限靈敏度為1.0xl(T6ngAil。
[0034] 實施例6疫苗樣本檢測疫苗樣本檢測
[0035]以疫苗半成品，成品作為待檢標(biāo)本，分別用DNA提取液煮沸法提取標(biāo)本基因組DNA 后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴增體系檢測，結(jié)果表明本試劑盒可以很靈敏的檢測出疫苗樣 品中的MDCK細胞殘留DNA。
[0036] 實施例7MDCK細胞DNA參考品定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及實時定量PCR方法的建立 [0037]用MDCK DNA參考品的稀釋倍數(shù)的log值對每個稀釋樣品的CT(初始循環(huán)數(shù))值作 圖，兩者呈遞減的線性關(guān)系，是為MDCK細胞DNA參考品定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0038]實時定量PCR方法實驗體系的確立及優(yōu)化。基于TaqMan探針的qPCR反應(yīng)含有如下 成分:PCR反應(yīng)液、模板、引物、探針，含有緩沖液、DNA聚合酶和dNTPs的PCR反應(yīng)液可以從多 個廠家購買，引物濃度，探針濃度依據(jù)反應(yīng)的擴增效率摸索。TaqMan實驗要特別注意溫度條 件，常用的TaqMan實驗用二步法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的變性、退火、延伸三步PCR循環(huán)。二步法:第一步 為變性，第二步為退火和延伸合并，溫度為55-60°，這確保引物在延伸時探針保持與目標(biāo)序 列的結(jié)合。通常，將TaqMan探針設(shè)計在其Tm在60-70°之間。優(yōu)化的TaqMan實驗具有高的靈敏 度和特異性，以及在寬的動態(tài)范圍內(nèi)良好的擴增效率。用梯度稀釋的已知濃度模板濃度擴 增結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用這條遞減直線的R2或r值來確定擴增效率。反應(yīng)效率應(yīng)在90%--105 %之間，R2大于0.980或r大于0.99，且重復(fù)樣本CT值相近。如果實驗?zāi)軡M足上述各項要 求，實驗可以馬上開始。如果實驗不能滿足上述各項要求，建議實驗操作者重新設(shè)計引物和 TaqMan探針。需要注意的是：用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板濃度范圍內(nèi)必須涵蓋全部待測樣本模 板濃度，使得待測樣本模板的擴增結(jié)果在實驗的動態(tài)范圍內(nèi)，如果待測樣本反應(yīng)結(jié)果在標(biāo) 準(zhǔn)曲線的動態(tài)范圍之外，必須進行下面三步的調(diào)整：1構(gòu)建覆蓋待測樣本模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，分析并確保在新的動態(tài)范圍內(nèi)的線性2如果待測樣本的CT值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線上最高濃度 的標(biāo)準(zhǔn)品的CT值，稀釋待測樣本后重做實驗3如果待測樣本的CT值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上最高濃 度的標(biāo)準(zhǔn)品的CT值，增加待測樣本后重做實驗。
[0039] 實施例8特異性驗證
[0040] 分別將Vero細胞DNA、CH0細胞DNA、R-D細胞DNA做稀釋，以稀釋的DNA作為樣品，按 確定的方法進行檢測，考察所建方法與幾種宿主細胞DNA的交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，與Vero細 胞DNA、CH0細胞DNA、R-D細胞DNA稀釋樣品均無交叉反應(yīng)。說明該方法只針對MDCK細胞，特異 性高。
[0041 ] 實施例9準(zhǔn)確度、精密度和適用性驗證以及穩(wěn)定性試驗
[0042]準(zhǔn)確度，按照制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法配制高（1 n g / μ 1)、中（0.1 n g / μ 1)、低 (O.Olng/μΙ)三個濃度的細胞基質(zhì)流感疫苗的稀釋樣品，每個濃度配制6份，每份樣品設(shè)復(fù) 孔，在不同日測定中復(fù)測5次，計算回收率。
[0043]精密度，按照制備校正曲線的方法配制成低、中、高（l(T6ng .μLΛ?οΛ^ ·μ1' 10_2ng · μΓ1)三個濃度細胞基質(zhì)流感疫苗的稀釋樣品，并按確定的檢測方法每個濃度在同 一八連管內(nèi)測定3孔，在不同日不同測定中重復(fù)測定3次，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程計算出 的濃度為細胞基質(zhì)流感疫苗的稀釋樣品的檢出量，分別計算板間精密度和板內(nèi)精密度。 [0044]制備的全基因組DNA參考品在-20 °C下保存，設(shè)計的探針與引物濃度組合MIX在-20 °C下保存，每周分別取出一份參考品，按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法配制10倍梯度稀釋的樣品， 按確定的方法檢測，考察-2 0 °C保存下參考品的穩(wěn)定性。觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)、擴增效 率以及樣本的重復(fù)性。 SEQUENCE LISTING <no>武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司 <12僅> 檢測疫苗中MDCK細胞DNA殘留的試劑盒 <160> 3 <170> Patentln version 3 .3 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列
[0045] <400> 1 gagacatagg cagagggaga ag 22 <210 2 <211> 19 <212> DNA <2.13>人工序列 <400> 2 gatcctggag acUpggat 19 <210> 3 <21?> 21
[0046] <212> DNA <213.>人工序列 <400> 3 caggctccai gcaccaggag c 21
【主權(quán)項】
1. 一種試劑盒，其特征在于，包括引物組;所述引物組包括具有如SEQ ID No. 1所示的 上游引物和具有如SEQ ID No.2所示的下游引物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括如SEQ ID No.3所示的探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，引物濃度為0.2-0.3μπι〇1/1，探針濃度為 0·40-0·60ymol/l〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR緩沖液、脫氧三磷 酸核苷混合物和DNA聚合酶中的一種或兩者以上的混合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的試劑盒在檢測MDCK細胞DNA殘留的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述MDCK細胞DNA殘留為疫苗中的MDCK細 胞DNA殘留。7. 非診斷和非治療目的的、基于如權(quán)利要求1至4任一項所述的試劑盒的檢測MDCK細胞 DNA殘留的方法，其特征在于，取待測樣品經(jīng)預(yù)處理后，提取核酸，擴增，判斷是否具有DNA殘 留。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述樣品為疫苗。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，擴增的反應(yīng)溫度和時間為：95°C預(yù)變性 30s;然后 95 °C 5s，60 °C 34s，40 個循環(huán)。
【專利摘要】檢測疫苗中MDCK細胞DNA殘留的試劑盒，具體涉及一種試劑盒，其特征在于，包括引物組；所述引物組包括具有如SEQ？ID？No.1所示的上游引物和具有如SEQ？ID？No.2所示的下游引物。通過熒光PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)擴增，從而達到快速，定量檢測靶多核苷酸的目的。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648102
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】彭燕, 黃曉媛, 張家友, 楊曉明
【申請人】武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月29日