一種藥用野生稻基因OobZIP1及其表達(dá)載體和構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種藥用野生稻基因 OobZIPl及其表達(dá) 載體和構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國(guó)的第一大糧食作物。非生物脅迫 如干旱等會(huì)嚴(yán)重影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量。
[0003] 在稻屬（Oryza)中，僅有亞洲栽培稻（0· sativa L.)和非洲栽培稻（0· glaberrima Steud) 2個(gè)為栽培種，其余20余種均為野生稻，由于長(zhǎng)期在野生狀態(tài)下生長(zhǎng)，經(jīng)過抵御病蟲 害的侵襲和不良環(huán)境的自然選擇，野生稻蘊(yùn)含了大量的優(yōu)良基因，是一個(gè)天然的基因?qū)殠?(鄂志國(guó)等，遺傳，2008 (11) :1397-1405.，2008)。但因其與栽培稻（AA染色體組）之間存在 嚴(yán)重的生殖障礙，其有利性狀目前未得以高效利用。
[0004] bZIP(Basic Leucin zipper)轉(zhuǎn)錄因子即堿性亮氨酸拉鏈蛋白，它廣泛存在于動(dòng) 物、植物、微生物當(dāng)中，是一類結(jié)構(gòu)較為保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。目前，水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子家 族成員中，有 0〇ABI5(Zou et al.，2008)、0sbZIP23(Xiang et al.，2008)、0sbZIP72(Lu et al·，2009)、0〇ABF1(Hossain et al·，2010)、0oABF2(Hossain et al·，2010)、0sbZIP60(喻 旭等，2011)、0sbZIP46 (Tang et al·，2012)、0sbZIP39 (Takahashi et al·，2012)、 0sbZIP52 (Liu et al·，2012)、0sbZIP58 (Wang et al·，2013)、0sbZIP71 (Liu et al·，2014) 等被成功克隆，且對(duì)干旱、高鹽、高溫、低溫以及其他生物脅迫表現(xiàn)出良好的抗性。因此，針 對(duì)藥用野生稻中bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的研究，以及將有利性狀的基因介導(dǎo)入栽培稻，對(duì) 獲得具有優(yōu)良性狀的栽培稻植株具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種與栽培稻具有較高同源 性、能有效提高抗逆性的藥用野生稻基因 OobZIPl。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種藥用野生稻基因 OobZIPl，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 作為優(yōu)選，上述藥用野生稻基因 OobZIPl，通過以下步驟制得：
[0009] 1)提取藥用野生稻RNA ;
[0010] 2)合成 cDNA 第一鏈；
[0011] 3) PCR擴(kuò)增：以CDNA第一鏈為模板，采用如SEQ ID No. 2所示的上游引物以及如 SEQ ID No.3所示的下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因條帶，電泳切膠回收。
[0012] 作為優(yōu)選，上述藥用野生稻基因 OobZIPl，所述步驟3)中，采用50 μ L反應(yīng)體系： 10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 yL;2mM dNTPs 5 yL;25mM MgS043 yL;上游引物 (10 μ Μ) I. 5 μ L，下游引物（10 μ Μ) I. 5 μ L ;模板 5 μ L ;K0D-Plus-Neo (1U · μ L-l) I μ L ; CldH2O 28 μ L ;其中所述模板為cDNA第一鏈；
[0013] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 2min ;循環(huán)（98°C，10sec ;68°C，lmin)40 次；最后 72°C 延伸 5min。
[0014] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述藥用野生稻基因 OobZIPl的表達(dá)載體的構(gòu)建方 法，包括以下步驟：
[0015] a)PCR擴(kuò)增：以該基因的重組質(zhì)粒為模板，采用如SEQ ID No. 4的上游引物以及如 SEQ ID No. 5所示的下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳切膠回收；
[0016] b)雙酶切：用Sac I和Not I對(duì)步驟a)得到的切膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，切膠回 收后得到酶切基因片段；
[0017] (3)連接：用5&(：1和如〖1對(duì)質(zhì)粒？的32&(+)進(jìn)行雙酶切，切膠回收后，與步驟13) 得到的酶切基因片段進(jìn)行連接，得到重組原核表達(dá)載體pet32a-〇obZIPl。
[0018] 本發(fā)明的目的之三在于提供上述的藥用野生稻基因 OobZIPl的另一表達(dá)載體的 構(gòu)建方法，所述表達(dá)載體為超表達(dá)載體，包括以下步驟：
[0019] a) PCR擴(kuò)增：以該基因的重組質(zhì)粒為模板，以如SEQ ID No. 6所示的上游引物和如 SEQ ID No. 7所示的下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳切膠回收；
[0020] b)雙酶切：用Nco I和Sam I對(duì)步驟b)得到的切膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，切膠回 收后得到酶切基因片段；
[0021] c)連接：用Nco I和Sam I對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1301進(jìn)行雙酶切，切膠回收后，與步驟 b)得到的酶切基因片段進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體pCAMBIA1301-0obZIPl。
[0022] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種氨基酸序列，該氨基酸由上述的藥用野生稻基因 OobZIPl編碼，所述氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示。
[0023] 本發(fā)明的目的之五在于提供上述的藥用野生稻基因 OobZIPl在增強(qiáng)水稻抗逆性 中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明的目的之六在于提供上一種轉(zhuǎn)基因植株的制備方法，由上述表述載體轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并介導(dǎo)入成熟愈傷組織培養(yǎng)得轉(zhuǎn)基因植株。
[0025] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0026] 1.本發(fā)明同時(shí)提供了一種藥用野生稻基因 OobZIPl，是通過藥用野生稻RNA擴(kuò)增 而得；經(jīng)同源性基因比對(duì)，該藥用野生稻基因 OobZIPl具有完整⑶S區(qū)，且上調(diào)基因表達(dá)顯 著，進(jìn)化樹分析表明，它們屬于bZIP家庭的G亞族；
[0027] 2.本發(fā)明提供的藥用野生稻基因 OobZIPl，經(jīng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGBKT7-〇obZIPl的 酵母菌株，在單缺（SD/-Trp)和三缺（SD/-Trp/-His/-Ade)培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)且在 β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)中均顯示藍(lán)色，而轉(zhuǎn)化空載體PGBKT7的酵母菌株只能在單缺 (SD/-Trp)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)中不顯色，說明OobZIPl激活了下游報(bào) 告基因 Trp、His、Ade和LacZ的表達(dá)，具有轉(zhuǎn)錄激活活性；
[0028] 3.采用pCAMBIA1301載體構(gòu)建表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品 種日本晴，并獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，Tl轉(zhuǎn)基因植株中OobZIPl表達(dá)量顯著增高； 該轉(zhuǎn)基因植株在高鹽和20% PEG6000脅迫下均比日本晴長(zhǎng)勢(shì)好，說明OobZIPl提高轉(zhuǎn)基因 植株的抗逆性。
[0029] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0030] 圖1為OobZIPl分別在四葉期和抽穗期藥用野生稻中的表達(dá)模式，其中，其中a為 四葉期，b為抽穗期；
[0031] 圖2為OobZIPl與栽培稻同源基因氨基酸序列比對(duì)情況；
[0032] 圖3為重組原核表達(dá)載體PCR檢測(cè)圖，其中M泳道為marker，1泳道為重組原核表 達(dá)載體 pet_32a-〇obZIPl ;
[0033] 圖4為重組原核表達(dá)載體酶切圖，其中M泳道為marker，1泳道為酶切后重組原核 表達(dá)載體pet-32a_0obZIPl ;2泳道為未酶切重組原核表達(dá)載體pet-32a_0obZIPl ;
[0034] 圖5為重組超表達(dá)載體PCR檢測(cè)圖，其中M泳道為marker，1泳道為陰性對(duì)照，2-14 泳道為重組超表達(dá)載體pCAMBIA1301-0obZIPl的克??；
[0035] 圖6為重組超表達(dá)載體pCAMBIA1301-0obZIPl雙酶切圖，其中M泳道為marker， 1泳道為酶切后重組超表達(dá)載體pCAMBIA1301-0obZIPl ;2泳道為未酶切重組超表達(dá)載體 pCAMBIA1301-0obZIPl ;3 泳道為 OobZIPl 目的基因 CDS ;
[0036] 圖7為轉(zhuǎn)OobZIPl基因酵母菌株生長(zhǎng)情況及β-半乳糖苷酶活性顯色反應(yīng)；其中， a為SD/-Trp培養(yǎng)基，b為SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基，c為β -半乳糖苷酶活性濾紙顯色 反應(yīng)；培養(yǎng)基試驗(yàn)分區(qū)如右下方所示；
[0037] 圖8為轉(zhuǎn)OobZIPl基因組織培養(yǎng)過程圖；其中，a為誘導(dǎo)繼代的愈傷組織；b為選 擇情況；c為分化情況；d為轉(zhuǎn)基因苗煉苗情況；
[0038] 圖9為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定情況，其中，M泳道為marker ; 1-10泳道為轉(zhuǎn)OobZIPl 基因植株鑒定；
[0039] 圖10為OobZIPl在日本晴和轉(zhuǎn)基因苗中的表達(dá)量；其中，NIPl表示轉(zhuǎn)化受體日本 腈中OobZIPl同源基因的表達(dá)量，bl-71表示轉(zhuǎn)OobZIPl基因的轉(zhuǎn)基因苗中目的