大麗輪枝菌adp-atp載體蛋白病程關鍵靶基因及其干擾載體和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及大麗輪枝菌ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因，還涉及含有所述 ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因的RNA干擾載體，本發(fā)明還涉及所述大麗輪枝菌ADP-ATP 載體蛋白病程關鍵靶基因或干擾載體在提高植物對大麗輪枝菌抗病性中的應用，屬于大麗 輪枝菌病程關鍵基因的克隆及應用領域。
【背景技術】
[0002] 棉花黃萎病于1914年首次在美國發(fā)現(xiàn)，目前已成為一種世界性的病害，其病原菌 為大麗輪枝菌大麗輪枝菌Verticillium dahliae，屬于半知菌亞門（Deuteromycotina)、 淡色孢科（Moniliaceae)、輪枝菌屬（Verticillium)，它不僅嚴重危害棉花的纖維質量和 皮棉產(chǎn)量，還可危害40科660種植物，其中農(nóng)作物184種，雜草153種（Rowe R. C.，Davis J. R. , Powelson M. L.,et al. Potato early dying:causal agents and management strategies. Plant Disease 1987,71:482-489)〇
[0003] ATP-ADP 載體蛋白（ADP，ATP carrier protein，AACP，VDAG-07535. I)作 為真核生物體線粒體膜上一種跨膜蛋白（Kim Y. H.，Haidl G.，Schaefer M.，et al. Compartmentalization of a unique ADP/ATP carrier protein SFEC (Sperm Flagellar Energy Carrier，AAC4)with glycolytic enzymes in the fibrous sheath of the human sperm flagellar principal piece. Developmental Biology 2007, 302:463-476.)，介導線粒體與細胞質基質之間的ADP/ATP交換（K1 ingenberg M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica et Biophysica Acta 2008, 1778:1978-2021.)，在通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生ATP給細胞提 供能量的過程中起著中心的作用，是保持細胞內能量平衡的關鍵成分（Pebay-Peyroula E., Dahout-Gonzalez C. , Kahn R. , et al. Structure of mitochondrial ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside. Nature 2003,426:39-44)。AACP 與線粒體膜 上其它多種蛋白共同組成線粒體通透性轉換孔，對保持線粒體內的電化學平衡及穩(wěn)定狀態(tài) 具有重要作用（Kroemer G. , Zangami N. , and Susin S. A. Mitochondria and apotosis. Immumology Today 1997, 18:44-51.) 酵母的AACP2與多個蛋白復合體特有的大小和 成分有密切關系，例如線粒體載體家族（Claypool，S. M.，Oktay，Y.，Boontheung，P.，et al. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. Journal of Cell Biology 2008, 182:937-950.)〇 在酵母的遺傳轉化研究中，Pep4p和AACP可以調節(jié)線粒體的降解（Pereira C.，Chaves S., Alves S.,et al. Mitochondrial degradation in acetic acid-induced yeast apoptosis: the role of Pep4and the ADP/ATP carrier. Molecular Microbiology 2010, 76:1398-1410.) AACP不僅作為負責能量分子傳導的轉運蛋白，在細胞凋亡調控 網(wǎng)絡中也具有重要的作用（Tsujimoto Y.，and Shimizu S. Role of the mitochondrial membrane permeability transition in cell death. Apoptosis 2007, 12:835-840.)〇 因 此，AACP是生物體內能量產(chǎn)生與能量消耗的橋梁，與細胞的發(fā)育、繁殖和凋亡密切相關。
[0004] AACP在條形柄銹菌（Puccinia striiformis f. sp. Tritici)孢子萌發(fā)時的表達量 較少，在孢子形成時有大量表達。在病原菌與寄主植物相互作用的過程中，此基因的表達量 呈上升趨勢，這說明它在病原菌與植物互作的過程中可能發(fā)揮著重要功能（董艷玲.小麥 成株抗條銹病差異表達基因的cDNA-AFLP分析及小麥與條銹菌互作相關基因的克隆與特 征研究[博士學位論文].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2010)。
[0005] 目前對于AACP的研究主要集中于其與能量代謝之間的關系，在真菌中的研究較 少，尤其是其與致病性之間的關系。因此，以大麗輪枝菌的AACP作為靶標基因，研究其與病 原菌致病力之間的關系，對于提高植物對大麗輪枝菌的抗病性將具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的 ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因；
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵 靶基因的RNA干擾載體和宿主細胞；
[0008] 本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是將所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因 或RNA干擾載體應用于提高植物對大麗輪枝菌的抗病性。
[0009] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：
[0010] 本發(fā)明首先公開了大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的ADP-ATP載體蛋白 (ADP，ATP carrier protein，AACP)病程關鍵靶基因，其核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5 所示；優(yōu)選的，所述 ADP-ATP 載體 蛋白病程關鍵靶基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5所示。
[0011] 本發(fā)明采用寄主誘導的基因沉默技術（Host-induced gene silencing)，以高致 病力的大麗輪枝菌株V991為實驗材料，根據(jù)大麗輪枝菌AACP cDNA序列信息（其核苷酸序 列為SEQ ID No. 6所示），設計引物克隆獲得針對靶標基因的5個不同區(qū)段，其核苷酸序列 分別為SEQ ID No. 1-5所示。本發(fā)明進一步將克隆獲得的大麗輪枝菌基因的5個靶標片段 分別構建到TRV2載體中，成為VIGS系列RNAi載體并轉化農(nóng)桿菌，用于本氏煙草的注射，從 注射VIGS系列載體后的第8天進行大麗輪枝菌接種。病情指數(shù)分析結果表明，與空載相 比，注射真菌靶標基因片段的本氏煙草，病情指數(shù)均有所下降；其中分別注射VIGS系列載 體VIGS-I (靶標片段的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示）、VIGS-3(靶標片段的核苷酸序列 為SEQ ID No. 3所示）、VIGS-5 (靶標片段的核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示）的煙草，病 情指數(shù)一直保持在較低水平，初步說明它們與病原菌的致病性存在一定關系。
[0012] 本發(fā)明所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因能夠應用于提高植物對大麗輪枝 菌的抗病性，包括以下步驟：（1)構建含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因的RNA干 擾表達載體；（2)將所構建的RNA干擾表達載體轉化到植物或植物細胞中；(3)篩選獲得對 大麗輪枝菌抗病性提高的轉基因植物。
[0013] 本發(fā)明進一步公開了含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因的RNA干擾載體 以及含有所述RNA干擾載體的宿主細胞。
[0014] 構建含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因的RNA干擾載體的方法為本領域 技術人員所熟知，優(yōu)選為Gateway技術，只需BP反應和LR反應就可以完成RNA干擾表達載 體的構建。
[0015] 本發(fā)明所述RNA干擾載體也能夠應用于提高植物對大麗輪枝菌的抗病性，包括以 下步驟：（1)將所述RNA干擾表達載體轉化到植物或植物細胞中；(2)篩選獲得對大麗輪枝 菌抗病性提高的轉基因植物。
[0016] 本發(fā)明還公開了一種培育抗大麗輪枝菌的轉基因植物新品種的方法，包括以下步 驟：（1)構建含有所述ADP-ATP載體蛋白病程關鍵靶基因的RNA干擾表達載體；（2)將所構 建的RNA干擾表達載體轉化到植物或植物細胞中；（3)篩選獲得對大麗輪枝菌抗病性提高 的轉基因植物新品種。
[0017] 本發(fā)明所述轉化的方案以及將所述核苷酸引入植物的方案可視用于轉化的植物 或植物細胞的類型而變化。將所述核苷酸引入植物細胞的合適方法包括：顯微注射、電穿 孔、農(nóng)桿菌介導的轉化和直接基因轉移等。
[0018] 本發(fā)明所述植物包括：大麗輪枝菌的寄主植物，優(yōu)選為農(nóng)作物，包括：棉花、煙草、 番茄、馬鈴薯、甜瓜、西瓜、黃瓜或花生中的任意一種或多種。
[0019] 本發(fā)明根據(jù)瞬時轉化的煙草病情指數(shù)的變化，選擇核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5所示的AACP三個DNA區(qū)段，用于Gateway干擾載體的構 建。通過BP反應和LR反應，將上述3個靶標片段連接到Gateway干擾載體pK7GWIWG2 (I)，0 上，形成含有真菌靶標基因的植物轉化載體，轉化至農(nóng)桿菌，用于本氏