°C延伸 IOmin0
[0078] 酶切體系為 50yL :10XQuickCut Buffer 5yL ;Sam I、Xba I各 I yL ;彡 I yg的 質(zhì)粒；加滅菌水至50 μ L。置于37°C，4h后進行凝膠電泳檢測。
[0079] 將本實施例4得到的重組超表達載體pCAMBIA1301-0obZIPl熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，分別隨機挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進行酶切、PCR特異性擴增 及測序鑒定，以確保載體上插入目的基因。重組質(zhì)粒酶切及PCR擴增電泳圖如圖5、6所示， 其中均有目的基因片段大小條帶，表明載體上已插入目的基因，將酶切及PCR鑒定有目的 條帶的克隆送樣測序，分析測序結(jié)果表明目的基因與載體連接正確，OobZIPl沒有發(fā)生移 碼。
[0080] 實施例4 :表汰載體pCAMBIA1301-0obZIPl的介導(dǎo)
[0081] 本實施例提供重組超表述載體pCAMBIA1301-0obZIPl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，并 介導(dǎo)入成熟愈傷組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，本實施例中，所使用的水稻品種為日本 晴。
[0082] 表達載體pCAMBIA1301-0obZIPl在水稻上的表達方法，包括以下步驟：
[0083] 1)農(nóng)桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化
[0084] 在無菌環(huán)境下，挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于2mL YEP (Str+，Chl+)培養(yǎng)液 中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液轉(zhuǎn)移至200mL YEP (Str+，Chl+)培養(yǎng)液中，在28°C， 250rpm條件下暗培養(yǎng)至0D600 = 0. 3。將菌液轉(zhuǎn)入50mL無菌離心管，4°C，5000rpm離心 lOmin，棄上清，用20mL預(yù)冷的ImM HEPES(pH = 7. 0)重懸，重復(fù)3次，棄上清。用2mL預(yù)冷 的10 %甘油重懸，用I. 5mL無菌離心管分裝，每管分裝40 μ L待用，或-70°C保存。
[0085] 取2 μ L表達載體pCAMBIA1301-0obZIPl (質(zhì)粒濃度大于50ng · μ L 3加入到盛有 80 μ L農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)細胞的離心管中，用移液器小心打勻。將混合液移至電擊杯中， 2500伏特高壓下電擊1-2次，加入800 μ L YEP (不含抗生素）液體培養(yǎng)基，混勻后移回原離 心管，28°C，250rpm條件下暗培養(yǎng)7-8h，激進行活。培養(yǎng)檢測得到陽性菌液。
[0086] 2)水稻愈傷組織的培養(yǎng)
[0087] 挑選飽滿無菌斑且胚完好的水稻成熟種子除去谷殼，作為誘導(dǎo)材料；誘導(dǎo)材料消 毒，接種消毒后的種子，用微孔透氣型醫(yī)用膠帶封好培養(yǎng)皿，28°C條件下暗培養(yǎng)約2周后， 挑取自然分裂的淡黃色和、致密球狀的胚性愈傷組織，繼代培養(yǎng)一次；
[0088] 3)挑取轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌單克隆，加入約5mL YEP(Kan+，Chl+)液體培養(yǎng)基， 28°C，250rpm 條件下培養(yǎng) 20-36h 至菌液 OD6。。為 0· 8-L O ;
[0089] 4)挑取繼代培養(yǎng)基中自然分裂的愈傷組織，放入步驟3)的農(nóng)桿菌菌液28°C暗條 件下共培養(yǎng)2-3d ;
[0090] 5)晾干后的愈傷組織置于28°C光照選擇培養(yǎng)2周，進行第一次選擇；后再經(jīng)28°C 光照培養(yǎng)2周，進行第二次選擇，得到抗性愈傷組織；
[0091] 6)抗性愈傷組織的分化、生根，得到轉(zhuǎn)化苗；
[0092] 7)轉(zhuǎn)化苗煉苗7d后移栽至大田，得到轉(zhuǎn)基因植株。
[0093] 檢測實施例
[0094] 1.0 obZIPl的轉(zhuǎn)錄活件鑒宙
[0095] a)以實施例1得到的目的基因重組質(zhì)粒為模板，以帶有Nco I、Sam I酶切位點的 如SEQ ID No. 11所示的上游引物和以如SEQ ID No. 12所示的下游引物，分別擴增，切膠回 收，經(jīng)Nco I、Sam I雙酶切后，純化得到目的片段；
[0096] b)用Nco I、Sam I雙酶切質(zhì)粒pGBKT7并純化，得到酶切質(zhì)粒；
[0097] c)連接目的片段和酶切質(zhì)粒，構(gòu)建成重組載體pGBKT7_0obZIPl ;
[0098] d)將重組載體pGBKT7_0obZIPl轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，培養(yǎng)過夜得到陽性菌液；
[0099] e)從步驟d)的陽性菌液中，提取出重組質(zhì)粒；
[0100] f) PCR反應(yīng)：對步驟e)的重組質(zhì)粒進行雙酶切，
[0101] 其中，PCR 反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 5min ;35 個循環(huán)（94°C，90sec ;58°C，90sec ; 72°C，90sec) ;72°C延伸 IOmin ;
[0102] 酶切體系為 50yL :10XQuickCut Buffer 5yL ;Nco I、Sam I各 I yL ;彡 I yg的 質(zhì)粒；加滅菌水至50 μ L。
[0103] 酶切產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測有目的片段插入的質(zhì)粒送生工生物公司測 序。
[0104] g)利用 Clontech 公司的 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Cat. No. 630439)試劑盒，進行重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)并分別置于SD培養(yǎng)基、SD/-Trp 培養(yǎng)基和SD/-Trp/-Hi s/-Ade培養(yǎng)基，得到菌落；其中，重組質(zhì)粒在SD/-Trp培養(yǎng)基和 SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上的生長情況見圖7中a和b ;
[0105] h)對步驟g)的菌落進行β -半乳糖苷酶濾紙顯色反應(yīng)試驗，觀察顯色情況，見圖 7中c和d。
[0106] pGBKT7轉(zhuǎn)空載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pGBKT7-〇obZIPl轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，經(jīng)30°C 培養(yǎng)3-5d后發(fā)現(xiàn)，如圖7中a所示，轉(zhuǎn)化pGBKT7-〇obZIPl重組質(zhì)粒和pGBKT7空載體的酵 母菌在SD/-Trp的單缺培養(yǎng)基上均能生長，表明pGBKT7載體上的Trp基因已表達，各質(zhì)粒 已成功轉(zhuǎn)入酵母菌中；如圖7中b所示，在三缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-His/-Ade)中，轉(zhuǎn)空載體 酵母菌不能生長，轉(zhuǎn)pGBKT7-〇obZIPl重組質(zhì)粒的酵母菌能正常生長，說明重組質(zhì)粒酵母菌 中PGBKT7載體上的His、Ade基因也被激活。在β-半乳糖苷酶活性濾紙顯色反應(yīng)中，轉(zhuǎn)空 載體酵母菌株不顯色，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的酵母菌株變成藍色，說明重組質(zhì)粒中PGBKT7載體上 的LacZ基因已表達。綜上所述，OobZIPl具有轉(zhuǎn)錄激活。
[0107] 2.轉(zhuǎn)基_棺株鑒宙
[0108] 實施例4中，農(nóng)桿菌侵染水稻成熟胚愈傷組織后，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、預(yù)分化、分 化、生根培養(yǎng)和煉苗后，得到轉(zhuǎn)基因 OobZIPl植株85株，如圖8所示。
[0109] 圖8中a為誘導(dǎo)繼代的愈傷組織；b為選擇培養(yǎng)情況；c為分化情況；d為轉(zhuǎn)基因苗 煉苗情況。
[0110] 待轉(zhuǎn)基因植株長至3-4葉期，剪取少量葉片，提取DNA進行PCR鑒定，其結(jié)果如圖 9所示，在10個植株中，陽性株系占90%，說明OobZIPl的轉(zhuǎn)化成功率高。
[0111] 3.轉(zhuǎn)基閔棺株目的基_表汰量
[0112] 挑選受試日本晴和轉(zhuǎn)基因陽性株系，以反轉(zhuǎn)錄后稀釋10倍的cDNA為模板，以 Actin為內(nèi)參基因，以SEQ ID No. 13為上游引物，以SEQ ID No. 14為下游引物，利用實時熒 光定量PCR檢測轉(zhuǎn)化受體日本晴和轉(zhuǎn)基因苗中目的基因的表達量；其表達量如圖10所示， 左邊為受試日本晴中NIP的表達量，右邊為轉(zhuǎn)基因陽性株系中NIP的表達量，可見，轉(zhuǎn)基因 植株中，OobZIPl表達量有顯著增加，遠遠高于其同源基因在日本晴中的表達。
[0113] 4. 1\轉(zhuǎn)基閔棺株耐鹽件鑒宙
[0114] 利用實施例4得到的轉(zhuǎn)基因植株育種得到轉(zhuǎn)基因種子，挑取正常發(fā)芽且芽長基本 一致的轉(zhuǎn)基因種子，于PCR板中于溫室（26°C，16/8h光暗培養(yǎng)）中培養(yǎng)至三葉一心期后，將 其置于200mM NaCl中培養(yǎng)，3d后觀察其生長情況。
[0115] 如圖11所示，a、b、c分別為植株處理前、處理3d、恢復(fù)3d生長情況；其中每張圖 的左邊為日本晴植株，右邊為轉(zhuǎn)基因植株；可見，日本晴葉子基本全部萎蔫，轉(zhuǎn)基因株系仍 有較大的綠葉率，用水清洗根部后恢復(fù)培養(yǎng)于營養(yǎng)液中，再觀察其恢復(fù)生長情況，日本晴基 本全部萎蔫枯黃，轉(zhuǎn)基因株系中仍有新葉長出；說明相比日本晴，轉(zhuǎn)基因植株具有較強的抗 尚鹽性。
[0116] 5. 1\轉(zhuǎn)基閔棺株抗旱件鑒宙
[0117] 利用實施例4得到的轉(zhuǎn)基因植株育種得到轉(zhuǎn)基因種子，挑取正常發(fā)芽且芽長基本 一致的種子，于PCR板中于溫室（26°C，16/8h光暗培養(yǎng)）中培養(yǎng)至三葉一心期后，將其置于 20% PEG6000中培養(yǎng)，25d后觀察其生長情況。
[0118] 如圖12所示，a、b、c分別為植株處理前，處理25d，恢復(fù)7d生長情況；其中每張 圖的左邊為日本晴植株，右邊為轉(zhuǎn)基因植株；可見，日本晴葉子萎蔫情況嚴重，老葉全部枯 黃，轉(zhuǎn)基因株系大部分老葉枯黃，但仍有部分葉片未萎蔫，恢復(fù)處理7d后，轉(zhuǎn)基因植株有 新葉長出，且長勢良好，對照日本晴僅有少量新葉，且植株矮小，說明，轉(zhuǎn)基因株系對20 % PEG6000模擬干旱處理有較好的抗性且