25 μ g/cm2。所述質(zhì)控 線10222上包被的羊抗兔IgG抗體的濃度為0. 25-1. Omg/ml，用量為20 μ l/27-35cm ;所述 檢測線上包被的AFP單克隆抗體和CEA單克隆抗體的濃度均為0. 25-1. Omg/ml，用量均為 20 μl/27-35cm〇
[0025] 所述待檢測抗原AFP為人的血液中的甲胎蛋白AFP，所述待檢測抗原CEA為人的 血液中的癌胚抗原CEA，其中，人的血液中可取全血、血清或血漿。所述標(biāo)記線10221和所 述質(zhì)控線10222之間、所述質(zhì)控線10222和所述AFP檢測線10223之間以及所述AFP檢測 線10223和所述CEA檢測線10224之間的間隔設(shè)置為2mm-5mm。此處，間隔間距的設(shè)置考慮 匹配熒光信號(hào)讀取儀器裝置在后續(xù)檢測中的使用，當(dāng)間隔間距過短時(shí)，儀器無法區(qū)分出AFP 檢測線和CEA檢測線二者發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)間隔間距過長時(shí)，儀器檢 測不到相應(yīng)的熒光信號(hào)，同樣也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾?；诖?，針對(duì)本發(fā)明AFP檢測線10223 和所述CEA檢測線10224之間的間隔設(shè)置為為宜。所述熒光膠乳顆粒的直徑為 0· 1 μηι-1 μπι，受激發(fā)后發(fā)射的波長為180nm-800nm。本實(shí)驗(yàn)中的第一 AFP單克隆抗體與第 二AFP單克隆抗體與待測AFP抗原結(jié)合時(shí)處于不同表位；同樣，第一 CEA單克隆抗體與第二 CEA單克隆抗體與待測CEA抗原結(jié)合時(shí)處于不同表位。
[0026] 所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試紙條可以配合卡殼構(gòu)成試劑盒來使用，例 如，卡殼可以設(shè)置于試紙條10的外圍，卡殼的材質(zhì)可以是塑料的，卡殼的形狀可以是長方 體的，也可以設(shè)計(jì)成別的形狀，但是以匹配試紙條10為前提，卡殼包圍試紙條10,起到保護(hù) 的作用。作為優(yōu)選的實(shí)施例，卡殼上有兩處開孔的地方，一處稱為加樣區(qū)：對(duì)應(yīng)于試紙條10 上的樣品墊1021處，為了方便使用者加樣，卡殼的加樣區(qū)可以設(shè)置有"小雨點(diǎn)"的加樣標(biāo) 識(shí)，防止初次使用者混淆加樣區(qū)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)檢測失?。涣硪惶幏Q為視窗區(qū)：對(duì)應(yīng)設(shè)置于試紙 條10上的包被線區(qū)1022,為了清晰直觀的觀測到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，設(shè)置卡殼方便了使用者 的實(shí)驗(yàn)操作，減少了人為的誤差，提高了檢測結(jié)果的正確率。
[0027] 本實(shí)用新型采用上述技術(shù)方案，帶來的技術(shù)效果為：基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期 檢測試紙條包括底襯以及設(shè)置于底襯上的包被膜，包被膜上依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū) 和吸水紙；包被線區(qū)依次設(shè)置為標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線；標(biāo)記線包括被熒 光膠乳標(biāo)記的第二AFP單克隆抗體、第二CEA單克隆抗體和兔IgG抗體，質(zhì)控線包括羊抗兔 IgG抗體;AFP檢測線和CEA檢測線分別包括能與待檢測抗原AFP特異性結(jié)合的第一 AFP單 克隆抗體和能與待檢測抗原CEA特異性結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體。本實(shí)用新型提供的試 紙條通過AFP與CEA兩項(xiàng)聯(lián)檢，對(duì)于腫瘤發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí)際檢測 結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期，方便了用戶使用。
[0028] 本實(shí)用新型針對(duì)上述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試紙條采用如下制備方法。
[0029] 所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試紙條的制備方法包含以下步驟：
[0030] 將稀釋過的標(biāo)記有第二AFP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有第二CEA單克隆抗體 的熒光膠乳和標(biāo)記有羊抗兔IgG抗體的熒光膠乳，劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成 標(biāo)記線；
[0031] 稀釋兔IgG抗體，并將稀釋過的所述兔IgG抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)， 形成質(zhì)控線；
[0032] 稀釋能與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體，并將稀釋過的所述能 與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成AFP 檢測線；
[0033] 稀釋能與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體，并將稀釋過的所述能 與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成 CEA檢測線；
[0034] 將包被有所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線的包被膜置于烘箱中，進(jìn) 行干燥平衡；
[0035] 將樣品墊和吸水紙依次搭接并粘貼于干燥平衡后的所述包被膜上，所述樣品墊設(shè) 置于所述標(biāo)記線的一端，所述吸水紙?jiān)O(shè)置于所述CEA檢測線的一端；
[0036] 將所述包被膜粘貼于底襯上，形成試紙條。
[0037] 本實(shí)用新型所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試紙條可以配合卡殼構(gòu)成試劑 盒來使用，將卡殼設(shè)置于所述試紙條的外圍，包圍所述試紙條。具體實(shí)現(xiàn)過程在此不再贅 述。
[0038] 在本實(shí)施例中，參照?qǐng)D1和圖2,在標(biāo)記線10221的制備過程中，用熒光稀釋液 稀釋標(biāo)記有第二AFP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有第二CEA單克隆抗體的熒光膠乳和 標(biāo)記有兔IgG抗體的熒光膠乳，劃線于包被膜上形成標(biāo)記線10221 ;其中熒光膠乳標(biāo)記 的第二AFP單克隆抗體和熒光膠乳標(biāo)記的第二CEA單克隆抗體的濃度均為0. 25-1. Omg/ ml，用量均為0· 02-0. 1 μ g/cm2;熒光膠乳標(biāo)記的兔IgG抗體的濃度為0· 25-1. Omg/ml，用 量為0.001-0. 025 μ g/cm2;所述熒光稀釋液中含有1.0% -1.5% BSA，2. 5% -5 %蔗糖， 0· 1% -0· 5% Tween-20,0. 08-0. 1% NaN3,余量為 0· 01-0. 02Μ、ρΗ7· 2 的 PBS ;質(zhì)控線 10222 和檢測線的制備過程中，用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體、能與待檢測抗原AFP特異結(jié) 合的檢測線上的第一 AFP單克隆抗體（購自杭州啟泰生物技術(shù)有限公司）、以及能與待 檢測抗原CEA特異結(jié)合的檢測線上的第一 CEA單克隆抗體（購自Hytest公司），并將稀 釋后的三種抗體分別依次平行地劃線于包被膜上形成質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223和 CEA檢測線10224 ;其中，質(zhì)控線10222包被的羊抗兔IgG抗體（購自Hytest公司）的濃 度為0. 25-1. Omg/ml，用量為20 μ l/27-35cm ;AFP檢測線10223包被的第一 AFP單克隆 抗體（購自Hytest公司）的濃度為0· 25-1. Omg/ml，用量為20 μ l/27-35cm ;CEA檢測線 10224包被的第一 CEA單克隆抗體（購自Hytest公司）的濃度為0· 25-1. Omg/ml，用量為 2(^ 1/27-35〇11;所述包被緩沖液中含有0.08-0.1%似隊(duì)，余量為0.01-0.021、？!17.2的 PBS ;所述標(biāo)記線10221和所述質(zhì)控線10222之間、所述質(zhì)控線10222和所述AFP檢測線之 間以及所述AFP檢測線10223和所述CEA檢測線10224之間的間隔設(shè)置為標(biāo)記 線10221、質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223XEA檢測線10224在包被膜的制備過程中，將包 被好標(biāo)記線10221、質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223、CEA檢測線10224的包被膜置于濕度 〈30%的烘箱，且烘箱的溫度設(shè)定在35-45°C，干燥24-36h后，于2°C -30°C密封干燥平衡7 天以上。在試紙條的制備過程中，將樣品墊1021和吸水紙1023依次搭接并粘貼于干燥平 衡后的包被膜102上，在包被膜102靠近CEA檢測線10224的一端搭接粘貼吸水紙1023,即 可制成試紙條10。
[0039] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光膠乳標(biāo)記抗體的制備步驟為：將常規(guī)方法共價(jià)活 化后的熒光膠乳超聲波200W-400W處理20-30秒后，按照50-200 μ g標(biāo)記抗體/100 μ 1熒 光膠乳的比例加入第二AFP單克隆抗體（購自杭州啟泰生物技術(shù)有限公司）、第二CEA單克 隆抗體（購自Hytest公司）和兔IgG抗體（購自Hytest公司），混勾后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h， 離心洗滌3次，每次10000-15000xg、離心10min，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波IOOW處理 30s，用PBS-TBN恢復(fù)離心前體積，4°C保存，備用。
[0040] 本實(shí)用新型所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試紙條原理是雙抗夾心法；首先 將直徑范圍0.0 lum-L 5um的膠乳與AFP抗體以及各類不同的熒光素共價(jià)結(jié)合形成物質(zhì)A， 然后將直徑范圍0.0 lum-L 5um的膠乳與CEA抗體以及各類不同的熒光素共價(jià)結(jié)合形成物 質(zhì)B，由于膠乳本身具有羧基、氨基等基團(tuán)，當(dāng)物質(zhì)A再與相應(yīng)的AFP抗原結(jié)合，利用熒光素 在激發(fā)光下發(fā)射熒光；同樣，當(dāng)物質(zhì)B再與相應(yīng)的CEA抗原結(jié)合，利用熒光素在激發(fā)光下也 可以發(fā)射熒光。當(dāng)熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP抗體與檢測樣品（例如：血液中的全血、血清或 血漿）中的足夠的AFP抗原結(jié)合形成復(fù)合物Al，