一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗及其應(yīng)用，其制備方法包括以下步驟：(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增J基因型傳染性造血器官壞死病毒表面糖蛋白(Glycoprotein，G)基因的特異性引物對(duì)；(2)利用病毒敏感細(xì)胞系培養(yǎng)IHN病毒分離株，然后提取病毒基因組RNA；(3)采用步驟(1)所得引物對(duì)步驟(2)所得的病毒基因組RNA進(jìn)行一步法RT?PCR擴(kuò)增，將RT?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收產(chǎn)物；(4)將步驟(3)所得的回收產(chǎn)物與pMD19?T simple載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；(5)將步驟(4)鑒定正確的IHNV病毒分離株糖蛋白G基因開放閱讀框部分利用BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建核酸疫苗。CCTCC No. V20162220160415
【專利說明】
一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種中國傳染性造血器官壞死病核酸疫苗、 制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性造血器官壞死?。╥nfectious haematopoietic necrosis，IHN)是由傳染 性造血器官壞死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)引起的一種常 見的危害鮭鱒魚類的急性病毒性傳染病。自從上世紀(jì)50年代在美國首次暴發(fā)以來，IHNV已 經(jīng)擴(kuò)散至歐洲、澳洲、亞洲等十余個(gè)國家。根據(jù)致病毒株、環(huán)境因素、魚齡的不同，IHNV可造 成鮭鱒魚高達(dá)100%的死亡率，對(duì)世界的鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] IHNV屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，諾拉彈狀病毒屬(Novirhabdovirus)的單 股、負(fù)鏈、RNA病毒，全基因組長(zhǎng)度約為llkb，包含六個(gè)基因，分別編碼病毒核蛋白（N)、磷蛋 白（P)、基質(zhì)蛋白（M)、糖蛋白（G)、非結(jié)構(gòu)蛋白（NV)和聚合酶蛋白（L)。糖蛋白是該病毒的表 面蛋白，含有豐富的抗原表位，是該病毒的保護(hù)性抗原，在病毒的免疫反應(yīng)過程中具有重要 的作用。目前根據(jù)G蛋白基因序列將世界范圍內(nèi)的IHNV分為U、M、L、E和J五種基因型。其中， U、M、L基因型主要流行于北美，E基因型流行于歐洲，J基因型流行于亞洲，并分化為J Nagano和J Shizuoka兩個(gè)基因亞型。盡管世界IHNV分離株含有5個(gè)基因型，但是各基因型病 毒株糖蛋白具有較高的核苷酸及氨基酸同源性，其中核酸同源性在94%以上，氨基酸同源 性在93% 以上（Jia，Zheng，Shi，Kan，Wang，He，Zheng，Yu，Lan，Hua，Liu ,Jin ,2014)。盡管各 基因型的IHNV之間糖蛋白同源性很高，但是已有研究表明，不同基因型的IHNV核酸疫苗存 在不同程度的交叉保護(hù)，如免疫M(jìn)基因型IHNV核酸疫苗的受試魚在免疫后28天仍然能夠很 好的阻擋其它基因型的IHNV毒株的攻擊，而免疫U基因型的受試魚在免疫后第28天不能很 好抵抗M基因型的IHNV毒株的攻擊，該結(jié)果說明盡管具有較高的核苷酸及氨基酸同源性，針 對(duì)不同基因型IHNV毒株構(gòu)建的核酸疫苗對(duì)其它基因型的病毒可能不具有同一的保護(hù)性 (Penaranda，Lapatra，Kurath，2011)。而目前關(guān)于IHNV核酸疫苗的系列報(bào)道，主要以M基因 型IHNV毒株糖蛋白構(gòu)建的系列核酸疫苗。并沒有關(guān)于我國J基因型核酸疫苗的相關(guān)報(bào)道，并 且已有研究證明IHNV的進(jìn)化與宿主無關(guān)而與毒株所處的地域相關(guān)（Kurath ,Garver， Troyer ,Emmenegger ,Einer-Jensen ,Anderson，2003)。因此，極有必要研究出針對(duì)我國 IHNV 的疫苗，解決制約我國冷水魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。目前已經(jīng)有很多關(guān)于IHNV核酸疫苗的 研究報(bào)道，并且學(xué)者通過努力將疫苗的最低有效計(jì)量由IOyg/尾減少至I-IOng/尾 (Corbe i I，LaPatra，Anderson，Kurath，2〇00; Garver，LaPatra，Kurath，2〇〇5)。這部分優(yōu)化 工作離不開毒株的篩選及載體構(gòu)建的優(yōu)化工作。但是目前為止，沒有關(guān)于如何優(yōu)化該核酸 疫苗的任何相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]由于上述原因，本發(fā)明以pcDNA3.1為骨架載體，以我國IHNV分離株HLJ-15(黑龍江 省）的糖蛋白核酸序列為目標(biāo)基因，構(gòu)建不同形式的核酸疫苗，旨在篩選出高效穩(wěn)定的核酸 疫苗形式。
[0005] 本研究共涉及三種疫苗株，第一種(G flank)由完整的糖蛋白基因序列及其基因 5'端及3'端非編碼區(qū)部分序列組成，全長(zhǎng)共1682bp;第二種(G+leader)為含有信號(hào)肽的糖 蛋白基因全長(zhǎng)序列，基因長(zhǎng)度為1527bp;第三種(G)為不含有信號(hào)肽的糖蛋白基因全長(zhǎng)序 列，基因長(zhǎng)度為1467bp。已有大量研究資料證明Mx基因的表達(dá)情況可以作為評(píng)價(jià)IHNV核酸 疫苗刺激的魚體非特異性免疫的標(biāo)志，因此本研究利用Mx蛋白表達(dá)情況變化去評(píng)價(jià)所構(gòu)建 的核酸疫苗，然后利用免疫后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)檢測(cè)所構(gòu)建的疫苗免疫保護(hù)效果。
[0006] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗的制備 方法，其包括以下步驟：
[0007] (1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增J基因型傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)表面糖蛋白G基因的特異性 引物對(duì)Fl和F2，或引物對(duì)F3和F4，或引物對(duì)F5和F6;
[0008] 其中 Fl 5' GGATCCCTTTTGTGCTTTGAGACCGAACGCA 3' SEQ ID No. 1 F2 5' CTCGAGGTGCriTCATGTTCGTGTTTATGTC 3' SEQ ID No.2 F3 5' GGATCCATGGACGCCATGATCACCACTCCGC 3' SEQ ID No.3
[0009] F4 5' CTCGAGTTAGGACCTGTTTGCCAGGTGATAC 3' SEQ ID No.4 F5 5' GGATCCCAAACAGTCCCCCCCGACACCGCAA 3'SE〇 ID No.5 F6 5' CTCG AGTTAGG ACCTGTTTGCCAGGTG ATAC 3' SEQ ID No.6
[0010] (2)擴(kuò)增IHNV分離株，然后提取病毒基因組RNA;
[0011] (3)采用步驟（1)所得引物對(duì)步驟(2)所得的病毒基因組RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò) 增，將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收產(chǎn)物；
[0012] (4)將步驟(3)所得的回收產(chǎn)物與PMD19-T simple載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè) 序；
[0013] (5)將步驟(4)鑒定正確的IHNV分離株三種糖蛋白G基因序列利用BamH I和Xho I 酶切位點(diǎn)克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建出核酸疫苗(pGf lank、pGleader和pG)。 [0014]進(jìn)一步地，步驟(2)中擴(kuò)增步驟為將IHNV分離株HLJ-15病毒懸液用細(xì)胞維持液(所 述細(xì)胞維持液為含有2%FBS的MEM培養(yǎng)基)稀釋成HT 5病毒懸液，取Iml接種于單層匯合的 EPC細(xì)胞，于15°C孵育lh，棄去病毒懸液，加入5ml細(xì)胞維持液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于15°C培養(yǎng)； 當(dāng)80%左右細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，收集病毒懸液保存于-80°C冰箱。
[0015] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了前述的制備方法獲得的中國傳染性造血器官壞死病核 酸疫苗。
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病保護(hù)性抗原基因， 其序列為SEQ ID No.9，SEQ ID No.10或SEQ ID No.11。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)方面提供了前述基因的擴(kuò)增引物組合物，其序列為SEQ ID No. 1和 SEQ ID No.2,或?yàn)镾EQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。
[0018]本發(fā)明的一個(gè)方面提供了前述的中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗在預(yù) 防水產(chǎn)動(dòng)物的中國傳染性造血器官壞死病的藥物中的用途。
[0019] 進(jìn)一步地，前述的中國虹鱒傳染性造血器官壞死病是指由J基因型傳染性造血器 官壞死病毒引起的中國傳染性造血器官壞死病。
[0020] 其中，IHNV分離株HLJ-15保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC V201622,保藏日為2016年4月15日。
【附圖說明】
[0021] 圖1為免疫后7天Mx基因表達(dá)水平。
[0022]圖2為免疫后7天攻毒保護(hù)率分析。
[0023]圖3為免疫后14天攻毒保護(hù)率分析。
[0024]圖4為免疫后21天攻毒保護(hù)率分析。
[0025]圖5為免疫后28天攻毒保護(hù)率分析。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)驗(yàn)材料與試劑
[0027] SV Total RNA Isolation System購自Promega;PrimeSc;riptTM One Step RT-PCR Kit Ver2.0試劑盒、pMD19_T simple載體、DNA Marker、0ne StepSYBRSPrimeScript? RT-PCR Kit II(Perfect Real Time)試劑盒、限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司； Irt-Fusion?HD Cloning Kit購自 Clontech公司；IHNV分離株HLJ-15、真核表達(dá)載體 PCDNA3.1為本實(shí)驗(yàn)室分離及保存。EPC細(xì)胞（購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，） Number: CRL-2872 )，質(zhì)粒大量提取試劑盒購自Tiangen生物公司。
[0028] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)與合成
[0029] 根據(jù)GenBank收錄的IHNV表面糖蛋白（glycoprotein，G)的多條基因序列進(jìn)行比 對(duì)，選取表面糖蛋白G基因特異性保守區(qū)段，利用Prime primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增J基 因型IHNV的糖蛋白基因 ，SPSEQ ID No. 1-6。
[0030]根據(jù)卡那霉素基因（Neo)和PCDNA3.1載體序列設(shè)計(jì)用于替換PCDNA3.1載體上氨芐 青霉素抗性基因的引物，即SEQ ID No.7-8。上述序列見表1，引物由哈爾濱博仕生物公司合 成。
[0031 ]表1用于擴(kuò)增J基因型的IHNV糖蛋白G基因的引物序列
[0033] 備注:斜體部分為與pcDNA載體互補(bǔ)的堿基
[0034] SEQ ID No.9:
[0035] pGflank(1682bp)
[0036] CTTTTGTGCTTTGAGACCGAACGCAACTCGCAGAGACCCACCGAAACA
[0037] ATGGACGCCATGATCACCACTCCGCTCATTCTCATTCTAATCACCTGTGGAGCAAACAGCCAAACAGTCCCCCCCGA CACCGCAAGCGAATCAGACCAACCCACCTGGTCAAACCCGCTCTTCACCTACCCCGAGGGATGCACTCTGGACAAAC TCTCCAAGGTCAATGCTTCTCAACTGAGATGCCCAAGGATCTTCGATGATGAGAACAGGGGGCTAATTTCTTATCCC GCCTCCATCCGGTCCCTGATGGTCGGAAACGACCTCGGGGCGATTCACACCCAAGGGAACTACATCCACAAAGTCCT GTACCGCACCATCTGCTCAACAGGGTTCTTCGGGGGTCAGACGATAGAGAAGGTGCTTGTAGAAATGAAACTCTCAA CGAGAGAAGCAGGGTCATATGACACCACAACCGCGGCCGCTCTGTACTTCCCAGCTCCCCGATGCCAATGGTACACC GACAACGTACAAAATGATCTCATCTTCTACTACACAACCCAAAAGAGTGTTCTGAGAGATCCCTACACCAGAGACTT TCTGGACTCAGATTTTGTTGGAGGAAAATGCACTAAATCACCCTGTCAGACTCATTGGTCCAACGTAGTTTGGATTG GTGATGCAGAGATACCAGCCTGTGACGCCAGCCCAGAAATAAACGGTCACCTCTTTGTTGATAGAATCTCCAGTCGA GCCGTGAAGGCAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCGGGCCTGTATGATTGAATTCTGTGGGGGGCA GTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTGGTATCTGTAGGATACAATTCTGGAGCAAAAACCCTCTCTTTCCCGAAGT GTGAGGACAAGACGGTGGGGATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTGCCTATCTAGACGACCTGGTGAAGGCCTCAGAG AGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCATGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCCAAGTT CCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCTATCTATCATGGGATGTGCATGACGG TCGCTGTGGACGAGGTATCCAAGGACAGGACGACGTACAGGGCCCATCACGCCACCAACTTCACTAAATGGGAACGA CCCTTTGGAGATGAGTGGGAAGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACATCACCATTATTCCAGACCTGGAGAAATA CGTCGCCCAGTACAAGATGAGCATGATGGAACCGATGAGCATCAAATCCGTACCCCATCCAAGCATCCTGGCCCTCT ACAATGAGACAGAAGTATCGGGGATCTCCATCAGGAAATTGGACTCTTTCGACCTTCAATCACTCCACTGGAGTTTC TGGCCCACAATCTCCACACTGGGTGGGATTCCCCTGGTTCTCCTCCTTGCTGTTGCCGCGTGCTGCTGCTGGTCAGG GAGACCTCCCACTCCCTCCGCGCCGCAGAGTATCCCCATGTATCACCTGGCAAACAGGTCCTAA
[0038] AGGACCTCAATCTTCACTTCCTCCCCACCAGACAGAAAAAAACGGCACATTTGTGCTGCAAAAAGAGACAATGGACC ACCGCGACATAAACACGAACATGGAGGCAC；
[0039] SEQ ID No.10:
[0040] PGleader(1527 bp)
[0041] ATGGACGCCATGATCACCACTCCGCTCATTCTCATTCTAATCACCTGTGGAGCAAACAGCCAAACAGTCCCCCCCGA CACCGCAAGCGAATCAGACCAACCCACCTGGTCAAACCCGCTCTTCACCTACCCCGAGGGATGCACTCTGGACAAAC TCTCCAAGGTCAATGCTTCTCAACTGAGATGCCCAAGGATCTTCGATGATGAGAACAGGGGGCTAATTTCTTATCCC GCCTCCATCCGGTCCCTGATGGTCGGAAACGACCTCGGGGCGATTCACACCCAAGGGAACTACATCCACAAAGTCCT GTACCGCACCATCTGCTCAACAGGGTTCTTCGGGGGTCAGACGATAGAGAAGGTGCTTGTAGAAATGAAACTCTCAA CGAGAGAAGCAGGGTCATATGACACCACAACCGCGGCCGCTCTGTACTTCCCAGCTCCCCGATGCCAATGGTACACC GACAACGTACAAAATGATCTCATCTTCTACTACACAACCCAAAAGAGTGTTCTGAGAGATCCCTACACCAGAGACTT TCTGGACTCAGATTTTGTTGGAGGAAAATGCACTAAATCACCCTGTCAGACTCATTGGTCCAACGTAGTTTGGATTG GTGATGCAGAGATACCAGCCTGTGACGCCAGCCCAGAAATAAACGGTCACCTCTTTGTTGATAGAATCTCCAGTCGA GCCGTGAAGGCAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCGGGCCTGTATGATTGAATTCTGTGGGGGGCA GTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTGGTATCTGTAGGATACAATTCTGGAGCAAAAACCCTCTCTTTCCCGAAGT GTGAGGACAAGACGGTGGGGATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTGCCTATCTAGACGACCTGGTGAAGGCCTCAGAG AGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCATGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCCAAGTT CCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCTATCTATCATGGGATGTGCATGACGG TCGCTGTGGACGAGGTATCCAAGGACAGGACGACGTACAGGGCCCATCACGCCACCAACTTCACTAAATGGGAACGA CCCTTTGGAGATGAGTGGGAAGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACATCACCATTATTCCAGACCTGGAGAAATA CGTCGCCCAGTACAAGATGAGCATGATGGAACCGATGAGCATCAAATCCGTACCCCATCCAAGCATCCTGGCCCTCT ACAATGAGACAGAAGTATCGGGGATCTCCATCAGGAAATTGGACTCTTTCGACCTTCAATCACTCCACTGGAGTTTC TGGCCCACAATCTCCACACTGGGTGGGATTCCCCTGGTTCTCCTCCTTGCTGTTGCCGCGTGCTGCTGCTGGTCAGG GAGACCTCCCACTCCCTCCGCGCCGCAGAGTATCCCCATGTATCACCTGGCAAACAGGTCCTAA；
[0042] SEQ ID No. 11:
[0043] pG(1467 bp)
[0044] CAAACAGTCCCCCCCGACACCGCAAGCGAATCAGACCAACCCACCTGGTCAAACCCGCTCTTCACCTACCCCGAGGG ATGCACTCTGGACAAACTCTCCAAGGTCAATGCTTCTCAACTGAGATGCCCAAGGATCTTCGATGATGAGAACAGGG GGCTAATTTCTTATCCCGCCTCCATCCGGTCCCTGATGGTCGGAAACGACCTCGGGGCGATTCACACCCAAGGGAAC TACATCCACAAAGTCCTGTACCGCACCATCTGCTCAACAGGGTTCTTCGGGGGTCAGACGATAGAGAAGGTGCTTGT AGAAATGAAACTCTCAACGAGAGAAGCAGGGTCATATGACACCACAACCGCGGCCGCTCTGTACTTCCCAGCTCCCC GATGCCAATGGTACACCGACAACGTACAAAATGATCTCATCTTCTACTACACAACCCAAAAGAGTGTTCTGAGAGAT CCCTACACCAGAGACTTTCTGGACTCAGATTTTGTTGGAGGAAAATGCACTAAATCACCCTGTCAGACTCATTGGTC CAACGTAGTTTGGATTGGTGATGCAGAGATACCAGCCTGTGACGCCAGCCCAGAAATAAACGGTCACCTCTTTGTTG ATAGAATCTCCAGTCGAGCCGTGAAGGCAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCGGGCCTGTATGATT GAATTCTGTGGGGGGCAGTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTGGTATCTGTAGGATACAATTCTGGAGCAAAAAC CCTCTCTTTCCCGAAGTGTGAGGACAAGACGGTGGGGATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTGCCTATCTAGACGACC TGGTGAAGGCCTCAGAGAGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCATGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCA TACCTCCTATCCAAGTTCCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCTATCTATCA TGGGATGTGCATGACGGTCGCTGTGGACGAGGTATCCAAGGACAGGACGACGTACAGGGCCCATCACGCCACCAACT TCACTAAATGGGAACGACCCTTTGGAGATGAGTGGGAAGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACATCACCATTATT CCAGACCTGGAGAAATACGTCGCCCAGTACAAGATGAGCATGATGGAACCGATGAGCATCAAATCCGTACCCCATCC AAGCATCCTGGCCCTCTACAATGAGACAGAAGTATCGGGGATCTCCATCAGGAAATTGGACTCTTTCGACCTTCAAT CACTCCACTGGAGTTTCTGGCCCACAATCTCCACACTGGGTGGGATTCCCCTGGTTCTCCTCCTTGCTGTTGCCGCG TGCTGCTGCTGGTCAGGGAGACCTCCCACTCCCTCCGCGCCGCAGAGTATCCCCATGTATCACCTGGCAAACAGGTC CTAA0
[0045]實(shí)施例2病毒的擴(kuò)增及RNA制備
[0046] 將病毒分離株IHNV HLJ-15病毒懸液用細(xì)胞維持液(含有2%FBS的MEM培養(yǎng)基)稀 釋HT5倍，取Iml接種于單層匯合的EPC細(xì)胞，于15°C孵育lh，棄去病毒懸液，加入5mL正常細(xì) 胞維持液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于15°C培養(yǎng)。當(dāng)80%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（(：襯叩 &讓& effect，CPE)時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液（即病毒懸液）。取250yL病毒懸液于無 RNA酶的離心管中。 12 OOOg離心5min，去除沉淀。按照SV Total RNA Isolation System說明書提取病毒基因 組RNA。提取后的RNA分裝于-80°C備用。其中，IHNV分離株HLJ-15保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC V201622，保藏日為2016年4月15日。
[0047]實(shí)施例3糖蛋白基因的擴(kuò)增
[0048]按照一步法RT-PCR試劑盒說明書，分別利用引物表中的引物對(duì)進(jìn)行目的基因的擴(kuò) 增。RT-PCR 擴(kuò)增程序：50°C 預(yù)反應(yīng) 30min，94°C 預(yù)變性 5min，94°C 變性 lmin，50°C 退火 lmin，72 °C延伸2min，循環(huán)數(shù)30，72 °C終延伸IOmin。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回 收，回收產(chǎn)物與PMD19-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大 培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
[0049] 實(shí)施例4核酸疫苗的構(gòu)建及制備
[0050] 分別將測(cè)序獲得的各目的糖蛋白基因利用BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)克隆到真核表 達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建核酸疫苗pGflank、pGleader和pG。利用質(zhì)粒大量提取試劑盒制備 上述核酸疫苗。
[0051] 實(shí)施例5核酸疫苗保護(hù)效果測(cè)定
[0052] 將1.7 ± 0.5g虹鱒隨機(jī)分組，每組50尾，暫養(yǎng)水溫維持在（14 ± I) °C的循環(huán)水池 (60cmX6〇CmX5〇Cm)中，7d后進(jìn)行核酸疫苗的注射免疫(注射位置為背鰭基部），試驗(yàn)前禁 食2d。核酸疫苗的免疫劑量按2yg/尾，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1 (2yg/尾）陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組 (50μ!7尾磷酸鹽溶液）。于免疫后7、14、21、28天按照如下方式進(jìn)行攻毒試驗(yàn):利用養(yǎng)魚的水 將IHNV HLJ-15分離株濃度調(diào)整為IO4PFlVml，然后將虹鱒分別置于病毒溶液中2h，其間利 用氧氣栗不間斷的充氧，同時(shí)控制水溫為14± 1°C。攻毒試驗(yàn)結(jié)束后將各組虹鱒重新置于循 環(huán)水池內(nèi)暫養(yǎng)。連續(xù)3周內(nèi)記錄各實(shí)驗(yàn)組虹鱒發(fā)病及死亡情況。該疫苗保護(hù)率評(píng)價(jià)試驗(yàn)為三 次獨(dú)立重復(fù)研究的綜合結(jié)果。
[0053]實(shí)施例6核酸疫苗抗性基因的替換及其免疫保護(hù)率分析
[0054]為了證明核酸疫苗載體上的抗性基因?qū)σ呙绫Ｗo(hù)效果沒有影響，本發(fā)明還通過改 變載體上的抗性基因進(jìn)行疫苗的多元化應(yīng)用，本研究將篩選出的效果最穩(wěn)定的核酸疫苗株 進(jìn)行抗性基因替換。
[0055]以實(shí)施例1中的SEQ ID No.7-8對(duì)用于替換pcDNA3.1載體上氨芐青霉素抗性基因 進(jìn)行擴(kuò)增，利用In-FusioniOHD Cloning Kit，按照試劑盒操作說明書，將卡那霉素抗性基因 Neo替換pcDNA3.1中的氨芐青霉素抗性基因，構(gòu)建出具有卡那霉素抗性的核酸疫苗 pGf I ank-Kan。同時(shí)按照實(shí)施例5中的攻毒方法對(duì)該pGf I ank-Kan核酸疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)效 果分析。
[0056] 實(shí)施例7Mx-l表達(dá)情況的Real-time PCR分析
[0057]按照實(shí)施例5所述的方式對(duì)虹鱒進(jìn)行免疫，于免疫后7天采集虹鱒頭腎樣本，利用 RNA提取試劑盒提取頭腎總RNA，利用One StepSYBR^PrimeScript? RT-PCR Kit II進(jìn)行 Mx-1的定量分析。對(duì)照組為注射pcDNA3.1載體的虹鱒。每組頭腎樣本為10尾虹鱒頭腎混合 樣本。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0059] UMx表達(dá)情況分析
[0060] 為了檢測(cè)所構(gòu)建的疫苗的免疫原性，于免疫后第7天采集免疫虹鱒頭腎進(jìn)行Mx基 因表達(dá)水平的Real time-PCR定量檢測(cè)(參見附圖1)。以只免疫真核載體pcDNA3.1的虹鱒樣 本作為陰性對(duì)照，將該對(duì)照組Mx基因表達(dá)水平設(shè)置為1。結(jié)果顯示在免疫后第7天，pGflank 組的虹鱒頭腎中Mx基因表達(dá)水平最高，是對(duì)照組的90倍左右;pGleader和pG免疫組的虹鱒 頭腎中Mx基因表達(dá)水平顯著低于pGflank組，但是仍然顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組表達(dá)水平 的30倍左右。該結(jié)果說明本研究所構(gòu)建的疫苗均具有相應(yīng)的免疫原性，能夠刺激虹鱒產(chǎn)生 非特異性免疫應(yīng)答。
[0061] 2、保護(hù)率比較分析
[0062]為了比較所構(gòu)建的三種疫苗的保護(hù)效果，于免疫后的7、14、21、28進(jìn)行攻毒試驗(yàn) (參見附圖2-5)。以只注射pCDNA3.1載體的虹鱒為對(duì)陰性照組。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有的核 酸疫苗對(duì)IHNV強(qiáng)毒攻擊均表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用，其中pGflank免疫組具有最高的相對(duì)存 活率，均在90 %以上，pGleader免疫組與pG免疫組的存活率明顯低于pGflank免疫組，其中 pGleader免疫組的平均存活率為82%，pG免疫組的存活率約為對(duì)照組的累計(jì)存活率僅為 78%，陰性對(duì)照組虹鱒的平均存活率僅為4%。該結(jié)果說明pGf lank是最佳的疫苗形式，具有 穩(wěn)定的高效的保護(hù)效果。
[0063] 3、卡那霉素抗性的核酸疫苗pGf Iank-Kan保護(hù)效果
[0064]于免疫后的7、14、21、28進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，以只注射含有卡那霉素抗性基因的 pcDNA3.1載體的虹鱒為陰性對(duì)照組。結(jié)果顯示，pGf Iank-Kan對(duì)IHNV強(qiáng)毒攻擊同樣表現(xiàn)出良 好的保護(hù)作用，存活率均能達(dá)到90%以上，而陰性對(duì)照組存活率僅為2%，結(jié)果如表2所示。 該結(jié)果說明該疫苗載體中的抗性基因?qū)σ呙绲谋Ｗo(hù)效果沒有影響，在后續(xù)的應(yīng)用中可根據(jù) 不同的情況與要求來更改該疫苗載體的抗性基因。
[0065]表2 pGflank-Kan疫苗免疫保護(hù)效果分析
[0067] 參考文獻(xiàn)
[0068] Corbei I，S·，LaPatra，S.E.，Anderson，E.D.，Kurath，G·，2000·Nanogram quantities of a DNA vaccine protect rainbow trout fry against heterologous strains of infectious hematopoietic necrosis virus.Vaccine.18,2817-2824.
[0069] Garver,K.A.,LaPatra,S.E.,KurathjG.,2005.Efficacy of an infectious hematopoietic necrosis(IHN)virus DNA vaccine in Chinook Oncorhynchus tshawytscha and sockeye O.nerka salmon.Diseases of aquatic organisms.64,13-22.
[0070] Jia，P.，Zheng，X.C.，Shi，X.J.，Kan，S.F.，WangJ.J.，HeJ.Q.，Zheng，W.，Yu，L.， LanjW.S.,HuajQ.Y.,LiujH.,JinjN.Y.,2014.Determination of the complete genome sequence of infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV)Ch20101008and viral molecular evolution in China.Infection,genetics and evolution: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases.27, 418-431.
[0071] KurathjG.,GarverjK.A.,Troyer,R.M.,Emmenegger jE-J.,Einer-JensenjK., Anderson,E.D.,2003.Phylogeography of infectious haematopoietic necrosis virus in North America.The Journal of general virology.84,803-814.
[0072] Penaranda，M·M·，Lapatra，S·E·，Kurath，G·，2011.Specificity of DNA vaccines against the U and M genogroups of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).Fish&shellfish immunology.31,43-51. SEQUENCE LISTING <110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 <120> -種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗及其應(yīng)用 <160> II <17Q> PatentIn version 3.3
[0073] <21?)> I <211> 31 <2i2> DNA <2:13>人工序列 <M)i)> 1 ggatcccttt tgtgGtttga gaecgaacge a 31 <2i()> 2 <21l> 31 <2Ι2> 1)ΝΛ <213> 人工序列 <400> 2 ctcgaggtgc ctccatgttc gtgtltatgt c 31 <2i()> 3 <21 卜 31 <2I2> DNA <213> 人工序列 <400> 3 ggatccatgg acgccatgat： caeeactceg G 31 <2iU> 4 <21 I> 31 <112> [)ΝΛ <213> 人工序列 <400> 4
[0074] ctcgagttag gacctgtttg ccaggtgata.c 31 <210> 5 <21 I> M <2Ι2> DNA <213>人工序列 <400> 5 ggatcceaaa cagtcc：cecc：cgaca：ccgca. a 31 2I()'、6 <2131 <2i2> DN1A <213>人工序列 <400> 6 ctcgagttag gacctgtttg ccaggtgata c 31 <2?()> 7 <211> 50 <212、DNA <21、3>人丁序:列 <400> 7 ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatfctc cgtgtcgccc 50 <210> 8 <211> 50 <2\?> [)ΝΛ <213> 人工序列 <400> 8 tiggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcaect atetcagcga 50 <210 P <2!l> I6H2 DNA <213> 人工序列. <400> ；9 Cttttgtgct ttgagaccga acgcaactcg cagagaccca ccgaaacaat ggacgccatg 60
[0075] atcaccactc： cgctcattct ：Cattctaate acctgtggag caaaeagcca aacagtccec 120 cccgacaccg caagcgaatc. agaeeaaccc acctggtcaa acccgetctt caectacccc： 180 gagggatgca ctctggacaa actctccaag gtcaatgctt ctcaactgag atgcccaagg 240 atcttcgatg atgagaacag ggggctaatt tcttatcccg cctccatceg gtoectgatg 300 gteggaaacg: acctcggggc gatfcacacG eaagggaact acatccacaa agtcctgtac 360 cgcaccatct gctcaacagg gttcttcggg ggtcagacga tagagaaggt gcttgtagaa 420 atgaaactet caaegagaga agcagggtca tatgacacca caaccgcggc Ggetctgtae： 480 ttcGcagctc cccgatiiccii ciT^tacaCC gacaacgrac uaaatgatct oatcttctac ,540 tacacaacGc aaaagagtgt tetgagagat ccctacacca gagae-tttct ggactcagat 600 tttgttggag gaaaatgcac taaatcacce tgtcagactc attggtccaa cgtagtttgg: 660 attggtgatg cagagatacc agcctgtgac gccagcccag aaataaacgg tcacctcttt 720 gttgatagaa tctceagtcg agecgtgaag gcaacgagct acggaeacca cecetgggga 780 ctgcatcggg GCtgtatgat tgaattctgt ggggggcagt ggatacggac agaMcggt 840 gacctggtat ctgtaggafa caatictgga gcaaaaaccc tctctttccc gaagtgtgag 90() gacaagacgg tggggatgag gggaaacttg gatgncittg cxtatctaga cgacctggtg 960 i i c.ig agagcagaga ggaatgtctt gaggcgcntg ccgagataat atcaacaaae 1D2D egtgtgaetc catacctcel: atcGaagitc egatctecae atceegg￡iat aaatgacgtc 1080 tacgctatgc acaaaggctc tatctatcat gggatgtgca tgacggtcgc tgtggacgag 1140 gtatccaagg acaggacgac gtacagggcc catcacgcca ccaacttcac taaatgggaa 1200 cgaccctttg gagatgagtg ggaaggcttt caeggattgc acggaaacaa catcaeGatt 1260 attccagacc tggagaaata cgtcgcecag tacaagatga geatgatgga accgatgagc： 13 2() atcaaatccg taccccatcc aagcatcctg gccctctaca atgagacaga agtatcgggg 1380 atctccatca ggaaattgga ctctttcgac cttcaatcac tccactggag tttctggccc 1440
[0076] acaatctcca cactgggtgg gattcccctg gttetcctce ttgctgttgc cgcgtgctgc 1500 tgctggtpag ggagacctcc cactccctcc gcgccgqaga gtatGcecat gt這tcacctg 1560 gcaaacaggt cctanaggac ctcaatcttc acttcctccc caccagacag aaanaaacgg 1620 eacatttgtg ctgcaaaaag agacaatgga ccaecgcgac ataaacacga acatggaggc 1680 m 1682 <21 ()> 10 <21 I> 1527 <2i2> DNA <2丨3>人工序列 <400> 10 atggacgcca tgatcaccac tccgctcatt ctcattctaa tcacctgtgg agcaaacagc 60 caaacagtcc ccccxgticac cgcaagcgmi tcagaccaac ccaccrggrc iK-uicccgctc 12() ttcacctaec ccgagggatgcactctggac aaaeteteca aggtGaatgc ttcteaactg 180 agatgcccaa ggaicttcga tgatgagaac agggggctaa tttcttatcc cgccteeatc. 240 eggtccctga tggtcggaaa pg^ccteggg gcgattcaca cceaagggaa ctacatccac 300 aaagtcctgt accgcaccat ctgctcaaca gggttcttcg ggggtcagac gatagagaag 360 gtgcttgtag aaatgaaaet cteaacg^ga gaagcagggt catatgacac CacitiKXgcj-t 4：2:0 gcegetGtgt acttcecagc tccccgatgc caatggtaea ccgacaacgt aeaaaatgat 480 ctcatcttct actacacaac ccaaaagagt gttctgagag atccctacac cagagacttt MO ctggactcag attttgttgg aggaaaatgc actaaatcac cctgtcagac tcattggtcc 600 aacgtagttt ggattggtga tgeagagata ceagc-Gtgtg acgccagccc agaaataaac 660 ggtcacctct ttgttgatag aatctccagt cgagccgtga aggcaacgag ctaeggacac 720 cacccctggg gactgcatcg ggcctgtatg attgaattct gtggggggca gtggatacgg 7SO acagatetcg gtgaeetggt atetgtagga tacaattctg gagcaaaaac cctatetttc 840
[0077] ccgaagtgtg aggacaagac ggtggggatg aggggaaact tggatgactt tgcctatcta 900 gacgacctgg tgaaggcctc agagagi:aga gaggaatgtc ttgagi?cgca tgccgaguta 960 atatcaaeaa acagtgtgac tccataccte ctatccaagt t^iDgatctcc acatccegga 1020 ataaargacg tctacgctat gcacaaaggc tctatctatc atgggatgtg catgacggtc 1080 gctgtggacg aggratccaa ggacaggaeg aGgtaoaggg cecatcaegc caecaacttc 1140 aetaaatggg aaegaceeft tggagatgag tgggaagggt tteacgggrtt gcaeggaaac 1200 aacatcacca ttattccaga cctggagaaa tacgtcgccc agtacaagat gagcatgatg 1260 gaaccgatga gcatcaaatc cgtaecccat ccaagcatce tggcectcta caatgagaca 1320 gaagtatcgg ggatetccat eaggaaattg： gaetettteg aecttcaatc mtccmtgg 1380 agtttetggc ccacaatctc eacactgggt gggattccce tggttcteet cettgctgtt 1440 gccgcgtgct gctgctggtc agggagacct cccactccct ccgcgccgca gagtatcccc 1500 atgtatcaCc tggcaaacag gtcctaa '1527 丨()> 11 <2\\> 1467 <2]2> DNA 人工序列 <400> 11 caaacagtec eccccgacae egcaagegaa teagaccaac ccacctggtc aaacecgctc 60 itcacctacc ccgaggga.tg cactciggac aaactGtoca aggteaatgc ilctcaactg 120 agatgcccaa ggatcttcga tgatgagaac agggggctaa tttcttatcc cgcctccatc 180 cggtccctga tggtcggaaa cgacctcggg gcgattcaca cccaagggaa ctacatccac 240： aaagtectgt acGgeaeeat etgctcaaoa gggttcttcg ggggtcagaG gatagagaag 300 gtgcttgtag aaatgaaaet Gteaacgaga gaagcagggt catatgacac cacaaccgcg 360 gccgctctgt acttcccagc tccccgatgc caatggtaca ccgacaacgt acaaaatgat 420 ctCatcttct aCtacacaai： c-eaaaagagt gttetgagag atcectacaC Gagagacttt 480
[0078] ctggactoag attitgttgg aggaaaatgc actaaatcac cctgtcagac tcattggtcc 540 aacgtagttt ggattggtga tgcagagata ccagcctgtg acgccagccc agaaataaac 600 ggtcacctet ttgttgatag aatctecagt egagccgtga aggeaaegag etacggacae 660 cacccctggg gactgcatcg ggcctgtatg attgaattct gtggggggca gtggatacgg 720 acagatcteg gtgacctggt atctgtagga tacaattctg gagcaaaaac cctctctttc 780 ccgitiigtgfg iiggiiciuigiic ggt^gggittg n^gg^iiaaci tggatgaett tgcetatcta： 840 gacgacctgg tgaaggcctc agagagcaga gaggaatgtc ttgaggcgca tgccgagata 9U〇 atatcaacaa acagtgtgac tccatacctc ctatccaagt tccgatctee acatcecgga 960 ataaatgacg tctacgctat gcaeaaaggc tctatctatG atgggatgtg eatgacggic 1020 gctgtggacg aggtiitecaa ggacaggacg acgtaoaggg ccGatcaiSgG caceaiiettG I 〇SD actaaatggg aacgaccctt tggagatgag tgggaaggct ttcacggatt gcacggaaac 1140 aacatGacea ttattecaga cetggagaaa tacgtcgccc agtacaagat gagcatgatg 1200 gaacegatga gcatcaaatc cgtaccccat ccaagcatcc tggccctcta caatg^gaca 1260 gaagtatcgg ggatctccat caggaaattg gaetctttcg accttcaatc actceaetgg 1320
[0079] agtttctggc ccacaatctc cacactgggt gggattcccc tggttctcct ccttgctgtt 1380 gccgcgtgct gctgctggtc agggagacct cccactccct ccgcgccgca gagtatcccc 1440 atgtatcace tggcaaaeag gtcetaa 1467
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗的制備方法，其包括以下步驟： (1) 設(shè)計(jì)擴(kuò)增J基因型傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)表面糖蛋白基因的特異性引物 對(duì)F1和F2，或引物對(duì)F3和F4，或引物對(duì)F5和F6; 其中 F1 5' GGATCCCTrnTGTGCTTTGAGACCGAACGCA 3' SEQ 丨DNo.l F2 5' CTCGAGGTGCCTCCATGTTCGTG丁TTATGTC 3' SEQ ID No.2 F3 5' GGATCCATGGACGCCATGATCACCACTCCGC 3' SE〇 ID No.3 F4 5' CTCGAGTTAGGACCTGTTTGCCAGGTGATAC 3' SEQ ID No.4 F5 5' GGATCCCAAACAG丁CCCCCCCGACACCGCAA 3' SEQ ID No.5 F6 5' CTCGAGTTAGGACCTGTTTGCCAGGTGATAC 3' SEQ ID No.6 (2) 擴(kuò)增IHNV分離株，然后提取病毒基因組RNA; (3) 采用步驟⑴所得引物對(duì)步驟⑵所得的病毒基因組RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，將 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收產(chǎn)物； (4) 將步驟(3)所得的回收產(chǎn)物與pMD19-T simple載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序； (5) 將步驟(4)鑒定正確的IHNV病毒分離株糖蛋白G基因開放閱讀框部分利用BamH I和 Xho I酶切位點(diǎn)克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建核酸疫苗pGflank、pGleader或pG; 其中，IHNV分離株的保藏編號(hào)為CCTCC No.V201622; 優(yōu)選地，特異性引物對(duì)選自F1和F2。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(2)中擴(kuò)增步驟為將IHNV分離株HLJ-15懸 液用細(xì)胞維持液(所述細(xì)胞維持液為含有2%FBS的MEM培養(yǎng)基)稀釋成10- 5病毒懸液，取lml 接種于匯合的單層EPC細(xì)胞，于15°C孵育lh，棄去孵育液，加入正常細(xì)胞維持液于細(xì)胞培養(yǎng) 瓶?jī)?nèi)，于15°C培養(yǎng);當(dāng)80%左右細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，收集病毒懸液保存于-80°C冰箱。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或所述的制備方法獲得的中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫 苗。4. 一種中國虹鱒傳染性造血器官壞死病保護(hù)性抗原基因，其序列為SEQ ID No.9或SEQ ID No. 10,或SEQ ID No. 11，優(yōu)選為SEQ ID Νο·9。5. -種權(quán)利要求1所述基因的擴(kuò)增引物組合物，其序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2， 或?yàn)镾EQ ID No.3和SEQ ID No.4,或?yàn)镾EQ ID No.5和SEQ ID No.6。6. 權(quán)利要求3所述的中國虹鱒傳染性造血器官壞死病核酸疫苗在預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物的中國 傳染性造血器官壞死病的藥物中的用途。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的中國虹鱒傳染性造血器官壞死病是指由J基 因型傳染性造血器官壞死病毒引起的中國傳染性造血器官壞死病。
【文檔編號(hào)】C07K14/08GK105861450SQ201610312918
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】徐黎明, 盧彤巖, 趙景壯, 劉淼, 曹永生
【申請(qǐng)人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所