一種可異體移植的嵌合抗原受體t細胞及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，尤其涉及一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤一直以來都是困擾全世界的重大疾病，嚴(yán)重危害人類健康。因此，尋找有效的腫瘤治療方法，徹底攻克腫瘤是世界醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。目前，傳統(tǒng)的三大主要治療手段即手術(shù)治療、化療、放療這三大主要治療手段雖然是全球腫瘤治療的基本手段方法，然而其治療效果有限。
[0003]其中傳統(tǒng)手術(shù)切除是腫瘤行業(yè)中最基本、最重要的腫瘤治療手段。放療是用放射線照射癌組織，以抑制和殺滅癌細胞的一種治療方法，是大多數(shù)腫瘤的輔助療法，然而由于放療對癌細胞和正常細胞沒有分辨能力，多次放療后，患者會產(chǎn)生一系列毒副作用和反應(yīng)，對中晚期腫瘤患者，放療作用有限?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞的生長繁殖的一種治療方式，但對大多數(shù)腫瘤的治療的有效性較低。并且，化療與放療一樣，其在殺傷腫瘤細胞的同時，也將正常細胞和免疫細胞一同殺滅，導(dǎo)致病患者免疫能力和身體機能下降，生活質(zhì)量降低。
[0004]目前，免疫腫瘤療法正在全世界興起，為腫瘤患者帶來了曙光。而免疫療法中最有效果的療法是基于嵌合抗原受體T細胞(Chimeric antigen receptor T cells , CART)療法。其基本原理是利用基因工程改造從腫瘤患者自身身體中分離培養(yǎng)的T細胞，即通過逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體給T細胞加入一個能特異識別腫瘤細胞，并且同時激活T細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體。然后將這些基因工程改造的T細胞進行體外擴增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使免疫細胞具有特異性識別和殺傷腫瘤的能力，從而達到治療腫瘤的效果。
[0005]嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)主要由三部分組成，位于細胞外的抗原結(jié)合區(qū)scFv，跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成。其中，根據(jù)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的研究發(fā)展，CAR可以分為第一代CAR、第二代CAR以及第三代CAR。第一代CAR僅含有一個信號單元，大多來自于CD3G，對腫瘤的殺傷效果很不理想。第二代CAR是在第一代CAR的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)之上增加了一個共刺激結(jié)構(gòu)域，比如⑶28、0X40或者4-1BB，能夠提高CART細胞殺傷腫瘤的療效，但是效果還不能令人滿意。目前，大多數(shù)CAR都是第三代CAR，其主要是在在第二代CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)之上再增加一個共刺激結(jié)構(gòu)域，因此具有三個個共刺激結(jié)構(gòu)域，研究發(fā)現(xiàn)這樣極大地提高了CART細胞的擴增倍數(shù)以及T細胞在體內(nèi)存活的時間，達到治療腫瘤的效果。
[0006]雖然CART技術(shù)在治療腫瘤上面顯示出了巨大的優(yōu)勢和效果，然而，由于CART治療腫瘤非常的個體化，即必須要分離腫瘤患者自身的T細胞，這在實際應(yīng)用之中具有相當(dāng)大的困難，也存在許多的不足。首先是絕大多數(shù)腫瘤患者采用CART治療腫瘤時都是在其他腫瘤治療方法失去效果的情況下進行的，在經(jīng)過手術(shù)治療，尤其是在經(jīng)過化療和放療之后，患者的免疫系統(tǒng)遭到毀滅性的破壞，其自身的T細胞數(shù)量極其有限，這會造成分離T細胞困難。第二，經(jīng)過放化療至后，患者自身的T細胞遭受化學(xué)藥物及射線的破壞，T細胞的活性非常低，尤其是細胞增殖能力非常低，分泌腫瘤殺傷因子的能力也大幅下降，進而不能夠有效殺傷腫瘤細胞。第三，CART治療前分離腫瘤患者自身的T細胞，在分離細胞的同時，無法完全避免分離的T細胞里面有少量的腫瘤細胞也混雜在分離的細胞里面，即便經(jīng)過大規(guī)模的體外擴增，由于放化療之后的腫瘤細胞活性更高，因此獲得的T細胞里面也具有大量的腫瘤細胞，在輸入患者體內(nèi)之后，這些腫瘤細胞也會再次輸入患者體內(nèi)，為患者造成了致命打擊。第四，經(jīng)過放化療的腫瘤患者身體極其脆弱，腫瘤隨時都可能復(fù)發(fā)，留給患者的時間非常不足，往往在經(jīng)過極其短的時間，甚至一兩周之內(nèi)就會復(fù)發(fā)，然而，個體化分離患者的T細胞、然后在經(jīng)過基因改造成CART細胞，其后再大規(guī)模體外培養(yǎng)、最后輸入患者，這段時間會經(jīng)歷非常長的時間，往往會需要幾個月的時間，而這段準(zhǔn)備CART的時間之內(nèi)，患者可能已經(jīng)失去生命O
[0007]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞及制備方法，旨在解決現(xiàn)有T細胞分離困難、不能夠有效殺傷腫瘤細胞及混雜有腫瘤細胞的問題。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，所述嵌合抗原受體T細胞包括T細胞和嵌合抗原受體，其中，所述T細胞為經(jīng)過基因工程改造的能夠進行異體移植的T細胞。
[0010]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其中，所述T細胞為經(jīng)過基因定點敲除技術(shù)在特定基因改造的T細胞。
[0011]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其中，所述特定基因為TCR基因，所述TCR包括α鏈和β鏈，所述基因改造具體為:在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區(qū)域的相應(yīng)編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術(shù)，使T細胞的TCR不具有活性，進而使T細胞能夠進行異體移植。
[0012]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其中，所述基因定點敲除技術(shù)為CRISPR/Cas9。
[0013]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其中，所述嵌合抗原受體由scFv抗原結(jié)合序列、跨膜序列及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列組成。
[0014]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列包括輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列。
[0015]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列為CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、⑶2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一種o
[0016]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述跨膜序列為CD8。
[0017]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列包括CD28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列、4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和CD3G胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列。
[0018]—種如上任一所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其中，包括步驟: A、在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區(qū)域的相應(yīng)編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術(shù)，使T細胞的TCR不具有活性，進而得到能夠進行異體移植的T細胞；
B、將攜帶嵌合抗原受體的慢病毒感染上述得到的能夠進行異體移植的T細胞，感染完成后得到可異體移植的嵌合抗原受體T細胞。
[0019]有益效果:本發(fā)明異體來源的T細胞經(jīng)過基因工程改造，進而可以使這種T細胞異體移植而不會產(chǎn)生免疫排斥。然后將這種異體移植不會產(chǎn)生免疫排斥的T細胞結(jié)合第三代CAR技術(shù)制備成一種可以異體移植的通用型的嵌合抗原受體T細胞，以便于腫瘤治療。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施例1中T細胞α鏈恒定區(qū)TRAC的外顯子用CRISPR/Cas9敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0021]圖2為本發(fā)明實施例2中T細胞β鏈恒定區(qū)域一TCRBCl的外顯子用CRISPR/Cas9敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0022]圖3為本發(fā)明實施例3中T細胞β鏈恒定區(qū)域二 TCRBC2的外顯子用CRISPR/Cas9敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0023]圖4為本發(fā)明實施例4中T細胞α鏈恒定區(qū)TRAC以及β鏈恒定區(qū)域一 TCRBCl的外顯子用CRISPR/Cas9同時敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0024]圖5為本發(fā)明實施例5中T細胞α鏈恒定區(qū)TRAC以及β鏈恒定區(qū)域二 TCRBC2的外顯子用CRISPR/Cas9同時敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0025]圖6為本發(fā)明實施例6中T細胞α鏈恒定區(qū)TRAC以及β鏈恒定區(qū)域一 TCRBCGPM^g定區(qū)域二 TCRBC2的外顯子用CRISPR/Cas9同時敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明提供一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞及制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]本發(fā)明提供一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，所述嵌合抗原受體T細胞包括T細胞和嵌合抗原受體，其中，所述T細胞為經(jīng)過基因工程改造的能夠進行異體移植的T細胞。其中，本發(fā)明T細胞的來源包括健康成年人采血分離獲取或者患者自身血液分離提取或者其他符合相應(yīng)條件的人的血液提取分離。本發(fā)明異體來源的T細胞經(jīng)過基因工程改造，進而可以使這種T細胞異體移植而不會產(chǎn)生免疫排斥。然后將這種異體移植不會產(chǎn)生免疫排斥的T細胞結(jié)合第三代CAR技術(shù)制備成一種可以異體移植的通用型的嵌合抗原受體T細胞，以便于腫瘤治療。
[0028]具體地，本發(fā)明所述T細胞為經(jīng)過基因定點敲除技術(shù)在特定基因改造的T細胞。其中，所述特定基因可以為但不限于TCR基因，所述TCR包括α鏈和β鏈，所述基因改造具體為:在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區(qū)域的相應(yīng)編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術(shù)，使T細胞的TCR不具有活性，進而使T細胞能夠進行異體移植。
[0029]具體地，本發(fā)明所述TCR的α鏈的恒定區(qū)域為TRAC，TCR的β鏈的恒定區(qū)域具有兩個區(qū)域，分別為TCRBCl和TCRBC2。
[0030]具體地，所述基因定點敲除技術(shù)優(yōu)選為CRISPR/Cas9(Clustered regularlyinterspaced shortpalindromic repeats (CRISPR) /CRISPR-associated systems(Cas)，CRISPR/Cas9)技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)是最近發(fā)展起來的基因定點敲除技術(shù)之一，之前基因定點敲除技術(shù)還有鋅指核酸酶(Zinc Finger Nuclease , ZFN)技術(shù)以及TALEN(Transcript1n activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)。而CRISPR/Cas9技術(shù)相較于ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)而言，其操作更加簡單，同時脫靶效應(yīng)也小于另兩種技術(shù)，因此，在最近獲得了巨大的關(guān)注和發(fā)展。Cas9酶含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA這兩種結(jié)合成復(fù)合物，然后再通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進而