一種利用復合誘變劑誘導雜交蘭多倍體植株的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用復合誘變劑誘導雜交蘭多倍體植株的方法，屬于植物多倍體誘變育技術種領域。
【背景技術】
[0002]雜交蘭是國蘭與大花蕙蘭交配育出的新品種，目前在國內(nèi)有十幾種雜交蘭品種，如大鳳、黃金小神童、紫元素、芭蕾舞等。雜交蘭具有大花蕙蘭的花大、色艷及國蘭的幽雅清香等特點，深受國內(nèi)外人民的喜愛。近年來美國、日本、新西蘭等國的蘭花育種者將大花蕙蘭與建蘭、紋瓣蘭等雜交，已培育出一些早花、微香、短葉型或垂花型大花蕙蘭品種，很受消費者的歡迎。雜交蘭彌補了大花蕙蘭無香味的缺點，就其發(fā)展趨勢而言，有逐步替代一些陳舊的大花蕙蘭品種的可能。
[0003]“黃金小神童” [Cymbidium hubridumXCymbidium ensifolium(L.) Sw.]是大花蕙蘭與四季蘭素心的雜交種。葉質軟，葉面微凹，葉緣不后卷，平展，斜立，葉色藍綠，長40?50厘米。假鱗莖橢圓形，較小(長3.5厘米，寬3厘米)，似建蘭?；ㄇo細，直立無彎曲，整個花型極似建蘭“黃金素”，但花徑更大，最大可達9厘米，一個花葶有6?9朵花，順序開放。是目前蘭花市場上常見的雜交蘭品種，自問世以來就受到了眾多蘭友的追捧。該品種集合了親本大花蕙蘭和建蘭的優(yōu)點，花型較一般的國蘭品種要大，純正的黃色，花大，香氣雅致，形色兼具，鮮艷奪目，由于整個花朵毫無雜色，因而又被稱為“黃花素心”。此外，黃金小神童還繼承了建蘭的幽香。黃金小神童一年四季都能開花，在珠三角地區(qū)夏秋季開花較多，可人為將花期控制在年宵期間。每當花開之時，不僅能觀賞到美麗碩大的花朵，還能聞到陣陣幽香。
[0004]多倍體具有恢復種間和屬間雜交育性克服胚乳中染色體數(shù)目的不平衡現(xiàn)象等優(yōu)點，多倍體材料已在植物新品種的選育中廣泛應用，是推動植物進化的重要因素之一。多倍體由于染色體數(shù)目加倍個體外形往往具有巨大性，一般具有葉大，花大、莖粗、色深、細胞內(nèi)某些物質含量較高等特點；由于多倍體核體積增大而表現(xiàn)出耐輻射、耐紫外光、耐寒、耐旱等適應不利自然條件的能力，因而在植物育種上有重要的意義。特別是花的變大對觀花植物來說十分重要。
[0005]秋水仙素是常用的誘導多倍體的化學誘變劑，但其也有明顯的缺點，秋水仙素是一種神經(jīng)性毒劑，對人、畜及環(huán)境存在較大的安全隱患，且價格昂貴，使用劑量較高，會導致試驗材料的死亡，但處理濃度過低，則達不到染色體加倍的效果，誘變率較低。
[0006]因此，有必要對現(xiàn)有雜交蘭的誘變育種方案進行改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決現(xiàn)有誘變劑毒性大、用量大等問題，本發(fā)明提供一種利用復合誘變劑誘導雜交蘭多倍體植株的方法，以提高雜交蘭的誘變率，降低成本，縮短鑒別時間。
[0008]本發(fā)明通過下列技術方案實現(xiàn):一種利用復合誘變劑誘導雜交蘭多倍體植株的方法，經(jīng)過下列各步驟: (1)化學誘變劑的配制:配制質量濃度為0.001?0.003%的安磺靈溶液；
(2)處理材料的選擇處理:雜交蘭按常規(guī)莖尖誘導形成根狀莖培養(yǎng)I月后，選擇大小、部位一致的幼嫩根狀莖尖端，切下lcm，浸泡在步驟(I)所得安磺靈溶液中，浸泡時間為24?72小時，然后用滅菌蒸餾水清洗3次，用滅菌濾紙吸干水分，再接種到下列培養(yǎng)基中:MS+EMS20?70mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+瓊脂7g/L，pH值為5.4?5.8;并在溫度25±1°(:、光照強度1000?200011、光照1211/(1的條件下進行無菌培養(yǎng)一個月；
(3)根狀莖的分化培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)后的根狀莖轉接到下列培養(yǎng)基中:MS+6-BA5mg/L +NAA lmg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+花寶I號 2.5g/L+花寶2號0.6g/L+花寶5號0.8g/L+瓊脂78/1，？!1值為5.4?5.8;并在溫度25±1°(:、光照強度1000?20001x、光照12h/d的條件下進行分化培養(yǎng)，直到根狀莖形成組培苗，并長出幼嫩根；
(4 )變異植株形態(tài)鑒定:挑選步驟(3 )所得組培苗中植株器官巨大、葉色濃綠、葉片寬大肥厚、葉片卷曲、生長緩慢的根狀莖，即得到疑似多倍體植株；
(5)將步驟(4)所得疑似多倍體植株進行下列氣孔鑒定;取疑似多倍體植株的葉下表皮，用光學顯微鏡觀察氣孔，當氣孔直徑增大0.5?I倍、單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)明顯減少、且保衛(wèi)細胞內(nèi)葉綠體大且顏色較深的，即初步判斷為多倍體變異植株；同一表皮上氣孔大小差異顯著的，即初步判斷為嵌合體植株；
(6)將步驟(5)所得多倍體變異植株和嵌合體植株進行下列染色體鑒定:在上午9點到12點，細胞分裂旺盛時期，分別取步驟(5)所得多倍體變異植株和嵌合體植株的幼嫩根根尖I?1.5cm裝入離心管中，用質量濃度為0.1%的秋水仙素浸泡4h后，清洗，再用卡諾固定液(無水乙醇:冰乙酸的體積比=3:1)固定20?24h后，清洗，然后用濃度為lmol/L的鹽酸在60°C下解離8?lOmin，清洗，再用卡寶品紅染色3?5min，壓片，在光學顯微鏡下觀察染色體，選出四倍體植株和嵌合體植株；
(7)將步驟(6)所得四倍體植株進行繼代培養(yǎng)三次，每次繼代培養(yǎng)后均進行染色體鑒定一次，三次鑒定均為四倍體植株的，確定為雜交蘭多倍體植株；
(8)將步驟(6)所得嵌合體植株進行繼代培養(yǎng)三次，每次繼代培養(yǎng)后均進行染色體鑒定一次，鑒定為四倍體植株的繼續(xù)完成剩余繼代培養(yǎng)和鑒定，鑒定為二倍體植株的棄之，鑒定仍為嵌合體植株的經(jīng)穩(wěn)定培養(yǎng)，確定為雜交蘭多倍體植株。
[0009 ] 所述步驟(I)的安磺靈溶液是稱取0.0I g安磺靈溶于I g二甲基亞砜(DMS0)中溶解，再加入蒸餾水至10mL得到母液，然后將母液以蒸餾水稀釋至濃度為0.001?0.003%，再在121°C下進行滅菌20min，待冷卻后即得到安磺靈溶液。
[0010]所述步驟(2)的EMS是以濃度為0.1mol/L、pH=7.0的磷酸緩沖液為溶劑配制濃度為20?70mg/L的EMS溶液(甲磺酸乙酯溶液)，經(jīng)過濾滅菌法后，即可用于培養(yǎng)基中。
[0011 ]所述步驟(6 )的選出四倍體植株和嵌合體植株是選出染色體分散的細胞，鑒別染色體條數(shù)的加倍情況，獲得染色體數(shù)目2n=2x=40的為二倍體植株，染色體數(shù)目2n=4x=80的為四倍體植株，在同一個片子中發(fā)現(xiàn)細胞染色體數(shù)目有部分為2n=4x=80、部分為2n=2x=40的確定為嵌合體;將二倍體植株棄之，即得到四倍體植株和嵌合體植株。
[0012]所述步驟(7)的繼代培養(yǎng)是把四倍體植株接種到下列繼代培養(yǎng)基中:MS+6_BA3mg/L +NAA 0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+瓊脂 7g/L，并在溫度25±1°C、光照強度1000?20001x、光照12h/d的條件下進行繼代培養(yǎng)，直到長出2?3個幼嫩根，用新的幼嫩根進行染色體鑒定。
[0013]所述步驟(8)的嵌合體植株接種到下列繼代培養(yǎng)基中:MS+6-BA 3mg/L +NAA
0.5mg/L+蛋白胨2g/L+蔗糖25g/L+香蕉100g/L+活性炭3g/L+瓊脂7g/L，并在溫度25 土TC、光照強度1000?20001x、光照12h/d的條件下進行繼代培養(yǎng)，直到長出2?3個幼嫩根，用新的幼嫩根進行染色體鑒定。
[0014]所述步驟(8)的穩(wěn)定培養(yǎng)是將鑒定仍為嵌合體植株接種到下列增殖培養(yǎng)基中進行脫分化誘導不定芽:MS+6-BA 3mg/L +NAA 0.5mg/L+蛋白胨2g/L+鹿糖25g/L+香蕉10g/L+活性炭3g/L+瓊脂7g/L中，并在溫度25±1°C、光照強度1000?20001x、光照12h/d的條件下進行培養(yǎng)，直至嵌合體植株增殖形成不定芽，將該不定芽分離后，接種到下列繼代培養(yǎng)基中:MS+6-BA 3mg/L +NAA 0.5mg/L+蛋白胨 2g/L+鹿糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+瓊脂7g/L，并在溫度25±1°C、光照強度1000?20001x、光照12h/d的條件下進行繼代培養(yǎng)，直到長出2?3個幼嫩根，用新的幼嫩根進行染色體鑒定，鑒定為嵌合體植株的棄之，鑒定為多倍體植株的，確定為雜交蘭多倍體植株。
[0015]本發(fā)明具備的優(yōu)點及效果:本發(fā)明采用EMS(甲基磺酸乙酯)和安磺靈兩種化學誘變組合使用提高雜交蘭的誘變率，內(nèi)蘭花根狀莖的誘變率都達到30%以上，最高為50.23%，該方法與傳統(tǒng)利用秋水仙素誘導根狀莖的方法(尹翠翠等人以0.10%的秋水仙素處理48h，最佳變異率為36%)相比，多倍體誘變率平均提高10?20%。本發(fā)明最高死亡率為10%，死亡率與傳統(tǒng)方法(鄧櫻等人用秋水仙素誘導蘭屬“素心黃”多倍體，秋水仙素濃度為0.1%處理3d，死亡率達到95.1%，嵌合率最高為13.6%)相比降低80%、嵌合率降低10%。本發(fā)明EMS和安磺靈具有低毒、用量少，降低成本，減少嵌合體形成，提高多倍體的變異率，繼代三代以后多倍體穩(wěn)定，縮短鑒別時間的