煙草轉(zhuǎn)化，最終獲得 轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)含有AACP不同區(qū)段dsRNA的陽性轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行大麗輪枝 菌接種和病情指數(shù)分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌的抗性明顯提高，病情指數(shù)下降約 55-80%。通過提取轉(zhuǎn)基因煙草根部DNA進(jìn)行真菌生物量分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因陽性煙草的 真菌生物量明顯降低，僅為野生型的30-65%。靶標(biāo)基因的表達(dá)量分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙 草靶標(biāo)基因的表達(dá)量均明顯降低，其中RNAi-3組內(nèi)AACP基因表達(dá)量的下降量可達(dá)75%左 右。通過病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)、真菌生物量分析以及靶標(biāo)基因的表達(dá)量分析結(jié)果，可以明顯觀察 到RNAi-3組（靶標(biāo)片段的核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示）轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌具有更 強(qiáng)的抗性，說明AACP基因的區(qū)段3(核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示）作為靶標(biāo)片段設(shè)計(jì) dsRNA，可以達(dá)到最佳的干擾效果，從而可以有效降低病原菌的致病力。
[0020] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0021] 本發(fā)明采用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（Host-induced gene silencing)，以高致 病力的大麗輪枝菌株V991為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)大麗輪枝菌AACP序列信息，設(shè)計(jì)引物克隆獲得 針對(duì)靶標(biāo)基因的5個(gè)不同區(qū)段，從中篩選獲得了能夠明顯降低植物病情指數(shù)的3個(gè)靶標(biāo)區(qū) 段，進(jìn)一步構(gòu)建載體，獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物。通過病情指數(shù)分析以及檢測(cè)真菌生物量 和靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平，篩選到效果最佳的干擾區(qū)段，其核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示。 本發(fā)明所述大麗輪枝菌AACP基因的3段靶基因片段以及RNA干擾載體能夠應(yīng)用于提高植 物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性，培育抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
[0022] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語宙義
[0023] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0024] 術(shù)語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其 包括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除 非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡 并密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一 個(gè)以上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí) 現(xiàn)簡并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid. Res. 19:5081 (1991) ;011丨8111^等人，工 Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes. 8:91-98(1994))〇
[0025] 術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明核苷酸的細(xì)胞，而不管使用 何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0026] 術(shù)語"RNA干擾（RNA interference, RNAi) "意指通過外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA在 細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0027] 圖1為VIGS載體信息；
[0028] 圖2為VIGS不同區(qū)段擴(kuò)增結(jié)果；其中，M :marker ; 1-5為針對(duì)AACP基因的不同區(qū) 段擴(kuò)增結(jié)果；
[0029] 圖3為VIGS干擾載體酶切驗(yàn)證；其中，M為marker ; 1-5為針對(duì)AACP基因構(gòu)建VIGS 質(zhì)粒的酶切結(jié)果；
[0030] 圖4為病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)；
[0031] 圖5為RNAi載體信息；其中，A :pD0NR207載體信息；B :pK7GWIWG2 (I)，0載體信 息；
[0032] 圖6為RNAi擴(kuò)增結(jié)果；其中，M為marker ; 1，2，3為針對(duì)AACP的擴(kuò)增條帶，N為陰 性對(duì)照；
[0033] 圖7為轉(zhuǎn)基因陽性煙草PCR檢測(cè)；其中，M :marker，1-6為轉(zhuǎn)基因煙草，wt為野生 型煙草，N為陰性對(duì)照；
[0034] 圖8為轉(zhuǎn)基因陽性煙草PCR檢測(cè)；其中，M :marker，1-6為轉(zhuǎn)基因煙草，wt為野生 型煙草，N為陰性對(duì)照；
[0035] 圖9為轉(zhuǎn)基因陽性煙草PCR檢測(cè)；其中，M :marker，1-6為轉(zhuǎn)基因煙草，wt為野生 型煙草，N為陰性對(duì)照；
[0036] 圖10為轉(zhuǎn)基因煙草病情指數(shù)分析；
[0037] 圖11為植物體內(nèi)真菌生物量分析；
[0038] 圖12為真菌體內(nèi)靶標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量分析。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040] 1、材料
[0041] 1.1 煙草
[0042] 本氏煙草（Nicotiana benthamiana)品系。
[0043] 培養(yǎng)條件：種植于高溫高壓滅菌的混合營養(yǎng)土（芳潔營養(yǎng)土 ：蛭石=1 :1)中，溫 度23±2°C，相對(duì)濕度75±5%，光周期L :D為16h :8h。1. 2菌株和質(zhì)粒
[0044] 棉花黃萎病原菌：大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)V991，高致病力落葉型菌 株，由中國農(nóng)科院植保所簡桂良研究員惠贈(zèng)。
[0045] 病毒載體：煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)雙元載體（TRVl與TRV2) 由清華大學(xué)劉玉樂教授惠贈(zèng)。
[0046] 農(nóng)桿菌：菌株GV3101和LBA4404,由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。
[0047] 植物穩(wěn)定遺傳載體：PD0NR207和pK7GWIWG2 (I)，0載體由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。
[0048] 實(shí)施例1大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的ADP-ATP載體蛋白病程關(guān)鍵革巴 基因篩選
[0049] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0050] I. I VIGS干擾載體的構(gòu)建
[0051] 為了獲得針對(duì)靶標(biāo)基因最佳干擾效果的片段，根據(jù)大麗輪枝菌ADP，ATP carrier protein (VDAG_07535. DcDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物（表1)，引物兩端帶有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，分別對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。然 后將回收得到的片段分別連接至TRV2載體中，通過酶切和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，并將驗(yàn)證好的質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中。
[0052] 表1 AACP不同區(qū)段引物信息
[0054] 注：加粗處為酶切位點(diǎn)。
[0055] I. 2 VIGS 轉(zhuǎn)化方法
[0056] 將含有TRVl和TRV2+靶標(biāo)基因片段質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單克隆分別放于LB液體培養(yǎng)基 (25 μ g/mL Rif和50 μ g/mL Kan)中，28°C搖床過夜培養(yǎng)。然后將菌液（比例為2% )加入 LB液體培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，28°C搖床振蕩培養(yǎng)0D_至0. 5-0. 6時(shí)，低溫離心收集菌體。將菌 體重懸于注射基質(zhì)（IOmM MESUOmM MgCl2、100 μ M乙酰丁香酮）中，調(diào)整0D6。。至0.8-1. 0。 把兩種菌液（TRVl與TRV2+靶標(biāo)基因片段）以1 :1混合，在室溫中靜置3-5h，不要搖動(dòng)。最 后利用注射器將含有注射基質(zhì)的農(nóng)桿菌注射于最嫩的葉片中。
[0057] 1. 3真菌的培養(yǎng)以及植物接種方式
[0058] 將大剛輪枝菌孢子培養(yǎng)于液體CM培養(yǎng)基中，25°C振蕩培養(yǎng)5-7天。經(jīng)5層紗布過 濾，離心收集孢子。用蒸餾水稀釋，并在顯微鏡下觀察，將孢子濃度調(diào)整至IO6個(gè)/ml后備 用。
[0059] 選取長勢(shì)一致的本氏煙草幼苗進(jìn)行大麗輪枝菌接種。用鑷子從根部將幼苗挖出， 并在蒸餾水中清洗根部泥土。將幼苗根部完全浸泡于稀釋好的IO6個(gè)/mL孢子懸液或蒸餾 水中2min，取出。盡快將幼苗移回原來的塑料缽中，并澆水，使土壤濕潤。
[0060] 1. 4植物病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)
[0061] 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)（李海濤，張子君，楊國棟，鄒慶道，呂書文.前子黃萎病抗病性 鑒定.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004, 1:4-6 ;20.王忠，楊清，黃萎病菌脅迫下野生茄子托魯巴姆防 衛(wèi)反應(yīng)的生理生化分析.中國生物工程雜志，2011，31:65-71.)并做出適當(dāng)調(diào)整，制定本發(fā) 明中本氏煙草感染大麗輪枝菌的病情指數(shù)（表2)。
[0062] 表2病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)
[0064] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0065] 2. 1大麗輪枝菌AACP干擾載體的構(gòu)建
[0066] 本發(fā)明采用的為清華劉玉樂老師提供的煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus， TRV)載體（圖1)。TRV的cDNA位于雙35S啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶終止子（nopal ine synthase terminator，NOSt)之間。TRVl 包含了 病毒的 RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp)、可移動(dòng)蛋白（Movement Protein，MP)、16kDa 富含 半胱氨酸區(qū)域等其它元件。TRV2包含病毒的衣殼蛋白（Coat protein，CP)、多克隆位點(diǎn) (multiple cloning site，MCS)等其它元件。多克隆位點(diǎn)的引入，方便了外源基因的插入。
[0067] 本發(fā)明根據(jù)大麗輪枝菌AACP序列信息（其核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示），設(shè) 計(jì)引物，克隆獲得針對(duì)靶標(biāo)基因的5個(gè)不同區(qū)段（圖2)，其核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No