子I的序列，設(shè)計(jì)表達(dá)sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TCRBCl-E)(l-l、Seq-TCRBCl-EXl-2、Seq-TCRBCl-EXl-3、Seq-TCRBCl-EXl-4、Seq-TCRBCl-EXl-5。
[0050]進(jìn)一步地，將上述序列，尤其是Seq-TCRBCl-EXl-1序列反向相互補(bǔ)，得到Seq-TCRBC1-EX1-1 的反向互補(bǔ)序列(見序列 Seq-TCRBCl-EXl-l-R)。
[0051 ] 進(jìn)一步地，還需要在Seq-TCRBCl-ΕΠ-Ι和Seq-TCRBCl-En-1-R兩端加上雙酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構(gòu)建進(jìn)入載體，加了雙酶切位點(diǎn)之后的序列分別見序列Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I和序列Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I。
[0052]進(jìn)一步地，將上述序列分別合成，序列合成之后，首先進(jìn)行退火反應(yīng)，其過程為:按照合成序列說明書將寡聚核苷酸單鏈用ddH20溶解成50 μΜ的溶液；然后將8μ1的Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH Ι、8μ1 的Seq-TCRBQ-EX卜1-R-EcoR I以及2μ1 的NEB Buffer 2和2μ?的ddH20混合均勻，然后把EP管放在95 V水浴5分鐘。此后關(guān)閉水浴鍋，讓EP管在水浴鍋中自然降溫到常溫即完成退火，得到能夠表達(dá)sgRNA的雙鏈寡核苷酸。
[0053]然后將上述序列構(gòu)建到CRISPR/Cas9載體上。構(gòu)建過稱為:采用BamH I和EcoR I對(duì)CRISPR/Cas9載體進(jìn)行雙酶切，然后用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。將膠回收的CRISPR/Cas9載體與合成并退火的能夠表達(dá)sgRNA的雙鏈寡核苷酸按照摩爾比例為1:10混合(20微升體系)，再加入T4 DNA連接酶緩沖溶液，之后在45 °C水浴熱激5分鐘，熱激之后放置到4°C冰箱5分鐘，最后加入2微升T4 DNA連接酶，在16攝氏度連接過夜。
[0054]之后將連接的質(zhì)粒做細(xì)菌轉(zhuǎn)化，其過程為:將連接的質(zhì)粒放置在冰上，并且將DH5a細(xì)菌(每管50微升)在冰上解凍;之后用微量移液器吸取3-5微升質(zhì)粒，加入細(xì)菌中，混合均勻，然后將混合物繼續(xù)放置冰上5-10分鐘;然后將混合物在42 0C水浴熱激90秒鐘;然后迅速將混合物再放置在冰上冷卻2-3分鐘；最后加入500微升無菌LB培養(yǎng)基，放置在37 °C振蕩培養(yǎng)I小時(shí);培養(yǎng)完成之后涂平板，然后放置在37°C培養(yǎng)過夜;第二天挑取克隆測(cè)序。
[0055]將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染從健康人分離培養(yǎng)的T細(xì)胞進(jìn)行TCR基因的敲除。轉(zhuǎn)染過稱為:將50微克構(gòu)建好的質(zhì)粒加入到100微升含有脂質(zhì)體的混合溶液(50微升超純水和50微升脂質(zhì)體混合)中，在室溫放置15分鐘。之后加入到I個(gè)10厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)的T細(xì)胞中，6個(gè)小時(shí)之后換上新鮮培養(yǎng)液。
[0056]質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成之后，繼續(xù)培養(yǎng)T細(xì)胞并進(jìn)一步擴(kuò)增。由于TCR敲除的T細(xì)胞已經(jīng)不會(huì)表達(dá)TCR，因此，TCR未被敲除的T細(xì)胞會(huì)表達(dá)，所以，采用熒光標(biāo)記的抗TCRc^的抗體ant1-TCRc^-PE可以直接將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增的T細(xì)胞分為兩群細(xì)胞，一群是有熒光的T細(xì)胞，一群是沒有熒光的T細(xì)胞，而沒有熒光的T細(xì)胞即是目的細(xì)胞。因此，可以采用流式細(xì)胞術(shù)分離TCR敲除的細(xì)胞，其過程為:將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增之后的T細(xì)胞收集，并用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，之后加入ImL冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗體，避光孵育30分鐘;孵育完成之后，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，然后加入ImL磷酸鹽緩沖液過流式細(xì)胞儀，收集不帶熒光的細(xì)胞。細(xì)胞收集完成之后，繼續(xù)在體外擴(kuò)增培養(yǎng)并凍存待用。
[0057]之后將針對(duì)不同類型腫瘤的攜帶CAR的慢病毒感染上述分離到的可以異體移植的T細(xì)胞，其過程為:在10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)TCR失活的T細(xì)胞(I X 17數(shù)量)，然后將包裝好的裝載CAR的慢病毒即PLVX-信號(hào)肽序列-scFv-CD8(鉸鏈及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培養(yǎng)皿混合均勻，24小時(shí)之后換新鮮培養(yǎng)液即可。
[0058]病毒感染完成之后，就將表達(dá)CAR的TCR失活的T細(xì)胞大規(guī)模體外擴(kuò)增。培養(yǎng)到足夠數(shù)量之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，最后用磷酸鹽緩沖液清洗三遍之后，用于異體移植治療腫瘤。
[0059]實(shí)施例3 異體移植TCRBC2失活的T細(xì)胞結(jié)合第三代CAR治療腫瘤
在本實(shí)施例中，采用CRISPR/Cas9技術(shù)來敲除TCR的β鏈的恒定區(qū)編碼基因TCRBC2。針對(duì)TCRBC2的外顯子，包括外顯子1、外顯子2、外顯子3以及外顯子4，利用CRISPR/Cas9技術(shù)來敲除TCRBC2的外顯子I。根據(jù)TCRBC2外顯子序列，尤其是外顯子I的序列，設(shè)計(jì)表達(dá)sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TCRBC2-E)(l-l、Seq-TCRBC2-EXl-2、Seq-TCRBC2-EX1-3、Seq_TCRBC2_EXl_4、Seq_TCRBC2_EXl_5。
[0060]進(jìn)一步地，將上述序列，尤其是Seq-TCRBC2_EX1-1序列反向相互補(bǔ)，得到Seq-TCRBC2-EX1-1 的反向互補(bǔ)序列(見序列 Seq-TCRBC2-EXl-l-R)。
[0061 ] 進(jìn)一步地，還需要在Seq-TCRBC2-E)(l-1和Seq-TCRBC2-E)(l-1-R兩端加上雙酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構(gòu)建進(jìn)入載體，加了雙酶切位點(diǎn)之后的序列分別見序列Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH I和序列Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I。
[0062]進(jìn)一步地，將上述序列分別合成，序列合成之后，首先進(jìn)行退火反應(yīng)，其過程為:按照合成序列說明書將寡聚核苷酸單鏈用ddH20溶解成50 μΜ的溶液；然后將8μ1的Seq-TCRBC2-EX1-1-BamH 1、8μ1 的Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均勻，然后把EP管放在95°C水浴5分鐘。此后關(guān)閉水浴鍋，讓EP管在水浴鍋中自然降溫到常溫即完成退火，得到能夠表達(dá)sgRNA的雙鏈寡核苷酸。
[0063]然后將上述序列構(gòu)建到CRISPR/Cas9載體上。構(gòu)建過稱為:采用BamH I和EcoR I對(duì)CRISPR/Cas9載體進(jìn)行雙酶切，然后用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。將膠回收的CRISPR/Cas9載體與合成并退火的能夠表達(dá)sgRNA的雙鏈寡核苷酸按照摩爾比例為1:10混合(20微升體系)，再加入T4 DNA連接酶緩沖溶液，之后在45 °C水浴熱激5分鐘，熱激之后放置到4°C冰箱5分鐘，最后加入2微升T4 DNA連接酶，在16攝氏度連接過夜。
[0064]之后將連接得到的質(zhì)粒做細(xì)菌轉(zhuǎn)化，其過程為:將連接的質(zhì)粒放置在冰上，并且將DH5a細(xì)菌(每管50微升)在冰上解凍;之后用微量移液器吸取3-5微升質(zhì)粒，加入細(xì)菌中，混合均勻，然后將混合物繼續(xù)放置冰上5-10分鐘;然后將混合物在42°C水浴熱激90秒鐘;然后迅速將混合物再放置在冰上冷卻2-3分鐘；最后加入500微升無菌LB培養(yǎng)基，放置在37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí);培養(yǎng)完成之后涂平板，然后放置在37 °C培養(yǎng)過夜;第二天挑取克隆測(cè)序。
[0065]將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染從健康人分離培養(yǎng)的T細(xì)胞進(jìn)行TCR基因的敲除。轉(zhuǎn)染過稱為:將50微克構(gòu)建好的質(zhì)粒加入到100微升含有脂質(zhì)體的混合溶液(50微升超純水和50微升脂質(zhì)體混合)中，在室溫放置15分鐘。之后加入到I個(gè)10厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)的T細(xì)胞中，6個(gè)小時(shí)之后換上新鮮培養(yǎng)液。
[0066]質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成之后，繼續(xù)培養(yǎng)T細(xì)胞并進(jìn)一步擴(kuò)增。由于TCR敲除的T細(xì)胞已經(jīng)不會(huì)表達(dá)TCR，因此，TCR未被敲除的T細(xì)胞會(huì)表達(dá)，所以，采用熒光標(biāo)記的抗TCRc^的抗體ant1-TCRc^-PE可以直接將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增的T細(xì)胞分為兩群細(xì)胞，一群是有熒光的T細(xì)胞，一群是沒有熒光的T細(xì)胞，而沒有熒光的T細(xì)胞即是目的細(xì)胞。因此，可以采用流式細(xì)胞術(shù)分離TCR敲除的細(xì)胞，其過程為:將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增之后的T細(xì)胞收集，并用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，之后加入ImL冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗體，避光孵育30分鐘;孵育完成之后，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，然后加入ImL磷酸鹽緩沖液過流式細(xì)胞儀，收集不帶熒光的細(xì)胞。細(xì)胞收集完成之后，繼續(xù)在體外擴(kuò)增培養(yǎng)并凍存待用。
[0067]之后將針對(duì)不同類型腫瘤的攜帶CAR的慢病毒感染上述分離到的可以異體移植的T細(xì)胞，其過程為:在10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)TCR失活的T細(xì)胞(I X 17數(shù)量)，然后將包裝好的裝載CAR的慢病毒即PLVX-信號(hào)肽序列-scFv-CD8(鉸鏈及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培養(yǎng)皿混合均勻，24小時(shí)之后換新鮮培養(yǎng)液即可。
[0068]病毒感染完成之后，就將表達(dá)CAR的TCR失活的T細(xì)胞大規(guī)模體外擴(kuò)增。培養(yǎng)到足夠數(shù)量之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，最后用磷酸鹽緩沖液清洗三遍之后，用于異體移植治療腫瘤。
[0069]實(shí)施例4
異體移植TRAC及TCRBCl同時(shí)失活的T細(xì)胞結(jié)合第三代CAR治療腫瘤在本實(shí)施例中，采用CRISPR/Cas9技術(shù)來敲除TCR的α鏈的恒定區(qū)編碼基因TRAC以及β鏈的TCRBCl基因。針對(duì)TRAC及TCRBCl的外顯子，分別包括它們的外顯子1、外顯子2、外顯子3以及外顯子4，利用CRISPR/Cas9技術(shù)來敲除TRAC的外顯子I及TCRBCl的外顯子I。根據(jù)TRAC及TCRBCl的外顯子序列，尤其是外顯子I的序列，設(shè)計(jì)表達(dá)sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EX 1-1、Seq-TRAC-EX I _2、Seq-TRAC-EX I _3、Seq-TRAC-EX I _4、Seq-TRAC-EX1-5，Seq-TCRBCl-EXl-1、Seq-TCRBCl-EXl-2、Seq-TCRBCl-EXl_3、Seq-TCRBCl-EXl-4、Seq-TCRBCl-EXl-5。
[0070]進(jìn)一步地，將上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互補(bǔ)，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互補(bǔ)序列(見序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0071]進(jìn)一步地，將上述序列，尤其是Seq-TCRBCl-EXl-1序列反向相互補(bǔ)，得到Seq-TCRBC1-EX1-1 的反向