A-124-5p實(shí)時定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線；
[002引圖5為具體實(shí)施例1中，microRNA-124-5p實(shí)時定量PCR產(chǎn)物的電泳圖片；
[0029] 圖6為具體實(shí)施例2中，采用本發(fā)明訴述方法與目前廣泛使用的stem-loop PCR方 法的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0031] 參見圖1，為本發(fā)明的方法的原理圖，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案為：
[0032] 1.根據(jù)成熟microRNA序列信息和pre-microRNA序列信息來確定選擇多聚核巧酸 聚合酶：
[0033] a.在pre-microRNA的序列中，位于待測mic;roRNA(5p或化)序列的下游的兩個堿基 為-NA-(N為A，U，C，G中的一個)時，使用多聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly(U)聚合酶）；
[0034] b.在pre-microRNA的序列中，位于待測mic;roRNA(5p或化)序列的下游的兩個堿基 為-NU-(N為A，U，C，G中的一個)時，使用多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(POly (A)聚合酶）；
[003引 C.在pre-microRNA的序列中，位于待測mic;roRNA(5p或化)序列的下游的兩個堿基 為-NS- (N為A，U，C，G中的一個;S為C，G中的一個)時，可使用多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(PO ly (A)聚合酶)或多聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly (U)聚合酶）中的任意一個。
[0036] 2.使用多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶）或多聚尿喀晚核巧酸聚合酶 (poly (U)聚合酶)結(jié)合反轉(zhuǎn)錄酶將microRNA的反轉(zhuǎn)錄為cDNA。多聚核巧酸聚合酶與反轉(zhuǎn)錄 酶同時加至反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為37°C10-15分鐘;42°C，10~15分鐘;85°C5分鐘。其中反轉(zhuǎn) 錄引物為：
[0037] a.如選擇使用多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶），則反轉(zhuǎn)錄引物為：
[0038] 5 '-GGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCATTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3 '。其 中，V為A，C，G中的一個;N為A，T，C，G中的一個。
[0039] b.如選擇使用多聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly(U)聚合酶），反轉(zhuǎn)錄引物為：
[0040] 5 '-GGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAABN-3 '。其 中，B為T，C，G中的一個;N為A，T，C，G中的一個。
[0041 ] 3.實(shí)時定量PCR檢測成熟microRNA的表達(dá)水平。其中實(shí)時定量PCR引物為：
[0042] a.下游引物為通用引物:5 ' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3 '
[0043] b.上游引物檢測為待測成熟microRNA的DNA序列加上末尾兩個堿基。
[0044] 1)如果反轉(zhuǎn)錄過程中使用多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶），則上游引 物的末尾添加兩個堿基-AA。
[004引2)如果反轉(zhuǎn)錄過程中使用多聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly(U)聚合酶），則上游引 物的末尾添加兩個堿基-TT。
[0046] 參見圖l，圖中顯示pre-mic;roRNA序列中，在成熟mic;ro-RNA序列下游為-NA-(N為 A，T，C，G中的一個)或-NU-時，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR的技術(shù)路線。如果下游序列為-NC-或-NG-時，可采用上述任一技術(shù)路線。
[0047] 實(shí)施例1
[004引 比較mi croRNA-124-5p (MIMAT0004591，miRbase數(shù)據(jù)庫）在神經(jīng)元及He la細(xì)胞中的 表達(dá)水平。該檢驗(yàn)的具體實(shí)施步驟如下：
[0049] 反轉(zhuǎn)錄過程:使用購買（如美國Qiagen公司）的microRNA提取試劑盒提取并富集神 經(jīng)元及He la細(xì)胞中的小RNA( smal 1 RNA，其中包括成熟mi croRNA，pre-microRNA，sncRNA 等）。使用購買（如美國Invitrogen公司）的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，與購買（如N邸公司）的多聚腺嚷 嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶)或多聚尿喀晚核巧酸聚合酶(poly(U)聚合酶)混合將小 RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。
[0050] 其中，多聚核巧酸聚合酶及反轉(zhuǎn)錄引物的選擇方式如下：
[0051 ] l、microRNA-124-5p 的前體 pre-microRNA(MI0000443，miRbase 數(shù)據(jù)庫）的序列如 下：
[0052] AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAA UGGGGCUG。
[0053] 其中，下劃線部分為microRNA-124-5p的序列，其下游兩個堿基為UU，根據(jù)具體實(shí) 施方式中的說明，選擇多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶）；
[0054] 2、多聚核巧酸聚合酶為多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶)時，根據(jù)具體 實(shí)施方式中的說明，反轉(zhuǎn)錄引物為：
[00巧]5 '-GGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCATTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3 '。其 中，V為A，C，G中的一個;N為A，T，C，G中的一個。
[0056] 具體反轉(zhuǎn)錄體系如表1所示：
[0057] 表 1
[005引
[0059] 反轉(zhuǎn)錄過程為：37°C15min;42°C15min; 85°C5min。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA保存于-20 。仁。
[0060] 實(shí)時定量PCR過程：
[0061] 使用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板檢測microRNA-124-5p表達(dá)水平。使用購買（如美國 Clontech公司）的實(shí)時定量PCR試劑盒所提供的SybrGreen染料，PCR酶，dNTP及反應(yīng)緩沖液。
[0062] 實(shí)時定量PCR引物選擇如下：
[0063] 1、下游引物為通用下游引物:5'-6了6〔4666了01；4661'-3'；
[0064] 2、上游引物為microRNA-124-5p的DNA序列加上末端兩個堿基：
[006引 a、microRNA-124-5p 的 DNA 序列為 CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT;
[0066] b、反轉(zhuǎn)錄過程中用的聚合酶為多聚腺嚷嶺核巧酸聚合酶(poly(A)聚合酶），根據(jù)
【具體實(shí)施方式】中的說明，引物末端加的堿基為-AA;
[0067] 。、綜合上述，上游引物為5'-〔6了6口^4〔46〔6640：1764了44-3'。
[0068] 具體實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系如表2所示：
[0069] 表 2
[0070]
[0071] ~實(shí)時定量PCR反應(yīng)采用(如美國羅氏公司的)實(shí)時定量PCR儀，反應(yīng)過程為:
[0072] Sl:agel:95°G 3min
[0073] Sl:age2:95°G lOsecond
[0074] 60°C SOsecond 40巧cles。
[007引結(jié)果分析：
[0076] 擴(kuò)增曲線結(jié)果如圖2所示，從圖中可W顯示mi croRNA-124-5p在神經(jīng)元(a)，he la細(xì) 胞(d)的擴(kuò)增效果；內(nèi)參3抓6-1(10:26827,661166曰證數(shù)據(jù)庫）在神經(jīng)元化），化1曰細(xì)胞((3)的 擴(kuò)增效果。其中microRNA-124-5p的擴(kuò)增曲線在不同復(fù)孔中重復(fù)性較好，并且在高表達(dá)細(xì)胞 和低表達(dá)細(xì)胞中擴(kuò)增曲線形態(tài)相似。說明本發(fā)明所用的microRNA特異引物可W在表達(dá)豐度 較高和較低的體系內(nèi)穩(wěn)定的擴(kuò)增目的序列。
[0077]根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算Ct值及microRNA-124-5p在不同細(xì)胞中的相對表達(dá)量，結(jié)果顯 示如圖3所示。該結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道的microRNA-124在神經(jīng)元內(nèi)高表達(dá)，在其他組織細(xì)胞 內(nèi)低表達(dá)的結(jié)論是相符的。
[007引根據(jù)microRNA-124-5p在神經(jīng)元(a)，hela細(xì)胞(d)擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，如圖4所 示，分析可W看出，mic;roRNA-124-5p引物對microRNA表達(dá)量高或表達(dá)量低的樣品的擴(kuò)增特 異性都很好。
[0079] 如圖5所示，通過核酸電泳，進(jìn)一步分析擴(kuò)增特異性。由本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物針對 microRNA-124