一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG、制備方法 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢桿菌在自然界中多樣性豐富、分布廣，具有耐高溫高壓、抗逆性強(qiáng)、易儲存等 生物特性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)。芽胞桿菌能夠產(chǎn)生很多重要的 生物活性物質(zhì)，還可以抑制多種植物病原菌;利用芽胞桿菌制成的微生態(tài)飼料添加劑具有 增加飼料利用率、提高動物生產(chǎn)性能、促進(jìn)機(jī)體免疫、促進(jìn)動物胃腸道微生態(tài)平衡及抗菌防 病等功效。鑒于芽孢桿菌的重要性以及分子克隆技術(shù)的日漸成熟，若能夠?qū)ρ挎邨U菌進(jìn)行 熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)跟蹤，將對芽孢桿菌研究到分子水平，可以加深對芽孢桿菌分子作用機(jī) 理的認(rèn)識。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，常用的方法是針對特定的芽孢桿菌，選擇其中特定的看家基因，比如 細(xì)胞形態(tài)維持蛋白基因 mreB，然后在看家基因的碳末端融合表達(dá)綠色焚光蛋白（green fluorescent protein，gfp)，實(shí)現(xiàn)gfp組成型表達(dá)菌株。然而，由于不同的芽孢桿菌基因存 在特異性，每換一種菌株都得重新構(gòu)建質(zhì)粒，缺乏質(zhì)粒應(yīng)用的廣泛性，增加了構(gòu)建能夠穩(wěn)定 且高水平表達(dá)gfp的芽孢桿菌菌株的難度。
[0004] 綜上，現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題是，現(xiàn)有的應(yīng)用于芽孢桿菌的表達(dá)gfp的質(zhì)粒缺乏廣 泛性、通用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例的目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG、制備方法及其應(yīng) 用，用以解決現(xiàn)有的應(yīng)用于芽孢桿菌的表達(dá)gfp的質(zhì)粒缺乏廣泛性、通用性的問題。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，所述穿梭質(zhì)粒pPG具有g(shù)fp序列。
[0007] 優(yōu)選的，所述穿梭質(zhì)粒pPG以枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)菌株、質(zhì) 粒pSGl 170、芽孢桿菌表達(dá)載體pHY300PLK為原料制備而成。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pPG的制備方法，包括 以下步驟：
[0009] 步驟1，獲得啟動子Pxyl序列、gfp序列和終止子terminator序列，包括：
[0010] 提取芽孢桿菌的基因組DNA，并以所述芽孢桿菌的基因組DNA為模板，以Pxyl-F和 Pxyl-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得上游 帶BamM酶切位點(diǎn)的啟動子Pxy 1序列，其堿基序列如SEQ ID N0.4所示，所述Pxy 1-F的堿基 序列如SEQ ID N0.2所示，所述Pxyl-R的堿基序列如SEQ ID N0.3所示；
[0011] 購買含gf P序列的質(zhì)粒pSGl 170，并以質(zhì)粒pSGl 170為模板，以Gfp-F和Gf p-R為引 物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得gfp序列，其堿基 序列如SEQIDN0.7所示，所述Gfp-F的堿基序列如SEQIDN0.5所示，所述Gfp-R的堿基序 列如SEQ ID NO.6所示；
[0012] 以所述芽孢桿菌的基因組DNA為模板，以Teminator-F和Teminator-R為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得下游帶Xbal酶切位點(diǎn)的終 止子terminator序列，其堿基序列如SEQ ID NO. 10所示，所述Teminator-F的堿基序列如 SEQ ID NO.8所示，所述Teminator-R的堿基序列如SEQ ID NO.9所示；
[0013] 步驟2,構(gòu)建Pxyl-gfp序列，包括：
[0014]步驟2.1，將步驟1中獲得的啟動子Pxyl序列和gfp序列分別用Xhol單酶切，然后將 單酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得啟動子Pxyl序列的Xhol單酶切產(chǎn)物和gfp序 列的Xhol單酶切產(chǎn)物；
[0015] 步驟2.2,將步驟2.1中獲得的啟動子Pxyl序列的Xhol單酶切產(chǎn)物和gfp序列的 Xho I單酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，然后經(jīng)瓊脂糖電泳回收，獲得連接產(chǎn)物；
[0016] 步驟2.3，以步驟2.2獲得的連接產(chǎn)物為模板，以Pxy 1-F和Gfp-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得Pxyl-gfp序列；
[0017] 步驟 3，構(gòu)建 Pxy l-gfp-teminator 模塊序列
[0018] 步驟3 · 1，將步驟2.3中獲得的Pxyl-gfp序列和步驟1中獲得的終止子terminator 序列分別用Bglll單酶切，然后將單酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得Pxyl-gfp 序列的Bgl II單酶切產(chǎn)物和終止子terminator序列的Bgl II單酶切產(chǎn)物；
[0019] 步驟3 · 2，將Pxyl-gfp序列的Bglll單酶切產(chǎn)物和終止子terminator序列的Bglll 單酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，然后經(jīng)瓊脂糖電泳回收，獲得連接產(chǎn)物；
[0020] 步驟3.3，以步驟3.2獲得的連接產(chǎn)物為模板，以Pxyl-F和Teminator-R為引物，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳后膠回收，獲得Pxyl-gfp-teminator模塊序 列；
[0021] 步驟4，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pPG
[0022] 步驟4.1，分別將所述芽孢桿菌表達(dá)載體pHY300PLK和步驟3.3獲得的PXyl-gfp-terminat 0r模塊序列經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切，然后將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，最后膠回 收，獲得芽孢桿菌表達(dá)載體PHY300PLK的雙酶切產(chǎn)物和Pxyl-gfp-terminator模塊序列的雙 酶切產(chǎn)物；
[0023] 步驟4.2，將步驟4.1獲得的芽孢桿菌表達(dá)載體?!^300?1^的雙酶切產(chǎn)物和？"1-gfp-terminator模塊序列的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，然后經(jīng)瓊脂糖電泳回收，獲得 穿梭質(zhì)粒pPG。
[0024] 優(yōu)選的，提取所述芽孢桿菌的基因組DNA時(shí)采用的菌株為枯草芽孢桿菌168 (Bacillus subtilis 168)；
[0025] 優(yōu)選的，所述以Pxyl-F和Pxyl-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括:5yL的10 X PCR緩沖液、lyL的引物Pxyl-F、lyL的引物Pxyl-R、5yL的芽孢桿菌的基因組DNA、8yL的dNTP、 lyL的DNA聚合酶、29yL的ddH20，反應(yīng)總體積50yL;
[0026] 所述以Gfp-F和Gfp-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：5yL的10 X PCR緩沖 液、lyL 的引物Gf p-F、lyL 的引物Gf p-R、5yL 的質(zhì)粒pSGl 170、8yL 的 dNTP、lyL 的 DNA聚合酶、29 yL的ddH20，反應(yīng)總體積50yL;
[0027] 所述以Teminator-F和Teminator-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括:5yL的 10 X PCR緩沖液、lyL的引物Teminator-F、lyL的引物Teminator-R、5yL的芽孢桿菌的基因組 DNA、8yL 的 dNTP、lyL 的 DNA 聚合酶、29yL 的 ddH20，反應(yīng)總體積 50yL;
[0028] 所述PCR擴(kuò)增的程序均為：第一步，94°C維持4min;第二步，包括30個(gè)循環(huán)，其中每 一個(gè)循環(huán)的條件為95 °C維持30s、之后55 °C維持45s、之后72 °C維持lmin;第三步，72 °C維持 lOmin;第四步，溫度降為4°C，并且PCR程序停止；
[0029] 優(yōu)選的，步驟2.1的啟動子Pxyl序列用Xhol單酶切的反應(yīng)體系包括:39yL的啟動子 Pxy 1序列、5yL的10 X NEB酶切緩沖液、2yL的Xhol內(nèi)切酶、4yL的ddH20，反應(yīng)總體積50yL;反 應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間2h;
[0030] 步驟2.1的gfp序列用Xhol單酶切的反應(yīng)體系包括:39yL的gfp序列、5yL的10XNEB 酶切緩沖液、2yL的XhoI內(nèi)切酶、4yL的ddH20，反應(yīng)總體積50yL;反應(yīng)溫度37 °C，反應(yīng)時(shí)間2h; [0031 ] 步驟3.1的Pxyl-gfp序列用Bglll單酶切的反應(yīng)體系包括:39yL的Pxyl-gfp序列、5 yL的10 XNEB酶切緩沖液、2yL的BglII內(nèi)切酶、4yL的ddH20，反應(yīng)總體積50yL;反應(yīng)溫度37 °C，反應(yīng)時(shí)間2h;
[0032] 步驟3 · 1的terminator序列用Bglll單酶切的反應(yīng)體系包括:39yL的terminator序 列、5yL的10 X NEB酶切緩沖液、2yL的Bgl II內(nèi)切酶、4yL的ddH20，反應(yīng)總體積50yL;反應(yīng)溫度 37°(：，反應(yīng)時(shí)間211;
[0033] 優(yōu)選的，步驟4.1的芽孢桿菌表達(dá)載體pHY300PLK經(jīng)BamHI和Xbal雙酶切的反應(yīng)體 系包括:37yL的芽孢桿菌表達(dá)載體pHY300PLK、5yL的10 X NEB酶切緩沖液、2yL的BamHI內(nèi)切 酶、2yL的Xbal內(nèi)切酶、4y