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快速檢測豬細小病毒的實時熒光rpa試劑盒、試紙條rpa試劑盒及其用圖

文檔序號:9838704閱讀:714來源:國知局
快速檢測豬細小病毒的實時熒光rpa試劑盒、試紙條rpa試劑盒及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種檢測豬細小病毒的試劑盒及其用途,特別設及一種基于RPA反應 的用于快速檢測豬細小病毒的實時巧光RPA試劑盒W及試紙條RPA試劑盒,還設及二者在快 速檢測豬細小病毒中的用途,本發(fā)明屬于預防獸醫(yī)學檢驗領域。
【背景技術】
[0002] 自PCR技術誕生W來已經(jīng)有S十年了。從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字 PCR,運一技術在不斷蟻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術需要特殊昂貴的熱循環(huán)儀器 W及熟練的操作人員,費時費力,難W用在現(xiàn)場診斷W及實驗條件差的地方。在發(fā)展中國家 實驗室中,由于PCR實施所需要的基礎設備和技術所限,大多數(shù)發(fā)展中國家仍然集中在使用 傳統(tǒng)的試驗方法,比如血清學方法、顯微鏡技術,或者培養(yǎng)W及鑒定傳染性W及非傳染性疾 病。為了填補傳統(tǒng)方法和PCR之間的空缺,新的等溫分子診斷技術正在開發(fā),該方法尤其適 用于基礎設施、實驗設備W及試驗技術難于支持使用PCR進行診斷的地方。
[0003] 英國TwistDx Inc公司開發(fā)的重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Ampl if ication,RPA)被稱為是可W替代PCR的核酸檢測技術。W此為基礎的TwistAmp坂核 酸擴增產(chǎn)品能夠在15分鐘內(nèi),37°C-42°C之間進行核酸檢測?,F(xiàn)在使用最多的、最為成熟的 為進行實時監(jiān)控的體系(如TwistAmp?exo試劑盒,real-time RPA)W及基于試紙條的終 點檢測(TwistAmp 愈nfo 試劑盒,Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test,LFS RPA)。
[0004] 實時巧光RPA(real-time RPA)試驗需要能激發(fā)并檢測巧光基團的恒溫儀器,比如 酶標儀或?qū)崟r檢測的熱循環(huán)儀。自開發(fā)W來,該技術已經(jīng)被廣泛的應用到人類疾病、獸醫(yī)藥 物、食品工業(yè)W及農(nóng)業(yè)中,比如用于±拉弗朗西斯菌、細螺旋體、HIV-IDNA、鼠疫桿菌、炭痘 桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱 病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病 毒性腹瀉病毒、黃熱病毒W(wǎng)及戈登病毒等病原的檢測。
[0005] 對于試紙條RPA(LFS RPA)試驗而言,只要溫度能控制在37-42°C之間就行,比如可 W在水浴鍋等設置中進行反應,或者直接用人的體溫進行加熱,隨后可W通過側(cè)流層析試 紙條LFS(Hyb;ridetect2T,MileniaBiotecGmbH,Ge;rmany)讀取試驗結果。自開發(fā)W來,該 技術已經(jīng)被廣泛的應用到人類疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)W及農(nóng)業(yè)中,比如用于感染性皮下 及造血組織壞死病毒(IHHNV)、惡性追原蟲、洋李痘瘤病毒、弟蟲、力克次體、隱抱子蟲W及 黃熱病毒等的檢測。與常規(guī)方法相比較,該實驗具有很高的敏感性和特異性。
[0006] 與常規(guī)方法相比較,等溫擴增實驗具有很高的敏感性和特異性,運些原因促使不 同的公司商業(yè)化不同的等溫擴增技術,比如,環(huán)介導的擴增(LAMP; Eiken,日本),RPA(RPA; Mere,USA and TwistDx,UK),鏈置換擴增(strand displacement amplification,Becton Dickson, USA)。在運些技術中,LAMP是使用最為廣泛,且最成熟的試驗方法。與RPA方法相比 較,LAMP技術具有試驗設計比較麻煩(3對引物),特異性相對較弱(能擴增很多條帶),時間 仍然相對較長,W及易于污染等不足的地方。
[0007] 豬細小病毒(porcine parvovirus virus,PPV)是細小病毒科,細小病毒亞科,細 小病毒屬的成員。該病毒是目前動物病毒中最小最簡單的一類單鏈線狀DNA病毒。豬細小病 毒病是由細小病毒引起的一種W母豬繁殖障礙為主要特征的病毒性傳染病。懷孕母豬早期 感染豬細小病毒時容易引起流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒木乃伊化等特征。該病毒感染仔豬時會引 起仔豬的皮炎和腹瀉癥狀。我國已經(jīng)在北京、上海、甘肅、河南、黑龍江、四川等多地發(fā)生該 病的流行。隨著大型集約化養(yǎng)豬場的大量出現(xiàn),該病呈現(xiàn)上升趨勢并給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的 經(jīng)濟損失。因此,建立一種快速、簡單、特異、敏感的檢測方法來檢測PPV對于該病的防控起 著關鍵的作用。
[0008] Chienjin Huang等(Multiplex PCR for rapid detection of pseudorabies virus,porcine parvovirus and porcine circoviruses,Huang,C.,et al.,Veterinary Microbiology 101(2004)209-214)建立了一種能夠同時檢測豬偽狂犬病病毒,豬細小病毒 和豬圓環(huán)病毒的多重PCR檢測方法。該方法的缺點在于需要復雜的試驗設備W及熟練的操 作人員,而且需要較長的試驗時間(大約2.化),此外由于需要跑核酸電泳膠,因此有污染的 可能性。
[0009] Lan-Ian Zheng等(Simultaneous detection of porcine parvovirus and porcine circovirus type 2by duplex real-time PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green.Zheng,L.L.,et al.,J Virol Methods,2013.187(1):p.15- 9.)公開了一種W基于SYBR Green的檢測豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的雙重實時巧光PCR 檢測方法。該方法的缺點在于需要復雜的試驗設備W及熟練的操作人員,而且需要較長的 試驗時間(大約1.化)。此外由于SYBR Green I非特異性結合所有的雙鏈DNA,因此,該方法 的特異性相對較差。
[0010] 本發(fā)明針對PPV的NSl基因,建立并評估了基于巧光探針的RPA(real-time RPA)檢 測試劑盒W及基于試紙條的LFS RPA檢測試劑盒W實現(xiàn)快速檢測PPV的目的,據(jù)我們所知, 國內(nèi)外尚無建立運樣的試劑盒用于檢巧腫V。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能快速、簡單、特異的鑒定豬細小病毒的 檢測方法及試劑盒。
[001^ 為了達至化述目的,本發(fā)明采用了 W下技術手段:
[001引本發(fā)明發(fā)明人針對PPV的NSl基因設計引物和探針。同時通過對來自于GenBank中 的KF429255.1,JX871883.1,JN872448.1,抓790642.1,EU790641.1,L23427.1,M38367.1, M32787.1,D00623.1,KF429254.1,JQ710893.1,KF429252.1,JQ710888.1和AY502114.1的 NSl基因同源序列進行比對分析,進一步確定了豬細小病毒NSl基因的保守區(qū)域,針對該區(qū) 域設計引物和探針,W期能夠檢測到盡可能多的豬細小病毒。所有的引物和探針都由生工 生物(上海,中國)合成。本發(fā)明分別設計合成了=對上游引物和=對下游引物,通過對引物 與探針組合進行擴增效果評價,最終將其中一對能夠產(chǎn)生最強的擴增信號的引物對與探針 組合應用到本發(fā)明中。針對實時巧光RPA(real-time RPA)與試紙條RPA(LFS RPA, Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的 不同檢測特點,本發(fā)明分別設計了用于實時巧光RPAW及試紙條RPA檢測的引物和探針序 列,該兩種試劑盒針對同一祀標序列,但引物和探針的修飾堿基和檢測平臺不同。
[0014]本發(fā)明一種用于快速檢測豬細小病毒的實時巧光RPA(real-time RPA)檢測試劑 盒,包括有一對引物和一條探針,
[001引其中,所述的一對引物和一條探針的序列如下所示:
[0016] 上游引物:5'-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3'(沈Q ID N0.1 所示)
[0017] 下游引物:5'-16416〔414146口'46〇:4176176(:1766144〇:-3'(沈9 10備.2所示) [001 引 探針:5 ' -AAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAAC
[0019] -(FAM-dT)-G-THF-A-(B冊l-dT)-GGCCACTAATATGTG-P-3'(沈Q ID ^.3所示)。
[0020] 其中,B冊1-dT表示攜帶有巧光澤滅基團BHQl的胸腺喀晚核巧酸,THF表示四氨巧 喃連接子,F(xiàn)AM-dT表示攜帶有巧光素基團的胸腺喀晚核巧酸,P表示憐酸,用于阻止鏈的延 伸。
[0021] 在本發(fā)明所述的實時巧光RPA檢測試劑盒中,優(yōu)選的,所述試劑盒中還包括水解緩 沖液,醋酸儀W及dd出0。
[0022] 使用本發(fā)明所述的實時巧光RPA檢測試劑盒檢測豬細小病毒,優(yōu)選的,反應體系如 下:14.75化的水解緩沖液,1.0扣L的IOiiM上游引物,1.0扣L的IOiiM下游引物,0.075化的IOy M探針,2化的病毒DNA模板,4.825化的d地2〇 W及1.化化的280mM醋酸儀;
[0023] 擴增反應在溫度設定為37-39°C的實時巧光定量PCR儀中進行,反應時間為20min-化,結束后通過MX3005P軟件對結果進行分析。
[0024] 更優(yōu)選的,擴增反應在溫度設定為38°C的實時巧光定量PCR儀中進行,反應時間為 20min,結束后通過MX3005P軟件
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