優(yōu)勢。本發(fā)明能夠提高多倍體的變異率，減輕對植物的傷害，提高變異苗的成活率。安磺靈和EMS的使用劑量少，能減少化學(xué)藥物的毒害，降低成本。并能有效減少嵌合體的形成，降低成本。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以雜交蘭品種“黃金小神童”為例進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1
(1)化學(xué)誘變劑的配制:稱取0.0lg安磺靈溶于Ig二甲基亞砜(DMSO)中溶解，再加入蒸餾水至I OOmL得到母液，然后將母液以蒸餾水稀釋至濃度為0.001?0.003%，再在121°C下進(jìn)行滅菌20min，待冷卻后即得到質(zhì)量濃度為0.001?0.003%的安磺靈溶液；
(2)處理材料的選擇處理:雜交蘭按常規(guī)莖尖誘導(dǎo)形成根狀莖培養(yǎng)I月后，選擇大小、部位一致的幼嫩根狀莖尖端，切下lcm，浸泡在步驟(I)所得安磺靈溶液中，浸泡時間為24小時，然后用滅菌蒸餾水清洗3次，用滅菌濾紙吸干水分，再接種到下列培養(yǎng)基中:M S +EMS20mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+蔗糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+瓊脂7g/L，pH值為5.4?5.8;并在溫度25 土 I °C、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)一個月；其中，EMS是以濃度為0.1mol/L、pH=7.0的磷酸緩沖液為溶劑配制濃度為20mg/L的EMS溶液(甲磺酸乙酯溶液)，經(jīng)過濾滅菌法后，即可用于培養(yǎng)基中； (3)根狀莖的分化培養(yǎng):將步驟(2 )培養(yǎng)后的根狀莖轉(zhuǎn)接到下列培養(yǎng)基中:MS+6-BA5mg/L +NAA lmg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+花寶I號 2.5g/L+花寶2號0.6g/L+花寶5號0.8g/L+瓊脂78/1，？!1值為5.4?5.8;并在溫度25±1°(:、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)，直到根狀莖形成組培苗，并長出幼嫩根；
(4 )變異植株形態(tài)鑒定:挑選步驟(3 )所得組培苗中植株器官巨大、葉色濃綠、葉片寬大肥厚、葉片卷曲、生長緩慢的根狀莖，即得到疑似多倍體植株；
(5)將步驟(4)所得疑似多倍體植株進(jìn)行下列氣孔鑒定;取疑似多倍體植株的葉下表皮，用光學(xué)顯微鏡觀察氣孔，在10倍鏡下，隨機(jī)分別測定40個二倍體和四倍體(多倍體)氣孔的長徑和短徑，計(jì)算平均值:二倍體為28.06μπι X 22.52μπι，四倍體為39.16μπι X 32.34ym；當(dāng)氣孔直徑增大0.5?I倍、單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)明顯減少、且保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體大且顏色較深的，即初步判斷為多倍體變異植株；同一表皮上氣孔大小差異顯著的，即初步判斷為嵌合體植株；
(6)將步驟(5)所得多倍體變異植株和嵌合體植株進(jìn)行下列染色體鑒定:在上午9點(diǎn)到12點(diǎn)，細(xì)胞分裂旺盛時期，分別取步驟(5)所得多倍體變異植株和嵌合體植株的幼嫩根根尖I?1.5cm裝入離心管中，用質(zhì)量濃度為0.1%的秋水仙素浸泡4h后，清洗，再用卡諾固定液(無水乙醇:冰乙酸的體積比=3:1)固定20h后，清洗，然后用濃度為ImoI/L的鹽酸在60 °C下解離8?lOmin，清洗，再用卡寶品紅染色3?5min，壓片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色體，選出染色體分散的細(xì)胞，鑒別染色體條數(shù)的加倍情況，獲得染色體數(shù)目2n=2x=40的為二倍體植株，染色體數(shù)目2n=4x=80的為四倍體植株，在同一個片子中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞染色體數(shù)目有部分為2n=4x=80、部分為2n=2x=40的確定為嵌合體;將二倍體植株棄之，即得到四倍體植株和嵌合體植株;檢測100株，獲得染色體數(shù)目2n=4x=80的四倍體植株73株，變異率為50.23%;染色體數(shù)2n=2x=40的二倍體植株25株，嵌合體植株2株，嵌合率為1%;相對傳統(tǒng)秋水仙素處理誘變率提高1?20%，嵌合率降低10%左右；
(7)將步驟(6)所得四倍體植株接種到下列繼代培養(yǎng)基中:MS+6-BA3mg/L +NAA
0.5mg/L+蛋白胨2g/L+蔗糖25g/L+香蕉100g/L+活性炭3g/L+瓊脂7g/L，并在溫度25 土TC、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直到長出2?3個幼嫩根，用新的幼嫩根進(jìn)行染色體鑒定;繼代培養(yǎng)三次，每次繼代培養(yǎng)后均進(jìn)行染色體鑒定一次，三次鑒定均為四倍體植株的，確定為雜交蘭多倍體植株；
(8)將步驟(6)所得嵌合體植株接種到下列繼代培養(yǎng)基中:MS+6-BA3mg/L +NAA
0.5mg/L+蛋白胨2g/L+蔗糖25g/L+香蕉100g/L+活性炭3g/L+瓊脂7g/L，并在溫度25 土TC、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直到長出2?3個幼嫩根，用新的幼嫩根進(jìn)行染色體鑒定，繼代培養(yǎng)三次，每次繼代培養(yǎng)后均進(jìn)行染色體鑒定一次，鑒定為四倍體植株的繼續(xù)完成剩余繼代培養(yǎng)和鑒定，鑒定為二倍體植株的棄之，鑒定仍為嵌合體植株的經(jīng)下列穩(wěn)定培養(yǎng):將鑒定仍為嵌合體植株接種到下列增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行脫分化誘導(dǎo)不定芽:MS+6-BA 3mg/L +NAA 0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭3g/L+瓊脂7g/L中，并在溫度25±1°C、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至嵌合體植株增殖形成不定芽，將該不定芽分離后，接種到下列繼代培養(yǎng)基中:MS+6-BA 3mg/L +NAA 0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+瓊脂7g/L，并在溫度25±1°C、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直到長出2?3個幼嫩根，用新的幼嫩根進(jìn)行染色體鑒定，鑒定為嵌合體植株的棄之，鑒定為多倍體植株的，確定為雜交蘭多倍體植株。
[0018]多倍體繼代多代后穩(wěn)定性好，沒有分離現(xiàn)象。多倍體增殖繼代再生率達(dá)到98%。
[0019]實(shí)施例2
(1)化學(xué)誘變劑的配制:稱取0.0lg安磺靈溶于Ig二甲基亞砜(DMSO)中溶解，再加入蒸餾水至I OOmL得到母液，然后將母液以蒸餾水稀釋至濃度為0.001?0.003%，再在121°C下進(jìn)行滅菌20min，待冷卻后即得到質(zhì)量濃度為0.001?0.003%的安磺靈溶液；
(2)處理材料的選擇處理:雜交蘭按常規(guī)莖尖誘導(dǎo)形成根狀莖培養(yǎng)I月后，選擇大小、部位一致的幼嫩根狀莖尖端，切下lcm，浸泡在步驟(I)所得安磺靈溶液中，浸泡時間為72小時，然后用滅菌蒸餾水清洗3次，用滅菌濾紙吸干水分，再接種到下列培養(yǎng)基中:M S +EMS70mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+蔗糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+瓊脂7g/L，pH值為5.4?5.8;并在溫度25 土 I °C、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)一個月；其中，EMS是以濃度為0.lmol/L、pH=7.0的磷酸緩沖液為溶劑配制濃度為70mg/L的EMS溶液(甲磺酸乙酯溶液)，經(jīng)過濾滅菌法后，即可用于培養(yǎng)基中；
(3)根狀莖的分化培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)后的根狀莖轉(zhuǎn)接到下列培養(yǎng)基中:MS+6-BA5mg/L +NAA lmg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+花寶I號 2.5g/L+花寶2號0.6g/L+花寶5號0.8g/L+瓊脂78/1，？!1值為5.4?5.8;并在溫度25±1°(:、光照強(qiáng)度1000?20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)，直到根狀莖形成組培苗，并長出幼嫩根；
(4 )變異植株形態(tài)鑒定:挑選步驟(3 )所得組培苗中植株器官巨大、葉色濃綠、葉片寬大肥厚、葉片卷曲、生長緩慢的根狀莖，即得到疑似多倍體植株；
(5)將步驟(4)所得疑似多倍體植株進(jìn)行下列氣孔鑒定;取疑似多倍體植株的葉下表皮，用光學(xué)顯微鏡觀察氣孔，當(dāng)氣孔直徑增大0.5?I倍、單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)明顯減少、且保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體大且顏色較深的，即初步判斷為多倍體變異植株；同一表皮上氣孔大小差異顯著的，即初步判斷為嵌合體植株；
(6)將步驟(5)所得多倍體變異植株和嵌合體植株進(jìn)行下列染色體鑒定:在上午9點(diǎn)到12點(diǎn)，細(xì)胞分裂旺盛時期，分別取步驟(5)所得多倍體變異植株和嵌合體植株的幼嫩根根尖I?1.5cm裝入離心管中，用質(zhì)量濃度為0.1%的秋水仙素浸泡4h后，清洗，再用卡諾固定液(無水乙醇:冰乙酸的體積比=3:1)固定24h后，清洗，然后用濃度為ImoI/L的鹽酸在60 °C下解離8?lOmin，清洗，再用卡寶品紅染色3?5min，壓片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色體，選出染色體分散的細(xì)胞，鑒別染色體條數(shù)的加倍情況，獲得染色體數(shù)目2n=2x=40的為二倍體植株，染色體數(shù)目2n=4x=80的為四倍體植株，在同一個片子中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞染色體數(shù)目有部分為2n=4x=80、部分為2n=2x=40的確定為嵌合體;將二倍體植株棄之，即得到四倍體植株和嵌合體植株；檢測100株，獲得染色體數(shù)目2n=4x=80的四倍體植株57株，多倍體的誘導(dǎo)率為45.6%