介質(zhì)中的活細(xì)胞數(shù)目。首先，稀釋樣品以獲得約100個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。接著在培養(yǎng)皿中放入1ml或2ml稀釋的保存介質(zhì)，并在45℃下和液體瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基(15g/L瓊脂和55g/L MRS乳桿菌肉湯和0.1％的L-半胱氨酸)混合。冷卻培養(yǎng)皿，固化瓊脂，這時(shí)翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿并在37℃的厭氧生長(zhǎng)室(GasPakjar)中放置2～3天，這時(shí)在瓊脂中菌落可見(jiàn)。原則上，各菌落代表保存介質(zhì)中單個(gè)活細(xì)胞。
在各時(shí)間點(diǎn)，將部分通過(guò)冷凍干燥和真空干燥制備的保存的細(xì)胞組合物在Butterfield′s緩沖液中再水合。將冷凍干燥的樣品再水合至它們?cè)紳舛鹊募s1/100，接著培養(yǎng)30分鐘，稀釋并如上所述涂板。將真空干燥的樣品再水合至它們?cè)紳舛鹊?/5，混合以使小球充分溶解，稀釋并如上所述涂板。所有樣品至少平行三份涂板。對(duì)于這些試驗(yàn)，時(shí)間零點(diǎn)是樣品從干燥儀中轉(zhuǎn)移走的時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)在液氮中冷凍保存介質(zhì)的樣品而制備的保存的細(xì)胞組合物在室溫下完全解凍后如上述方法涂板。
給定的一系列樣品的結(jié)果列于下表1，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比?！叭芤骸敝峁┙o定的保存介質(zhì)中活細(xì)胞的量，在“單獨(dú)的細(xì)胞”樣品中的活細(xì)胞的量定義為100％。
表1

1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾海藻糖的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是1.9％硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。3NA在較晚的時(shí)間點(diǎn)恢復(fù)＜10％的樣品沒(méi)有進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例2使用不同量的磷酸鹽、碳酸鹽或硫酸鹽離子和多羥基化合物，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程。給定的一系列樣品的結(jié)果列于下表2，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比。“溶液”柱提供給定的保存介質(zhì)中活細(xì)胞的量，在“單獨(dú)的細(xì)胞”樣品中的活細(xì)胞的量定義為100％。
表2

1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾多羥基化合物的磷酸鹽、碳酸鹽或硫酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是1.9％硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。3這些樣品的pH沒(méi)有進(jìn)行控制。指示紙估計(jì)其pH為約11。這很可能是恢復(fù)差的原因。4NA在較晚的時(shí)間點(diǎn)恢復(fù)＜10％的樣品沒(méi)有進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例3除了將冷凍干燥的樣品干燥到50℃之外，使用含有不同量的多種來(lái)源的磷酸鹽離子和不同量的海藻糖的保存介質(zhì)，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程。另外，通過(guò)Karl Fischer(KF)分析測(cè)定冷凍干燥的樣品中殘留的水，并獲得玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。給定的一系列樣品的結(jié)果列于下表3中，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比?！叭芤骸敝峁┙o定的保存介質(zhì)中活細(xì)胞的量，在“單獨(dú)的細(xì)胞”樣品中的活細(xì)胞的量定義為100％。
表3

1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾海藻糖的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是1.9％硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。*這個(gè)樣品未正確稀釋?zhuān)瑢?dǎo)致恢復(fù)＞400％。實(shí)施例4除了將冷凍干燥的樣品干燥至50℃之外，使用保存介質(zhì)中的不同量的海藻糖和不同的磷酸鹽離子源，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程。在兩個(gè)樣品中，乙醇作為干燥劑被加入保存介質(zhì)中，而在一個(gè)樣品中，嗜酸乳桿菌細(xì)胞被“洗滌”(離心、潷析和再懸浮)以除去殘留的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。還測(cè)試了含有不同緩沖液的介質(zhì)。給定的一系列樣品的結(jié)果列于下表4中，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比?！叭芤骸敝峁┙o定的保存介質(zhì)中活細(xì)胞的量，在“單獨(dú)的細(xì)胞”樣品中的活細(xì)胞的量定義為100％。
表4

1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾海藻糖的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是1.9％硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。3NA在較晚的時(shí)間點(diǎn)恢復(fù)＜10％的樣品沒(méi)有進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例5除了將樣品冷凍干燥至50℃之外，使用海藻糖、磷酸鹽離子和各種抗氧化劑或沒(méi)有抗氧化劑，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程。給定的一系列樣品的結(jié)果列于下表5中，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比?！叭芤骸敝峁┙o定的保存介質(zhì)中的活細(xì)胞的量，在“單獨(dú)的細(xì)胞”樣品中的活細(xì)胞的量定義為100％。
表5

注1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾海藻糖的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。3海藻糖-磷酸鹽的pH定為6.5，但加入抗氧化劑或細(xì)胞后沒(méi)有測(cè)定。最終pH最可能在6.0～6.5之間。實(shí)施例6除了用小球菌(Pediococcus)種代替嗜酸乳桿菌細(xì)胞，并將冷凍干燥的樣品干燥至25℃或進(jìn)一步干燥至50℃之外，重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程。給定的一系列樣品的結(jié)果列于下表6中，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比。“溶液”柱提供給定的保存介質(zhì)中活細(xì)胞的量，“單獨(dú)的細(xì)胞+thio”樣品中活細(xì)胞的量定義為100％。
表6

注1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾海藻糖的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是1.9％硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。3在和細(xì)胞混合前海藻糖-磷酸鹽的pH測(cè)定為6.5。最終pH最可能低于6.5。實(shí)施例7將L-乳酸脫氫酶(LDH，EC1.1.1.27，II型，兔肌肉)在4℃下在pH7.5的100mM磷酸鉀緩沖溶液中透析過(guò)夜。用SIGMADIAGNOSTIC測(cè)定總蛋白含量，SIGMA DIAGNOSTIC是購(gòu)自SigmaChemical Company(St.Louis，密蘇里州)的蛋白測(cè)定試劑盒，測(cè)定使用Ohnishi和Barr的改進(jìn)的縮二脲方法，“Simplified Method forQuantitating Protein using the Biuret and Phenol Reagents(用縮二脲和苯酚試劑定量蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)化方法)”，Analytical Biochem.，86193-200(1978)。在室溫下使用Varian UV Spectrophotometer在725nm的特征吸收處進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定。反應(yīng)混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、0.150mM NADH和1.20mM丙酮酸。
為了制備樣品，將透析的LDH用與曾用于透析的磷酸鉀緩沖液相同的磷酸鉀緩沖液稀釋。所得的酶溶液的磷酸鹽離子濃度為100mM，LDH濃度為50μg/ml。然后制備三個(gè)系列的保護(hù)劑混合物。這些混合物系列的海藻糖濃度分別為200mM、400mM和600mM。每個(gè)混合物系列由四個(gè)單獨(dú)的保護(hù)劑樣品組成，四個(gè)樣品分別含有濃度為100mM、300mM、500mM和700mM的磷酸鹽離子。通過(guò)將海藻糖溶解在含有給定量的磷酸鹽離子的磷酸水溶液中而制備這些樣品。
接著將2ml LDH溶液和2ml十二個(gè)保護(hù)劑混合物的每一個(gè)混合，以提供4ml含水保存介質(zhì)的溶液，所述含水保存介質(zhì)的海藻糖濃度為100mM、200mM或300mM，LDH濃度為25μg/ml，磷酸鹽離子濃度為100mM、200mM、300mM或400mM。以上樣品的制備如表7所示。
表7(系列1)

(系列2)

(系列3)

接著準(zhǔn)備四十八個(gè)小瓶，用于以上每一個(gè)保存介質(zhì)樣品。給每個(gè)小瓶貼上標(biāo)簽并稱(chēng)重，用移液管向每個(gè)小瓶中移入1ml保存介質(zhì)。接著每個(gè)小瓶再稱(chēng)重。接著通過(guò)將小瓶浸入液氮中(“驟冷”)或者通過(guò)置于冷凍干燥儀中在不超過(guò)-45℃的溫度下預(yù)冷的架子上(“緩慢冷凍”)而將樣品冷凍。所有的冷凍干燥的樣品在Virtis 12EL冷凍干燥儀中進(jìn)行下列冷凍干燥方案，其中所有壓力和溫度是設(shè)定點(diǎn)。在將樣品放入上述冷凍干燥儀中后，將冷凍干燥儀抽空到壓力為0毫托。樣品在-45℃和0毫托下保持600分鐘，此后將溫度和壓力在50分鐘內(nèi)分別升高到-40℃和20毫托。樣品接著在-40℃和20毫托下保持600分鐘。接著將溫度在50分鐘內(nèi)升高到-35℃，樣品接著在-35℃和20毫托下保持600分鐘。然后將溫度和壓力在50分鐘內(nèi)分別升高到-30℃和50毫托，樣品接著在-30℃和50毫托下保持600分鐘。在該時(shí)間段的終點(diǎn)，將溫度和壓力在50分鐘內(nèi)分別升高到-25℃和100毫托，樣品在-25℃和100毫托下保持600分鐘。接著將溫度在50分鐘內(nèi)升高到-20℃，樣品接著在-20℃和100毫托下保持600分鐘。然后將溫度在100分鐘內(nèi)升高到-10℃，樣品在這一溫度和100毫托下保持600分鐘。
樣品接著在50毫托下在700分鐘內(nèi)升高到25℃。接著樣品在最終溫度在0毫托下保持2140分鐘直至卸載(unloading)。冷凍干燥儀接著用氮?dú)夥趴眨瑢⑿∑恐斜４娴腖DH樣品轉(zhuǎn)移并測(cè)定LDH活性。在測(cè)定活性前，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行稱(chēng)重，以測(cè)定水分丟失量，并用丟失的水的量的凈化水(來(lái)自Millipore Corp.的MilIiQ System)進(jìn)行再水合。接著用以前討論的相同方法測(cè)定LDH活性。
給定的一系列樣品的結(jié)果列于


圖1(冷凍干燥)和圖2(冷凍)中。實(shí)施例8將L-乳酸脫氫酶(LDH，EC 1.1.1.27，II型，兔肌肉)在4℃下在pH7.5的100mM磷酸鉀緩沖溶液中透析過(guò)夜。使用SIGMADIAGNOSTIC測(cè)定總蛋白含量，SIGMA DIAGNOSTIC是購(gòu)自SigmaChemical Company(St.Louis，密蘇里州)的蛋白測(cè)定試劑盒，測(cè)定使用Ohnishi和Barr的改進(jìn)的縮二脲方法，“Simpliied Method forQuantitating Protein using the Biuret and Phenol Reagents(用縮二脲和苯酚試劑定量蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)化方法)”，Analytical Biochem.，86193-200(1978)。在室溫下使用Varian UV Spectrophotometer在725nm的特征吸收處進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定。反應(yīng)混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、0.150mM NADH和1.20mM丙酮酸。
為了制備樣品，將LDH加入四個(gè)50ml的容器中，并用與曾用于透析的磷酸鉀緩沖溶液相同的磷酸鉀緩沖溶液稀釋?zhuān)灾苽?5ml溶液。在每個(gè)樣品中，酶濃度為50μg/ml。接著在50ml的容器中制備四個(gè)體積為25ml的保護(hù)劑混合物。每個(gè)混合物含有400mM海藻糖和不同量的磷酸鹽離子。為了制備第一個(gè)混合物(基準(zhǔn))，將海藻糖溶解在10mM磷酸鉀溶液中。為了制備第二個(gè)混合物，將海藻糖溶解在100mM磷酸鉀溶液中。通過(guò)將海藻糖分別溶解在500mM磷酸鉀溶液和900mM磷酸鉀溶液中制備第三和第四個(gè)混合物。
接著將LDH樣品和保護(hù)劑混合物混合，以提供50ml含水保存介質(zhì)溶液，所述含水保存介質(zhì)的LDH濃度為25μg/ml，海藻糖濃度為200mM，和不同濃度的LDH及磷酸鹽離子。樣品1～4的磷酸鹽離子濃度分別是10mM、100mM、300mM和500mM，樣品1中磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為0.05，樣品2中為0.5，樣品3中為1.5，樣品4中為2.5。上述樣品制備如表8所示。
表8

接著準(zhǔn)備四十個(gè)小瓶，用于以上保存介質(zhì)的四份樣品的每一個(gè)。給每個(gè)小瓶貼上標(biāo)簽并稱(chēng)重，用移液管向每個(gè)小瓶中移入1ml保存介質(zhì)。接著每個(gè)小瓶再稱(chēng)重。樣品接著用實(shí)施例7中描述的相同方案冷凍干燥。
冷凍干燥完成后，將小瓶中保存的LDH樣品轉(zhuǎn)移，密封小瓶，并貯存在37℃的恒溫箱中，30℃的恒溫箱中或4℃的冰箱中。
接著定時(shí)測(cè)定樣品的LDH活性。在測(cè)定活性前，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行稱(chēng)重，以測(cè)定水分丟失量，并用丟失的水的量的凈化水(來(lái)自Millipore Corp.的MilliQ System)進(jìn)行再水合。接著用以前討論的相同方法測(cè)定LDH活性。
給定的一系列樣品的結(jié)果列于圖3～5，其中“Z”是磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比。實(shí)施例9重復(fù)實(shí)施例1的過(guò)程。結(jié)果列于下表9中，其中數(shù)字代表再水合時(shí)恢復(fù)的原始活性的百分比。“溶液”柱提供給定的保存介質(zhì)中活細(xì)胞的量，在“單獨(dú)的細(xì)胞”樣品中的活細(xì)胞的量定義為100％。
表9

注1括號(hào)中的數(shù)字表示每摩爾海藻糖的磷酸鹽離子的摩爾數(shù)。2“thio”是1.9％硫代硫酸鈉的縮寫(xiě)。實(shí)施例10制備以摩爾計(jì)，含有7.5％蔗糖或海藻糖和由鉀一磷酸鹽或鉀二磷酸鹽提供的不同量的磷酸鹽離子，將每種混合物25μL密封在鋁差示掃描量熱計(jì)盤(pán)中。接著通過(guò)浸入液氮中將樣品驟冷并負(fù)載到預(yù)冷至-140℃的差示掃描量熱計(jì)中。接著以5℃/min的速率掃描樣品至50℃，測(cè)定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。每個(gè)樣品的結(jié)果如圖6所示。
權(quán)利要求
1.用于保存生物材料的含水保存介質(zhì)，所述保存介質(zhì)包含(a)生物材料；(b)至少一種多羥基化合物，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約5％至約60％；以及(c)磷酸鹽離子，其中介質(zhì)中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.025至約0.625。
2.權(quán)利要求1的含水保存介質(zhì)，其中介質(zhì)的pH為約5至約10。
3.權(quán)利要求1的含水保存介質(zhì)，其中多羥基化合物選自單糖、二糖和多糖。
4.權(quán)利要求3的含水保存介質(zhì)，其中多羥基化合物是海藻糖。
5.權(quán)利要求1的含水保存介質(zhì)，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約10％至約30％。
6.權(quán)利要求3的含水保存介質(zhì)，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約10％至約30％。
7.權(quán)利要求1的含水保存介質(zhì)，其中磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.0375至約0.625。
8.權(quán)利要求1的含水保存介質(zhì)，其中生物材料選自細(xì)胞、蛋白質(zhì)和酶。
9.用于保存生物材料的含水保存介質(zhì)，所述保存介質(zhì)包含(a)生物材料；(b)海藻糖，其中海藻糖的存在量為介質(zhì)重量的約5％至約60％；以及(c)磷酸鹽離子，其中介質(zhì)中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.2至約5。
10.權(quán)利要求9的含水保存介質(zhì)，其中海藻糖的存在量為介質(zhì)重量的約10％至約30％。
11.權(quán)利要求10的含水保存介質(zhì)，其中pH為約5至約10。
12.權(quán)利要求9的含水保存介質(zhì)，其中磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.3至約5。
13.權(quán)利要求9的含水保存介質(zhì)，其中生物材料選自細(xì)胞、蛋白質(zhì)和酶。
14.保存的生物材料組合物的制備方法，所述方法包括(a)形成含水保存介質(zhì)，所述保存介質(zhì)包含(i)生物材料；(ii)至少一種多羥基化合物，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約5％至約60％；和(iii)磷酸鹽離子，其中介質(zhì)中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾數(shù)的摩爾比為約0.025至約0.625；以及(b)用至少一種保存方法保存含水保存介質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中保存方法為選自冷凍、冷凍干燥、環(huán)境空氣干燥、真空干燥和噴霧干燥中的一種或多種方法。
16.權(quán)利要求14的方法，其中介質(zhì)的pH為約5至約10。
17.權(quán)利要求14的方法，其中多羥基化合物選自單糖、二糖和多糖。
18.權(quán)利要求14的方法，其中多羥基化合物是海藻糖。
19.權(quán)利要求14的方法，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約10％至約30％。
20.權(quán)利要求17的方法，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約10％至約30％。
21.權(quán)利要求14的方法，其中磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾數(shù)的摩爾比為約0.0375至約0.625。
22.權(quán)利要求14的方法，其中生物材料選自細(xì)胞、蛋白質(zhì)和酶。
23.保存的生物材料組合物的制備方法，所述方法包括(a)形成含水保存介質(zhì)，所述保存介質(zhì)包含(i)生物材料；(ii)海藻糖，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約5％至約60％；和(iii)磷酸鹽離子，其中介質(zhì)中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.2至約5；以及(b)用至少一種保存方法保存含水保存介質(zhì)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中保存方法是選自冷凍、冷凍干燥、環(huán)境空氣干燥、真空干燥和噴霧干燥中的一種或多種方法。
25.權(quán)利要求23的方法，其中海藻糖的存在量為介質(zhì)重量的約10％至約30％。
26.權(quán)利要求25的方法，其中pH為約5至約10。
27.權(quán)利要求26的方法，其中磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.3至約5。
28.權(quán)利要求23的方法，其中生物材料選自細(xì)胞、蛋白質(zhì)和酶。
29.用于保存生物材料的固體形式的保護(hù)劑混合物，所述保護(hù)劑混合物包含(a)至少一種多羥基化合物，其中混合物中多羥基化合物的總量為混合物重量的約10％至約95％；(b)磷酸鹽離子，其中混合物中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.025至約0.625。
30.權(quán)利要求29的保護(hù)劑混合物，其中混合物中多羥基化合物的總量為混合物重量的約20％至約95％。
31.權(quán)利要求29的保護(hù)劑混合物，其中多羥基化合物選自單糖和多糖。
32.權(quán)利要求31的保護(hù)劑混合物，其中多羥基化合物是海藻糖。
33.權(quán)利要求29的保護(hù)劑混合物，其中磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.0375至約0.625。
34.用于保存生物材料的固體形式的保護(hù)劑混合物，所述保護(hù)劑混合物包含(a)海藻糖，其中混合物中海藻糖的存在量為混合物重量的約10％至約95％；以及(b)磷酸鹽離子，其中混合物中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.2至約5。
35.權(quán)利要求34的保護(hù)劑混合物，其中海藻糖的存在量為混合物重量的約20％至約95％。
36.權(quán)利要求34的保護(hù)劑混合物，其中磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.3至約5。
37.水溶液形式的保護(hù)劑混合物，所述保護(hù)劑混合物包含(a)至少一種多羥基化合物，其中混合物中多羥基化合物的總量為混合物重量的約5％至約60％；(b)磷酸鹽離子，其中混合物中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.025至約0.625。
38.權(quán)利要求36的保護(hù)劑混合物，其中混合物中多羥基化合物的總量為混合物重量的約10％至約30％。
39.權(quán)利要求37的保護(hù)劑混合物，其中多羥基化合物選自單糖和多糖。
40.權(quán)利要求39的保護(hù)劑混合物，其中多羥基化合物是海藻糖。
41.權(quán)利要求37的保護(hù)劑混合物，其中磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.0375至約0.625。
42.水溶液形式的保護(hù)劑混合物，所述保護(hù)劑混合物包含(a)海藻糖，其中混合物中海藻糖的存在量為混合物重量的約5％至約60％；以及(b)磷酸鹽離子，其中混合物中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.2至約5。
43.權(quán)利要求42的保護(hù)劑混合物，其中海藻糖的存在量為混合物重量的約10％至約30％。
44.權(quán)利要求42的保護(hù)劑混合物，其中磷酸鹽離子對(duì)海藻糖的摩爾比為約0.3至約5。
45.由權(quán)利要求14或權(quán)利要求23的方法制備的保存的生物材料組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于保存生物材料的保護(hù)劑混合物，所述保護(hù)劑混合物包含(1)至少一種多羥基化合物，其中當(dāng)混合物是水溶液時(shí)，混合物中多羥基化合物的總量為混合物重量的約5％至約60％，當(dāng)混合物是固體形式時(shí)，多羥基化合物的總量則為約10％至約95％，和(2)磷酸鹽離子，其中混合物中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.025至約0.625。本發(fā)明還涉及保存介質(zhì)，所述保存介質(zhì)含有(1)生物材料，(2)至少一種多羥基化合物，其中介質(zhì)中多羥基化合物的總量為介質(zhì)重量的約5％至約60％，和(3)磷酸鹽離子，其中混合物中磷酸鹽離子的總量為使磷酸鹽離子對(duì)多羥基化合物中羥基基團(tuán)的摩爾比為約0.025至約0.625。本發(fā)明還涉及保存介質(zhì)的保存方法；以及所得到的保存的生物材料組合物。
文檔編號(hào)A01N1/02GK1444442SQ01813325
公開(kāi)日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2001年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月26日
發(fā)明者胡安·J·德帕伯勒, 丹福思·P·米勒, 保羅·B·康拉德, 霍拉肖·科爾蒂 申請(qǐng)人:威斯康星校友研究基金會(huì)