檢測疫苗中mdck細胞dna殘留的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種微量DNA檢測方法，具體涉及一種檢測疫苗中MDCK細胞的方法。
【背景技術】
[0002] MDCK細胞是一種狗腎(ATCC-CCL34)細胞系的傳代細胞，具有許多優(yōu)點：病毒感染 效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細胞系(MDCK Cell Lines)被公認為最適于甲、乙型流感 病毒疫苗生產(chǎn)的3種細胞系之一。然而，用傳代細胞株生產(chǎn)疫苗的一個重要問題是其安全 性，表現(xiàn)為具潛在致瘤性的殘留細胞DNA。因此WHO對精制疫苗中殘留的DNA有嚴格限制，如 WHO規(guī)定精制MDCK細胞流感疫苗中殘余DNA含量不超過10ng/劑量(相當于10ng/ml)。殘余 MDCK細胞DNA含量是基于MDCK細胞生產(chǎn)的精制疫苗的主要質(zhì)量控制指標之一，必須進行嚴 格檢定并純化，使含量不能高于規(guī)定標準。
[0003] 由于DNA殘留含量非常低，需要采用較敏感的核酸雜交技術。而目前用于檢測疫苗 殘留DNA的方法主要是分子雜交法，如利用隨機引物法，用地高辛標記MDCK細胞DNA，并制備 成DNA探針，以此探針與待測樣品總DNA以及已知濃度的參比樣品DNA在硝酸纖維膜上進行 點雜交，最后通過顯色信號強度來判斷樣品中DNA含量。
[0004] 與分子雜交法相比，taqman PCR技術應用于定量檢測中具有如下優(yōu)點：通過對擴 增曲線以及對數(shù)增長期的循環(huán)閾值(ct)的分析，摒棄分子雜交法受多種因素干擾的終點分 析法，能夠?qū)Υ郎y樣品進行準確定量分析，從而有效監(jiān)測疫苗純化的效果;將DNA擴增與檢 測過程融為一體，可以實時、動態(tài)監(jiān)測DNA擴增的全過程，省掉了分子雜交后處理過程，大大 縮短了結果分析時間，使得該方法更加快捷，方便；由于在普通PCR基礎上增加了一條可與 模板互補配對的熒光探針，有效結合了 PCR和探針雜交的雙重特異性，進一步提高了檢測目 標靶多核苷酸的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種使用實時熒光PCR技術來定性與定量檢測MDCK細胞DNA 的試劑盒，特別是本試劑盒可用于檢測疫苗樣品中MDCK細胞殘留DNA，從而對疫苗生產(chǎn)過程 中進行質(zhì)量監(jiān)測。
[0006] 本試劑盒的基本原理是利用一對靶多核苷酸特異性引物和一條靶多核苷酸特異 性探針，在含有耐熱DNA聚合酶，dNTPs，含鎂離子緩沖液中，通過熒光PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核 苷酸的循環(huán)擴增，從而達到快速，定量檢測靶多核苷酸的目的。
[0007] 本發(fā)明的一個方面提供了一種試劑盒，其特征在于，包括引物組;所述引物組包括 具有如SEQ ID No. 1所示的上游引物和具有如SEQ ID No.2所示的下游引物。
[0008] 進一步地，還包括如SEQ ID No.3所示的探針。
[0009] 進一步地，引物濃度為 0 · 2-0 · 3μπιο1/1，探針濃度為 0 · 40-0 · 60μπιο1/1。
[0010]進一步地，還包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶中的一種或兩 者以上的混合物。
[0011] 本發(fā)明的另一個方面提供了上述的試劑盒在檢測MDCK細胞DNA殘留的應用。
[0012] 進一步地，所述MDCK細胞DNA殘留為疫苗中的MDCK細胞DNA殘留。
[0013] 本發(fā)明的再一個方面非診斷和非治療目的的、基于上述試劑盒的檢測MDCK細胞 DNA殘留的方法，其特征在于，取待測樣品經(jīng)預處理后，提取核酸，擴增，判斷是否具有DNA殘 留。
[0014]進一步地，所述樣品為疫苗。
[0015] 進一步地，擴增的反應溫度和時間為:95 °C預變性30s;然后95 °C 5s，60 °C 34s，40個 循環(huán)。
【附圖說明】
[0016] 圖1為參考品擴增曲線，E = 99.5%;
[0017] 圖2為MDCK細胞DNA參考品標準曲線。
【具體實施方式】
[0018] 主要材料：
[0019] MDCK細胞從ATCC(美國標準菌種保藏中心）引進，MDCK CCL-34，P55，Lot: 59681577;QPCR MIX購自日本takara公司；DNAiso購自本takara公司。
[0020] 實施例1MDCK細胞DNA參考品的制備
[0021]以MDCK基因組DNA作為陽性參考品；以猴腎細胞系Vero，中國倉鼠卵巢CH0，流感病 毒、DMEM培養(yǎng)基、PBS、FBS作為陰性參考品。采用Takara抽提試劑盒提取上述陽性參考品與 陰性參考品的DNA待用。
[0022] 實施例2特異性引物及探針的篩選
[0023]通過對Genbank數(shù)據(jù)庫已有的狗腎全部核酸序列以及國內(nèi)外已發(fā)表文獻中報導的 核酸序列比對分析，以與MDCK細胞有關的主要基因為擴增靶位點，選擇無二級結構且高度 保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設計的基本原則，利用軟件和人工設計多對引物和探針，高度重 復保守的靶基因序列與特異性探針為核心。
[0024] 以上述設計的多組引物探針分別檢測上述陽性參考品與陰性參考品的基因組 DNA，經(jīng)反復實驗，篩選出特異性、靈敏度和重復性好的最佳引物探針組合，如下所示：
[0025] 上游引物為GAGACATAGGCAGAGGGAGAAG SEQ ID N0.1;
[0026] 下游引物為GATCCTGGAGACCTGGGAT SEQ ID N0.2;
[0027] 探針為5FAM-CAGGCTCCATGCACCAGGAGC-3TAMRA SEQ ID N0.3。
[0028] 實施例3引物探針濃度的優(yōu)化
[0029]在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0·15μπι〇1/1至0·5μπι〇1/1濃度 梯度的引物和從〇. 075μπι〇1/1至0.5μπι〇1/1濃度梯度的探針進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗， 最終確定最佳的引物濃度為〇. 2-0.3μπι〇1/1，探針濃度為0.40-0.60μπι〇1/1。
[0030] 實施例4反應溫度的優(yōu)化
[0031] 根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸的時間進行了優(yōu)化， 經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為:95°預變性30s;然后95° 5S，60° 34s， 40個循環(huán)。
[0032] 實施例5靈敏度實驗
[0033] 提取陽性參考品提取陽性參考品MDCK細胞的DNA，經(jīng)紫外分光光度計測定0D260和 0D280數(shù)值，計算出原液濃度為493.6pg/ml，稀釋成濃度為10pg/ml，然后10倍梯度稀釋成 1.0X100-1.0xl(T 6，ngAil作為陽性靈敏度參考品，根據(jù)檢測疫苗樣品的下限，使用濃度為 lOtK^ngAil，檢測結果表明，本試劑盒的下