LFS RPA試驗擴增條件優(yōu)化
[0105] 我們W提取純化的病毒DNA或者標準DNA質粒為模板進行擴增，實驗體系如下： 14.75化水解緩沖液（rehydration buffer,TwistDx nfo Kit,Cambridge,United Kingdom)，1.05化上游引物（lOiiM)，1.05化下游引物（10山〇，0.3化的RPA nfO探針（10山〇，2 JiL的DNA模板，4.6化的d地2〇 W及I.化化的醋酸儀(magnesium ace1:ate，280mM)。
[0106] 其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示：
[0107] 上游引物:5'-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3'（沈Q ID N0.1 所示） [010引 下游引物：5'-biotin-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3'（沈Q ID N0.2 所示）
[0109] 探針：5 ' -FAM-ACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTG
[0110] -THF-ATGGCCACTAATATGTG-P-3'（沈Q ID 備.4所示）。
[0111] 反應條件為38°C，反應可在20min之內(nèi)完成。結束后使用側流層析試紙條 (Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)對結果進行檢測。本發(fā)明分別用該體系 對合成的=對上游引物和=對下游引物與探針的組合進行評價，評價結果表明其中一對引 物(Fn2/Rn2)與探針的組合能夠產(chǎn)生最強的擴增信號，因此，該引物對與探針進行組合應用 到本發(fā)明中。
[0112] 隨后，我們測試了38°C條件下，不同解育時間對于擴增結果的影響，我們試驗了 Omin、Imin、5min、IOmin、15min、20min、25min、30min 的試驗結果，如圖 IB 所示，在擴增 IOmin 的時候，試驗條帶上出現(xiàn)微弱的條帶，當反應時間在15min-30min之間時試驗條帶沒有出現(xiàn) 可觀測的差異，因此，我們選擇20min作為該試驗的解育時間，如沒有特殊提示，本發(fā)明中使 用的解育時間均為20min。
[0113] LFS RPA試驗檢測結果判定:一個樣品在特定的條件下（38°C，20min)試紙條上控 制線為陽性，并且試驗線為陽性的樣品為陽性樣品;試紙條上控制線為陽性，而試驗線為陰 性的樣品為陰性樣品。
[0114] 6、LFS RPA試驗靈敏度W及特異性檢測
[0115] 在進行LFS RPA試驗的靈敏度檢測時，按照上述體系加入反應物。使用模板為上述 合成的標準質粒，通過核酸測定儀測定濃度計算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃度梯度為IO 6-IOi 拷貝共計6個梯度作為模板。反應溫度設為38°C的水浴鍋中進行，時間設定為20min，通過試 紙條終點檢測擴增結果。如圖3A所示，從該結果可W看出該試驗的敏感性為IO 2拷貝/反應， 并且該實驗具有較廣的檢測范圍，至少在IO6-IO2范圍內(nèi)的樣品均能被檢測出來。在進行LFS RPA試驗的特異性的檢測時，按照上述體系加入反應物。其中使用模板分別為豬繁殖與呼吸 綜合癥病毒、豬攝病毒、2型豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒W(wǎng)及口蹄疫病毒。反應溫度設為38°C 的水浴鍋中進行，反應時間設定為20min。結果表明，只有PPV能夠很好的進行擴增，其他病 毒均不能擴增，因此，該方法具有很好的特異性，結果如圖3BW及表5所示。
[0116] 表5評估LFS RPA試驗的特異性
[0119] neg:代表陰性對照;pos:代表陽性對照
[0120] 7、LFS RPA試驗檢測臨床樣品
[0121] 首先，我們用LFS RPA試驗測試qPCR確認的8份陽性樣品和6份陰性樣品，LFS RPA 試驗結果表明：qPC閒角認的10份陽性樣品均為陽性，qPC閒角認的6份陰性樣品均為陰性，結 果如圖4所示。
[0122] qPCR檢測方法參照文獻（Simultaneous detection of porcine parvovirus and porcine circovirus type 2by duplex real-time PC民 and amplicon melting curve analysis using SYB民 Green.Zheng,L.L.，et al.，J Virol Methods,2013.187(1):p.15-9.)中的方法進行。
[0123] 我們用建立的LFS RPA方法來檢測采集自甘肅省的臨床樣品(n = 33)W及健康豬 的血清樣品(n = 12)，并將檢測結果與qPCR的檢測結果相比較。結果表明12份健康豬的血清 樣品LFS RPA檢測結果和qPCR檢測結果一致，均都為陰性。在33份臨床樣品中，real-time RPA檢測結果為5份陽性樣品，而qPCR檢測結果為6份陽性樣品（其中5份陽性樣品為LFS RPA 檢測陽性樣品，另外一份為LFS RPA檢測陰性樣品）?；跈z測的45份樣品，與qPCR檢測結果 相比較，LFS RPA的敏感性和特異性分別為98%和100%。
[0124] 表6分別比較real-time PRA試驗和qPCR試驗臨床樣品檢測結果
[0126]綜上可見，本發(fā)明設計合成的一對引物和一條探針基因序列W及其形成的試紙條 RPA(LFS RPA)方法可W快速診斷PPV，而且該檢測方法簡單、快速、檢測結果真實可靠。
【主權項】
1. 一種用于快速檢測豬細小病毒的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于包括有一對 引物和一條探針， 其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示： 上游引物：5 ' -TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3， 下游引物：5 ' -TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3 ' 探針：5 ' -AAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAAC -FAM-dT-G-THF-A-BHQl-dT-GGCCACTAATATGTG-P-3 '。2. 如權利要求1所述的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括水解 緩沖液，醋酸鎂以及ddH20。3. 如權利要求1或2所述的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于用于檢測豬細小病毒 時，反應體系如下：14.7 5yL的水解緩沖液，1.0 5yL的1 ΟμΜ上游引物，1.0 5yL的1 ΟμΜ下游引 物，0.075yL的ΙΟμΜ探針，2yL的病毒DNA模板，4.825yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸鎂； 擴增反應在溫度設定為37-39°C的實時熒光定量PCR儀中進行，反應時間為20min-lh， 結束后通過Mx3005P軟件對結果進行分析。4. 如權利要求3所述的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于擴增反應在溫度設定為38 °(：的實時熒光定量PCR儀中進行，反應時間為20min，結束后通過Mx3005P軟件對結果進行分 析。5. 權利要求1-4任一項所述的實時熒光RPA檢測試劑盒在制備檢測豬細小病毒試劑中 的用途。6. -種用于快速檢測豬細小病毒的試紙條RPA檢測試劑盒，含有側流層析試紙條，其特 征在于還包括有一對引物和一條探針， 其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示： 上游引物：5 ' -TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3， 下游引物：5 ' -biot in-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3 ' 探針：5 ' -FAM-ACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTG -THF-ATGGCCACTAATATGTG-P-3 '。7. 如權利要求6所述的試紙條RPA檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括水解緩 沖液，醋酸鎂以及ddH20。8. 如權利要求6或7所述的試紙條RPA檢測試劑盒，其特征在于用于檢測豬細小病毒時， 反應體系如下：14.75yL的水解緩沖液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引物， 0.3yL的ΙΟμΜ探針，2yL的病毒DNA模板，4.6yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸鎂； 擴增反應在溫度設定為37-39 °C的水浴鍋中進行，反應時間為10min-30min，結束后使 用側流層析試紙條對結果進行檢測。9. 如權利要求8所述的試紙條RPA檢測試劑盒，其特征在于擴增反應在溫度設定為38 °C 的水浴鍋中進行，反應時間為20min，結束后使用側流層析試紙條對結果進行檢測。10. 權利要求6-9任一項所述的試紙條RPA檢測試劑盒在制備檢測豬細小病毒試劑中的 用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測豬細小病毒(PPV)的實時熒光RPA(PPV？real-time？RPA)試劑盒及其用途，還公開了一種快速檢測PPV的試紙條RPA(LFS？RPA)試劑盒及其用途。該兩種試劑盒分別包括SEQ？ID？NO.1及2所示的引物及各自的探針，雖然針對同一靶標序列，但引物和探針的修飾堿基和檢測平臺不同。實驗證明本發(fā)明的兩個試劑盒的敏感性均為102拷貝/反應，并均只能特異性檢測PPV。分別用本發(fā)明的兩個試劑盒檢測PPV疑似樣品，結果表明這兩個試劑盒的檢測結果與qPCR均具有很高的符合度。因此，本發(fā)明的兩個試劑盒均能快捷、高效、靈敏的檢測PPV，為PPV的鑒別診斷提供了有效技術手段。
【IPC分類】C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN105603123
【申請?zhí)枴緾N201610049300
【發(fā)明人】楊洋, 張志東, 秦曉東
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月25日