L的ddH20，總體積50yL;反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時間2h;
[0034] 步驟4 · 1的Pxyl-gfp-terminator模塊序列經(jīng)BamHI和Xbal雙酶切的反應(yīng)體系包 括:37yL的Pxy 1-gfp-terminator模塊序列、5yL的10 X NEB酶切緩沖液、2yL的BamHI內(nèi)切酶、 2yL的Xbal內(nèi)切酶、4yL的ddH20，總體積50yL;反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時間2h;
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟2.2中，啟動子?"1序列的乂11〇1單酶切產(chǎn)物和8€?序列的乂11 〇1單 酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接的，連接反應(yīng)體系包括:5yL的Pxy 1序列的Xhol單酶切產(chǎn)物、5μ L的Pxyl序列的Xhol單酶切產(chǎn)物、2yL的10 X T4DNA連接酶緩沖液、lyL的T4DNA連接酶、7yL的 ddH20，反應(yīng)總體積20yL;反應(yīng)溫度22 °C，反應(yīng)時間為lh;
[0036] 所述步驟3.2中，Pxyl-gfp序列的Bglll單酶切產(chǎn)物和終止子terminator序列的 Bglll單酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接的連接反應(yīng)體系包括:5yL的Pxyl-gfp序列的Bglll單 酶切產(chǎn)物、5yL的終止子terminator序列的BglII單酶切產(chǎn)物、2yL的10 X T4DNA連接酶緩沖 液、lyL的T4DNA連接酶、7yL的ddH20，反應(yīng)總體積20yL;反應(yīng)溫度22 °C，反應(yīng)時間為lh;
[0037] 所述步驟4.2中，芽孢桿菌表達載體？階300?1^的雙酶切產(chǎn)物和？1711鄺-terminator模塊序列的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接的連接反應(yīng)體系包括:5yL的芽孢桿 菌表達載體PHY300PLK的雙酶切產(chǎn)物、5yL的Pxyl-gfp-terminator模塊序列的雙酶切產(chǎn)物、 2yL的10 X T4DNA連接酶緩沖液、lyL的T4DNA連接酶、7yL的ddH20,反應(yīng)總體積20yL;反應(yīng)溫 度22°C，反應(yīng)時間為lh。
[0038] 本發(fā)明還得第三個目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG在芽孢桿菌中表 達綠色熒光蛋白的應(yīng)用。
[0039] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提供的穿梭質(zhì)粒PPG，利用芽孢桿菌表達載體 PHY300PLK，選取芽孢桿菌通用的木糖高效表達的啟動子Pxyl，選取gfp基因序列，成功構(gòu)建 了一種表達芽孢桿菌綠色熒光蛋白的穿梭質(zhì)粒PPG，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌，可實現(xiàn)芽孢桿 菌整個菌體呈現(xiàn)穩(wěn)定的綠色熒光，適用于所有芽孢桿菌。進一步的，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主 菌，可實現(xiàn)芽孢桿菌整個菌體呈現(xiàn)穩(wěn)定的綠色熒光，對其分子機制的研究搭建了一個良好 的平臺。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明穿梭質(zhì)粒PPG的構(gòu)建流程說明圖；
[0041] 圖2為本發(fā)明穿梭質(zhì)粒PPG可行性驗證時短小芽孢桿菌-PPG轉(zhuǎn)化子的熒光顯微視 圖；
[0042]圖3為本發(fā)明穿梭質(zhì)粒pPG可行性驗證時枯草芽孢桿菌-pPG轉(zhuǎn)化子的熒光顯微視 圖；
[0043]圖4為本發(fā)明穿梭質(zhì)粒pPG可行性驗證時解淀粉芽孢桿菌-pPG轉(zhuǎn)化子的熒光顯微 視圖。
【具體實施方式】
[0044]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0045]本發(fā)明提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG，全長5989bp，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，并且所述穿梭質(zhì)粒pPG具有g(shù)fp序列。
[0046]基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種穿梭質(zhì)粒pPG的制備方法，但不應(yīng)理解為對 本發(fā)明的限制。
[0047] 若未特別指明，本發(fā)明提供的一種穿梭質(zhì)粒pPG的制備方法中所用的技術(shù)手段為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，且若本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段包括一個以上 可供選擇的實施方案，則任何一個可供選擇的實施方案都不會對本發(fā)明的結(jié)果造成影響。
[0048] 實施例中短小芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化、枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制 備與轉(zhuǎn)化、解淀粉芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取及限制性內(nèi)切酶消化、 DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、PCR擴增反應(yīng)等參照金冬雁、黎夢楓等譯《分子克隆實 驗指南》第二版相關(guān)章節(jié)進行。
[0049] 如圖1所示，本發(fā)明實施例一種穿梭質(zhì)粒pPG的制備方法，包括以下步驟：
[0050] 步驟1，獲得上游帶BamHI的啟動子Pxyl序列
[00511步驟1.1，從江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心(CICIM-CU)購買枯草 芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)菌株，并提取該菌株的基因組DNA;
[0052] 步驟1 .2,以步驟1 . 1中獲得的基因組DNA為模板，以的Pxyl-F(5'_ cgcggatcccatttccccctttgatttttag-3 '）^PPxyl-R(5'-ccgctcgagtcctttgtttatccaccgaac-3'）為引物，進行PCR擴增，所述Pxyl-F的堿基序列如 SEQIDN0.2，所述Pxyl-R的堿基序列如SEQIDN0.3所示；
[0053] 步驟1.3,將步驟1.2中的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，之后進行膠回收，獲得上 游帶BamHI的啟動子Pxyl序列，總長為285bp，其堿基序列如SEQ ID N0.4所示。
[0054] 步驟2,獲得gfp序列
[0055] 步驟2· 1，從Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)購買含gfp的質(zhì)粒pSG1170， 并以質(zhì)粒pSG1170為模板，以Gfp_F(5'-ccgctcgaggtggttattattcaaattgc-3'）和6€口-1?(5'-ggaagatctgagattttctagttcagtcag-3 '）為引物，進行PCR擴增，Gfp-F的堿基序列如SEQ ID N0.5所示，所述Gfp-R的堿基序列如SEQIDN0.6所示；
[0056] 步驟2.2,將步驟2.1中的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，之后進行膠回收，獲得全 長為789bp的gfp基因，其堿基序列如SEQIDN0.7所示。
[0057] 步驟3，PCR擴增獲得下游帶Xbal的終止子terminator序列
[0058] 步驟3. 1，以步驟1 . 1中獲得的基因組DNA為模板，以Teminator-F(5'_ ggaagatctacgttcttgccattgctgc-3 '）^PTeminator-R(5'-ctagtctagatcgatatctctgcagtcgcgatgatt-3'）為引物，進行PCR擴增，所述Teminator-F的 堿基序列如SEQ ID NO.8所示，所述Teminator-R的堿基序列如SEQ ID NO.9所示；
[0059]步驟3.2,將步驟3.1中的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，之后進行膠回收，獲得下 游帶Xbal的終止子terminator序列，總長為105bp，其堿基序列如SEQ ID N0.10所示。
[0000] 步驟4,構(gòu)建Pxyl-gfp序列，包括，
[00611步驟4.1，將步驟1中獲得的啟動子Pxyl序列和gfp序列分別用Xhol單酶切，然后將 單酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得啟動子Pxyl序列的Xhol單酶切產(chǎn)物和gfp序 列的Xhol單酶切產(chǎn)物；
[0062] 步驟4.2，將步驟4.1中獲得的啟動子Pxyl序列的Xhol單酶切產(chǎn)物和gfp序列的 Xho I單酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，然后經(jīng)瓊脂糖電泳回收，獲得連接產(chǎn)物；
[0063] 步驟4.3，以步驟4.2獲得的連接產(chǎn)物為模板，以Pxyl-F和Gfp-R為引物，進行PCR擴 增，然后將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得Pxyl-gfp序列；
[0064] 步驟 5，構(gòu)建 Pxy l-gfp-teminator 模塊序列
[0065] 步驟5. 1，將步驟4.3中獲得的Pxyl-gfp序列和步驟1 .3中獲得的終止子 terminator序列分別用Bgl II單酶切，然后將單酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲 得Pxyl-gfp序列的Bgl II單酶切產(chǎn)物和終止子terminator序列的Bgl II單酶切產(chǎn)物；
[0066] 步驟5.2,將步驟5. 1中獲得的Pxyl-gfp序列的Bglll單酶切產(chǎn)物和終止子 terminator序列的Bgl II單酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，然后經(jīng)瓊脂糖電泳回收，獲得連 接產(chǎn)物；
[0067] 步驟5.3，以步驟5.2獲得的連接產(chǎn)物為模板，以Pxyl-F和Teminator-R為引物，進 行PCR擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳后膠回收，獲得Pxyl-gfp-teminator模塊序 列；
[0068] 步驟6,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pPG
[0069] 步驟6.1，分別將所述芽孢桿菌表達載體pHY300PLK和步驟5.3獲得的PXyl-gfp-t erminat0r模塊序列經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切，然后將雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，最后膠回 收，獲得芽孢桿菌表達載體PHY300PLK的雙酶切產(chǎn)物和Pxyl-gfp-terminator模塊序列的雙 酶切產(chǎn)物；
[0070] 步驟6.2