專利名稱：找出成對的同位素組的制作方法
找出成對的同位素組 背景 同位素標(biāo)記是在各種分子或原子水平用同位素來觀察生物樣品的兩種技術(shù)中的 一種。 一種技術(shù)使用放射性同位素。另一種技術(shù)涉及豐度較低的非放射性或穩(wěn)定的同位素。 觀察可通過使用諸如質(zhì)譜儀等設(shè)備來測量穩(wěn)定的同位素的相對豐度來進(jìn)行，質(zhì)譜儀是確定 在正在分析的生物樣品中的各種穩(wěn)定的同位素的相對量的設(shè)備。
概述 提供本概述是為了以簡化的形式介紹將在以下詳細(xì)描述中進(jìn)一步描述的一些概 念。本概述并不旨在標(biāo)識所要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征，也不旨在用于幫助確定所要求保 護(hù)的主題的范圍。 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種方法、一種計算機(jī)可讀介質(zhì)和一種系統(tǒng)。本發(fā)明的一種方 法形式包括一種用于找出生物樣品中的成對特征的方法。該方法包括從實(shí)驗(yàn)中形成合成圖 像，在該實(shí)驗(yàn)中將對照樣品和與該對照樣品具有跟蹤關(guān)系的處理樣品放在一起作為制備樣 品，而不必標(biāo)識特征的核酸序列。該方法還包括從合成圖像中找出感興趣的特征對，一對感 興趣的特征中的一個成員根據(jù)跟蹤關(guān)系來與該對中的另一成員相關(guān)聯(lián)，該跟蹤關(guān)系描述用 于找出合成圖像上的對中的兩個成員的約束。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的計算機(jī)可讀介質(zhì)形式包括一種其上存儲有計算 機(jī)可執(zhí)行指令的計算機(jī)可讀介質(zhì)，該指令用于實(shí)現(xiàn)一種用于找出生物樣品中的成對特征的 方法。該方法包括從實(shí)驗(yàn)中形成合成圖像，在該實(shí)驗(yàn)中，將對照樣品和與該對照樣品具有跟 蹤關(guān)系的處理樣品放在一起作為制備樣品，而不必標(biāo)識特征的核酸序列。該方法還包括從 合成圖像中找出感興趣的特征對，一對感興趣的特征中的一個成員根據(jù)跟蹤關(guān)系來與該對 中的另一成員相關(guān)聯(lián)，該跟蹤關(guān)系描述用于在合成圖像上找出該對中的兩個成員的約束。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的系統(tǒng)形式包括一種用于找出感興趣的成對特征 的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括色譜和質(zhì)譜儀的集合，其用于接收一起提交對照樣品和處理樣品以供 處理的制備樣品。該系統(tǒng)還包括圖像處理流水線，其用于在制備樣品上提取特征并計算特 性創(chuàng)建來自制備樣品的合成圖像并處理該合成圖像。該系統(tǒng)還包括成對特征處理器，其用 于處理來自合成圖像的特征以找出根據(jù)一定關(guān)系彼此相關(guān)聯(lián)的感興趣的特征對，而不必首 先標(biāo)識特征的核酸序列。
附圖描述 當(dāng)結(jié)合附圖參考以下詳細(xì)描述時，可以更容易領(lǐng)會并更好地理解本發(fā)明的上述方 面和許多附加的優(yōu)點(diǎn)，附圖中

圖1是示出用于找出具有定義其配對的關(guān)系的生物樣品的成對特征的示例性系 統(tǒng)的框圖； 圖2是示出用于找出具有定義其配對的關(guān)系的生物樣品的成對特征的示例性成 對特征處理器的框圖； 圖3是示出由標(biāo)簽分隔的同位素組的示例性圖的圖示，x軸表示保留時間而y軸 表示電荷質(zhì)量；
4
圖4A-4C是示出根據(jù)本發(fā)明的各實(shí)施例的、示出與同位素標(biāo)記相關(guān)的偏差及其消 除或減少的示例性圖的圖示；以及 圖5A-5K是示出用于根據(jù)關(guān)系來找出生物樣品中的感興趣的成對特征的示例性
方法的過程圖。 詳細(xì)描述 如將闡明的，本發(fā)明的各實(shí)施例認(rèn)識到標(biāo)識特征的問題，諸如在發(fā)現(xiàn)由于實(shí)驗(yàn)或 生物關(guān)系而相關(guān)聯(lián)的特征對之前確定確切的蛋白質(zhì)序列。同樣，本發(fā)明的各實(shí)施例使用從 作為制備樣品提交給液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)儀的多個樣品或者從多個副本中形成的合成 圖像來更好地減少噪聲并更好地檢測具有弱表達(dá)的特征。此外，本發(fā)明的各實(shí)施例允許反 向同位素標(biāo)記以限制或減少與同位素標(biāo)記過程相關(guān)的偏差。 圖1中示出系統(tǒng)100，該系統(tǒng)從生物樣品中發(fā)現(xiàn)感興趣的成對特征。 一般而言，實(shí) 驗(yàn)可歸結(jié)為兩樣?xùn)|西之間的比較對照樣品和處理樣品；未患病樣品和患病樣品；健康樣 品和患病樣品；等等。在蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家期望知道蛋白質(zhì)對于引入條件是否具有不 同作用。在代謝實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家期望知道代謝物對于引入條件是否具有不同作用。存在能 夠適當(dāng)?shù)乩帽景l(fā)明的各實(shí)施例來更好地理解藥物療法、治療結(jié)果和毒性風(fēng)險的許多其他 類型的實(shí)驗(yàn)。 本發(fā)明的各實(shí)施例允許在不必首先標(biāo)識特征的情況下找出生物樣品中的成對特 征。在配對后，各實(shí)施例允許差異地或非差異地表達(dá)的特征繼續(xù)至靶向標(biāo)識。即使先前未 標(biāo)識現(xiàn)在已配對的那些特征可被發(fā)送到串聯(lián)質(zhì)譜儀或其他類型的設(shè)備以便標(biāo)識肽(或蛋 白質(zhì))序列或代謝物。在肽、蛋白質(zhì)或代謝物標(biāo)識(或其他生物標(biāo)識)之后，這些特征可由 肽序列、蛋白質(zhì)序列或代謝物信息(或其他生物信息)來注釋。 返回到圖1，留出對照樣品102A。處理樣品1 104A是已經(jīng)歷處理條件的對照樣品 的實(shí)例。此外，添加到處理樣品l 104A或在其中識別的是允許跟蹤其與對照樣品102A的 關(guān)系的痕跡。 一個合適的痕跡是使用諸如SILAC或ICAT等合適的同位素標(biāo)記技術(shù)來添加 標(biāo)簽。使用諸如六道爾頓等所選原子質(zhì)量單位數(shù)來標(biāo)記處理樣品1 104A。該所選數(shù)量或標(biāo) 簽稍后將在系統(tǒng)100中用于跟蹤對照樣品102A和處理樣品1 104A在其被表示為在合成圖 像上找到的特征對時的關(guān)系。成對特征中的一個成員可能源自對照樣品102A而成對特征 中的另一成員可能源自處理樣品1 104A。如圖1所示，用于標(biāo)記處理樣品1 104A的標(biāo)簽具 有名稱"標(biāo)記A"。 對照樣品102A和處理樣品1 104A(標(biāo)記A)可作為制備樣品106來制備以便作為 單個試樣提交給系統(tǒng)100。通過允許對照樣品102A和處理樣品1 104A(標(biāo)記A)兩者作為 一個制備樣品106進(jìn)入系統(tǒng)IOO，本發(fā)明的各實(shí)施例限制或減少可能將假值注入實(shí)驗(yàn)的設(shè) 備相關(guān)變異。在限制或減少設(shè)備相關(guān)變異的情況下，所找到的特征可歸因于對照樣品102A 和處理樣品104A(標(biāo)記A)。例如，如果在處理樣品1 104A(標(biāo)記A)的表達(dá)水平與對照樣品 102A相比存在差異，則該差異可歸因于處理條件而不一定是設(shè)備相關(guān)變異。
諸如SILAC等多種同位素標(biāo)記技術(shù)添加將假值注入到實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)簽相關(guān)偏差。本
發(fā)明的各實(shí)施例通過支持反向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)協(xié)議來限制或減少標(biāo)簽相關(guān)偏差。例如，對照樣品 102A可由諸如六道爾頓等先前用于標(biāo)記處理樣品1 104A的所選原子質(zhì)量單位數(shù)來標(biāo)記 (標(biāo)記A)。另一方面，不標(biāo)記處理樣品1 104A。已標(biāo)記的對照樣品現(xiàn)在被稱為對照樣品102B，而未標(biāo)記的處理樣品現(xiàn)在被稱為處理樣品1 104B。對照樣品102B(標(biāo)記A)和處理樣 品1 104B可以與對照樣品102A和處理樣品1 104A(標(biāo)記A) —起作為制備樣品106來制 備以便作為單個試樣提交給系統(tǒng)IOO。通過允許對照樣品102A、102B(標(biāo)記A)和處理樣品 1 104A(標(biāo)記A) 、104B兩者作為一個制備樣品106進(jìn)入系統(tǒng)100，執(zhí)行反向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)協(xié)議并 且限制或減少標(biāo)簽偏差。 系統(tǒng)100還可容納可以與對照樣品102A、102B(標(biāo)記A)和處理樣品1104A(標(biāo)記 A)、104B—起收集以便作為一個制備樣品106進(jìn)入系統(tǒng)100的附加實(shí)驗(yàn)。例如，在使用相 同對照樣品的另一實(shí)驗(yàn)中，提供對照樣品102C，其與對照樣品102A相同。處理樣品2 104C 是其中對照樣品102C的實(shí)例已經(jīng)歷與處理樣品1 104A(標(biāo)記A)已經(jīng)受的處理條件不同的 另一處理條件的樣品。處理樣品2 104C使用類似的同位素標(biāo)記技術(shù)來標(biāo)記，但使用不同數(shù) 量的原子質(zhì)量單位，諸如12道爾頓(標(biāo)記B)。 為了限制或減少標(biāo)簽相關(guān)偏差，對照樣品102C和處理樣品104C (標(biāo)記B)也可服 從反向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)協(xié)議。例如，對照樣品102C可由諸如12道爾頓等先前用于標(biāo)記處理樣品 1 104C的所選原子質(zhì)量單位數(shù)來標(biāo)記(標(biāo)記B)。另一方面，不標(biāo)記處理樣品1 104C。已 標(biāo)記的對照樣品現(xiàn)在被稱為對照樣品102D，而未標(biāo)記的處理樣品現(xiàn)在被稱為處理樣品1 104D。對照樣品102D(標(biāo)記B)和處理樣品1 104D可以與對照樣品102A-102C和處理樣品 1 104A-102C—起作為制備樣品106來制備以便作為單個試樣提交給系統(tǒng)100。通過允許 對照樣品102A-102D和處理樣品1 104A-102D兩者作為一個制備樣品106進(jìn)入系統(tǒng)100，執(zhí) 行反向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)協(xié)議并且限制或減少標(biāo)簽偏差。 制備樣品106被提交給LC/MS儀108110。 LC/MS儀108110能夠?qū)⒅T如肽等生物 特征分成兩個維度(保留時間和質(zhì)量/電荷)。對于給定保留時間，可在感興趣的質(zhì)量/電 荷范圍內(nèi)獲取一維連續(xù)譜。生物特征被示為連續(xù)譜中的同位素峰。假設(shè)峰強(qiáng)度與同感興趣 的生物特征相關(guān)聯(lián)的非放射性、穩(wěn)定的同位素的相對豐度成比例。最終，按順序收集的一維 質(zhì)譜儀連續(xù)譜形成二維數(shù)據(jù)集，且保留時間被稱為x軸而質(zhì)量/電荷被稱為y軸。
圖像處理流水線112根據(jù)從LC/MS儀108110獲取的二維數(shù)據(jù)集來產(chǎn)生包括特征 特性和表達(dá)概況的特征列表。圖像處理流水線112便于特征提取以使得對通過某些關(guān)系與 其他特征相關(guān)聯(lián)的特征進(jìn)行配對以便進(jìn)行進(jìn)一步的科學(xué)研究。圖像處理流水線112中的一 些組件(未示出)包括圖像產(chǎn)生器，其執(zhí)行圖像預(yù)處理(數(shù)據(jù)內(nèi)插、圖像對齊、圖像噪聲過 濾、背景校正以及合成圖像的形成)；以及合成圖像處理器，其執(zhí)行圖像特征提取(峰、同位 素組和電荷組)和計算特征特性。圖像處理流水線112的輸出包括特征列表及其特性。
特征列表及其特性被提供給成對特征處理器118。使用同位素標(biāo)記，成對特征處理 器118找出特征對中的一個成員是否通過原子質(zhì)量單位數(shù)來與該特征對中的另一成員相 關(guān)。(當(dāng)然，如果使用其他類型的關(guān)系，則可以不用原子質(zhì)量單位數(shù)，而通過其他指示符找出 該相關(guān)。)換言之，對于給定保留時間，應(yīng)發(fā)現(xiàn)特征對主要由原子質(zhì)量單位數(shù)而不一定由時 間來分隔。給定合成圖像的y軸參考質(zhì)量/電荷，對于給定保留時間可垂直地沿著y軸找 到特征對。例如，如果給定同位素峰表示諸如對照樣品102A等對照樣品的表達(dá)，則會期望 找出另一同位素峰，其表示由諸如六道爾頓等原子質(zhì)量單位數(shù)分隔的處理樣品1 104A(標(biāo) 記A)的表達(dá)。最終，成對特征處理器118收集特征對，執(zhí)行特性計算，諸如確定強(qiáng)度比等， 以供進(jìn)一步的差異或非差異分析。例如，特征對及其特性可幫助闡明對于不同處理條件102A-102D、104A-104D的不同實(shí)驗(yàn)是否發(fā)生不同藥物劑量下的蛋白質(zhì)表達(dá)。
圖2示出圖像處理流水線112包括合成圖像產(chǎn)生器202。合成圖像產(chǎn)生器202產(chǎn)生合成圖像204。本領(lǐng)域未能認(rèn)識到將圖像合并成合成圖像可減少噪聲并保留弱表達(dá)但可能具有生物學(xué)重要意義的特征。如上所述，在該合成圖像上的是感興趣的區(qū)域，其可表示其中某一些是反向標(biāo)記(標(biāo)記A、B)的來自對照樣品102A-102D的特征、以及其中某一些是已標(biāo)記(標(biāo)記A、B)的來自處理樣品1、2 104A-104D的特征。合成圖像處理器206產(chǎn)生合成圖像204以找出特征列表，諸如同位素峰、同位素組和電荷組。合成圖像處理器206也計算這些特征的特性和概況。 過去，本領(lǐng)域試圖通過在找出成對特征之前確定特征序列來標(biāo)識所有特征。本領(lǐng)
域未能認(rèn)識到標(biāo)識特征的步驟無需在找出感興趣的成對特征之前進(jìn)行。有時不可能標(biāo)識具
有低表達(dá)水平或者處理條件限制其表達(dá)的那些特征。另外，可能存在數(shù)千個特征，且標(biāo)識所
有這些特征是效率低下的。對于不是對的成員并因此可能不具有生物學(xué)意義關(guān)系的那些特
征，無需標(biāo)識它們。在配對之前標(biāo)識所有特征的嘗試可能減緩科學(xué)發(fā)現(xiàn)。 成對特征處理器118在圖2中更詳細(xì)地示出。成對特征處理器118包括特征排序
器208，其獲得由合成圖像產(chǎn)生器206產(chǎn)生的特征列表并對該特征列表進(jìn)行排序。該排序按
序放置特征以使得具有最強(qiáng)信號特性的特征優(yōu)先進(jìn)行處理。例如，排序可以按降序，其中應(yīng)
首先列出具有最大峰強(qiáng)度和/或最大質(zhì)量/電荷的特征以使得能夠首先處理這些特征。以
此方式，本發(fā)明的各實(shí)施例將初始資源集中于很有可能指向感興趣的特征對的那些特征并
避免可能導(dǎo)致分析錯誤的噪聲特征。 成對特征檢測器210接收經(jīng)排序的特征列表并找出感興趣的成對特征。如上所述，每一對都可包括源自對照樣品102A-102D的特征以及源自處理樣品104A-104D的另一特征。在找到感興趣的特征對后，對于諸如蛋白質(zhì)序列等缺少標(biāo)識信息的特征，可進(jìn)行靶向標(biāo)識。串聯(lián)質(zhì)譜儀或其他標(biāo)識儀器可被設(shè)置成觸發(fā)特定特征以導(dǎo)致分解以便獲取這些特征的核酸序列或氨基酸序列。同樣，如上所述，出于生物原因，有時在生物學(xué)上是重要的特征無法通過系統(tǒng)100在一試驗(yàn)中出現(xiàn)。使用合成圖像來將所有試驗(yàn)合并在一起以使得即使特征無法出現(xiàn)在正向標(biāo)記的試驗(yàn)中但成功出現(xiàn)在反向標(biāo)記的試驗(yàn)中，這些特征也可出現(xiàn)在合成圖像中以使得能夠找出通過某些關(guān)系相關(guān)聯(lián)的感興趣的特征對。只要捕捉到生物學(xué)上重要的特征以供后續(xù)分析，其中出現(xiàn)的特征的本發(fā)明的各實(shí)施例就無關(guān)緊要。
特征排序器208向成對特征檢測器210提供列表中的最強(qiáng)特征到最弱特征。成對特征檢測器210以最強(qiáng)特征開始并解析整個特征列表以確定由于諸如原子質(zhì)量單位數(shù)等關(guān)系(通過權(quán)重的關(guān)系)而供配對的候選的對應(yīng)特征。例如，如果原子質(zhì)量單位數(shù)是六道爾頓，則對于給定保留時間供配對的候選特征應(yīng)離開最強(qiáng)特征大約六道爾頓出現(xiàn)，這在用戶可定義的容差范圍內(nèi)，保留時間也在另一用戶可定義容差范圍內(nèi)。在一個實(shí)施例中，保留時間容差默認(rèn)是十秒。用戶可調(diào)整保留時間容差以及質(zhì)量/電荷容差以適應(yīng)設(shè)備變異。
在找出感興趣的特征對后，成對特征檢測器210將該對從排序特征列表中移除。成對特征檢測器210然后聚焦于經(jīng)排序的特征列表中的下一最強(qiáng)特征并試圖找出對應(yīng)于該最強(qiáng)特征的另一特征以便將其配對。成對特征檢測器210可找出作為供與最強(qiáng)特征配對的候選的多個特征。當(dāng)發(fā)生這種情況時，成對特征檢測器210從所有其他候選特征中選擇具有最大質(zhì)量以及相對于排序特征列表中的最強(qiáng)特征具有最接近的保留時間的候選特征。為了限制成對特征檢測器210可利用的用于找出候選特征的計算資源，保留時間容差限定 成對特征檢測器210可冒險找出候選特征的程度。類似地，質(zhì)量/電荷容差用于限定成對 特征檢測器210可找出候選特征的程度。在一個實(shí)施例中，質(zhì)量/電荷方向上的默認(rèn)容差 是0. 1份/百萬份，并且取決于設(shè)備及其操作模式。 —種由特征排序器208接收的特征類型是同位素組?？赡艽嬖诙鄠€同位素組。一 個同位素組可具有多個同位素峰，而另一同位素組可具有不同數(shù)量的同位素峰。可能存在 大量同位素組。成對特征檢測器210通過默認(rèn)為4的用戶可選閾值來限制對感興趣的特征 對的搜索。換言之，在查看可作為配對候選的同位素峰的第四個同位素組后，成對特征檢測 器210將不會為找出其他候選而冒險查看其他同位素組。 成對特征檢測器210確定兩個同位素組之間的共同數(shù)量的同位素峰，聚焦于該共 同數(shù)量并且不考慮不作為該共同數(shù)量的同位素峰的一部分的額外的同位素峰。例如，第一 同位素組具有從具有最低質(zhì)量/電荷的同位素峰開始的三個同位素峰；成對特征檢測器 210可能已在第二同位素組中找到成對特征，但該第二同位素組具有五個同位素峰。在一個 實(shí)施例中，為了創(chuàng)建共同數(shù)量的同位素峰，成對特征檢測器210可選擇第一同位素組中的 三個最低質(zhì)量/電荷同位素峰以及第二同位素組中的三個最低質(zhì)量/電荷同位素峰，而不 考慮第二同位素組中的最高質(zhì)量/電荷同位素峰。在另一實(shí)施例中，共同數(shù)量的同位素峰 可選自具有最大強(qiáng)度的同位素峰。例如，成對特征檢測器210可選擇使用第一和第二同位 素組兩者中的具有最大強(qiáng)度的三個同位素峰。 由成對特征檢測器210找到的感興趣的成對特征被轉(zhuǎn)發(fā)給成對特征特性處理器 212。 一種經(jīng)處理的特性包括強(qiáng)度比。成對特征特性處理器212獲得作為表示處理樣品的一 對的成員的一個同位素組中的同位素峰的強(qiáng)度并將強(qiáng)度合計為被除數(shù)。成對特征特性處理 器212然后獲得作為表示對照樣品的一對的成員的另一同位素組中的同位素峰的強(qiáng)度并 將強(qiáng)度合計為除數(shù)。根據(jù)被除數(shù)和除數(shù)來創(chuàng)建比率。成對特征特性處理器212創(chuàng)建比率集 合。根據(jù)這些比率，成對特征特性處理器212生成剖析參數(shù)以使得能夠搜索表達(dá)信息。一 種剖析參數(shù)是對比率取常用對數(shù)，之后計算該常用對數(shù)的誤差以獲取每一對特征的P值。
p值用于差異檢測。用戶可使用成對特征特性搜索器214來設(shè)置差異閾值。成對 特征特性搜索器214收集p值小于差異閾值的對并向用戶呈現(xiàn)這些對以供進(jìn)一步分析。例 如，在更接近地查看由成對特征特性搜索器214找到的特征對時，用戶可確定該對中可能 缺少標(biāo)識信息的一成員。該用戶可以在串聯(lián)質(zhì)譜分析過程中在特定保留時間設(shè)置觸發(fā)機(jī) 制以使得儀器靶向該對中的成員以確定其核酸或氨基酸序列。這避免了標(biāo)識所有特征的需 求，并且相反具有實(shí)驗(yàn)或生物關(guān)系的特征作為焦點(diǎn)被帶到面前以供進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。
此外，成對特征特性處理器212可執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化。如果強(qiáng)度比小于標(biāo)準(zhǔn)化水平，則該 比率可能無法增加了解并且可消除該比率。 一種標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)包括合計對照樣品的所有同位 素峰并除以同位素峰數(shù)以獲得該對照樣品的均值。類似地，處理樣品的均值通過合計處理 樣品的所有同位素峰并除以同位素峰數(shù)來獲得。如果對照樣品和處理樣品的均值不相似， 則執(zhí)行縮放過程以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化水平以除去不顯著的比率。 圖300可視地解釋了包括表示共同樣品和處理樣品的感興趣的特征的合成圖像。 參見圖3。圖300包括表示時間維度的y軸和表示保留時間維度的x軸。在特定保留時間， 出現(xiàn)三個同位素組特征。這三個同位素組中的一個包括對照同位素組304，其表示對照樣品。對照同位素組304包括四個同位素峰302。這四個同位素峰302可以是將對照樣品與 處理樣品相關(guān)的對中的成員。 這三個組中的另一個包括處理同位素組A 310，其具有三個同位素峰308。處理同 位素組A 310沿著與對照同位素組304相似的保留時間出現(xiàn)，并因此三個同位素峰308可 以是供與對照同位素組304的同位素峰302配對的候選。處理同位素組A 310可表示已經(jīng) 由原子質(zhì)量單位數(shù)標(biāo)記的處理樣品，其通過諸如六道爾頓等在同位素標(biāo)記時使用的原子質(zhì) 量單位量來將處理同位素組A 310與對照同位素組304分開。共同數(shù)量的同位素峰可由成 對特征處理器118在給定同位素峰302和308的數(shù)量之間的差異的情況下建立。例如，在同 位素峰308中存在三個同位素峰，而在同位素峰302中存在四個同位素峰。在這種情況下， 給定處理同位素組A 310具有三個同位素峰308，共同數(shù)量的同位素峰可被指定為三個。
如果另一實(shí)驗(yàn)是提交給LC/MS儀108110的相同的制備樣品的一部分，則另一處理 樣品的表示可出現(xiàn)在圖300上，諸如處理同位素組B 316，其具有五個同位素峰314。如果 使用相同的共同樣品，則處理同位素組B 316的五個同位素峰314中的某一些可以與對照 同位素組304的同位素峰302配對。確定同位素峰的共同數(shù)量，在這種情況下是四。如果 用于建立共同同位素峰的方案基于同位素組304、310和316中的最低同位素峰，則線306 具有三個計時單元(tick)。線306的底部計時單元指示最低同位素峰302可以與中間計時 單元所引用的最低同位素峰308配對，并且此外，最低同位素峰302可以與線306的頂部計 時單元所引用的最低同位素峰配對。其余線312、318和320示出其他配對。
圖300示出本發(fā)明的各實(shí)施例的焦點(diǎn)在于找出根據(jù)某一關(guān)系彼此相關(guān)的特征對。 圖300示出同位素組在類似的保留時間出現(xiàn)并且這些同位素組由可定義關(guān)系的特定質(zhì)量/ 電荷分隔。這些關(guān)系定義成對特征處理器118可用于找出感興趣的特征對的約束。在以上 示例中的某一些中，向處理樣品添加同位素標(biāo)簽。在其他示例(未示出)中，成對特征處理 器118可找出基于其他約束的關(guān)系，諸如特定分子的存在等，而不是使用同位素標(biāo)簽。在還 有一些其他示例(未示出)中，成對特征處理器118可找出基于代謝物的關(guān)系，諸如存在獲 得的原子或原子的丟失等。 某些實(shí)驗(yàn)引入不合乎需要的偏差。例如，在將同位素標(biāo)簽附加到處理樣品時，可能 引入偏差。某些肽顯示一致的標(biāo)簽依賴性比率偏差。這些偏差可出現(xiàn)在上調(diào)、下調(diào)或兩者 中。所得處理樣品的表達(dá)還可包含相同的偏差。本領(lǐng)域未能認(rèn)識到應(yīng)消除該偏差以增強(qiáng)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果。如圖4A-4C所示的圖402-406示出在實(shí)現(xiàn)反向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)協(xié)議后移除偏差。在所有 圖402-406中，y軸表示比率的自然對數(shù)而x軸表示成對特征的經(jīng)縮放的強(qiáng)度的自然對數(shù)。 圖402(其顯示正向標(biāo)記的特征)和圖404(其顯示反向標(biāo)記的特征)示出遠(yuǎn)離群集的偏差。 在執(zhí)行反向標(biāo)記實(shí)驗(yàn)協(xié)議后，這些偏差消失，如圖406所示。 圖5A-5K示出了用于找出生物樣品中的感興趣的成對特征的方法5000。從開始 框，方法5000繼續(xù)至一組方法步驟5002，其在延續(xù)終端("終端A")和退出終端("終端 B")之間定義。該組方法步驟5002描述產(chǎn)生制備樣品及其用于產(chǎn)生合成圖像以便于特征 提取和對特征特性的計算的處理。 從終端A(圖5B)，方法5000繼續(xù)至框5008，在那里為實(shí)驗(yàn)留出對照樣品。由不同 的表型(phenotypical)或處理條件的實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建處理樣品。參見框5010。使用包括諸如六 道爾頓等特定數(shù)量的原子質(zhì)量單位的非放射性、穩(wěn)定的同位素來標(biāo)記處理樣品以包含同位
9素示蹤劑。參見框5012。該方法然后繼續(xù)至判定框5014，在那里執(zhí)行測試以確定實(shí)驗(yàn)協(xié)議是否需要反向標(biāo)記。如果對判定框5014處的測試的回答是是，則方法5000繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端A1")。如果對判定框處的測試的回答是否，則方法5000繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端A2")。 從終端Al(圖5C)，用包括與用于標(biāo)記處理樣品相同的數(shù)量的原子質(zhì)量單位的同位素示蹤劑來標(biāo)記對照樣品的實(shí)例。參見框5016。留出處理樣品的實(shí)例而不用同位素示蹤劑來標(biāo)記。參見框5018。接著，在判定框5020，執(zhí)行測試以確定是否存在不同表型或處理條件的另一實(shí)驗(yàn)。如果對判定框5020處的測試的回答是否，則該方法繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端A3")。如果對判定框5020處的測試的回答是是，則該方法繼續(xù)至框5022，在那里將新的同位素示蹤劑選為使用包括諸如12道爾頓等另一數(shù)量的原子質(zhì)量單位的非放射性、穩(wěn)定的同位素的標(biāo)記(另一標(biāo)記)。對于新實(shí)驗(yàn)使用新同位素示蹤劑來重復(fù)步驟5008-5018。參見框5024。該方法然后繼續(xù)至終端A2。 從終端A3(圖5D)，方法5000繼續(xù)至框5026，在那里將來自一個或多個實(shí)驗(yàn)的、已標(biāo)記或未標(biāo)記的制備、對照和處理樣品收集在一起作為制備樣品以供提交給LC/MS儀。產(chǎn)生合成圖像，其包含三維質(zhì)譜光譜y軸中的質(zhì)量/電荷、x軸中的保留時間和z軸中的同位素峰值。該方法然后繼續(xù)至退出終端B。 從終端B (圖5A)，方法5000繼續(xù)至一組方法步驟5004，其在延續(xù)終端("終端C")和退出終端("終端D")之間定義。該組方法步驟5004找出諸如成對同位素峰或其他對等通過特定關(guān)系相關(guān)聯(lián)的成對特征。 從終端C (圖5E)，方法5000繼續(xù)至框5032，在那里根據(jù)同位素峰的強(qiáng)度來對特征進(jìn)行降序排序。按照同位素峰的質(zhì)量來對按強(qiáng)度排序的特征進(jìn)行進(jìn)一步的降序排序。參見框5034。方法5000然后選擇經(jīng)排序的列表中的作為具有最強(qiáng)強(qiáng)度的排名最高的同位素峰的第一同位素峰。參見框5038。該方法確定該第一同位素峰所屬的同位素組(第一同位素組)。參見框5040。該方法繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端C3")。該方法搜索經(jīng)排序的列表
以便在第二同位素組中找出在保留時間和質(zhì)量/電荷容差范圍內(nèi)的已標(biāo)記的同位素峰。參見框5042。該方法將通過諸如六道爾頓等原子質(zhì)量單位數(shù)來與第一同位素峰隔開的所找到的同位素峰標(biāo)記為可能的候選或成對同位素組的成員。參見框5044。該方法繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端C1")。 從終端Cl (圖5F)，方法5000繼續(xù)至判定框5046，在那里執(zhí)行測試以確定在第二同位素組中是否存在其他已標(biāo)記的同位素峰。如果對判定框5046處的測試的回答是否，則方法5000繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端C4")。如果對判定框5046處的測試的回答是是，則方法5000繼續(xù)至另一判定框，在那里執(zhí)行另一測試以確定其他已標(biāo)記的同位素峰是否在保留時間和質(zhì)量/電荷容差范圍內(nèi)。如果對判定框5048處的測試的回答是否，則該方法繼續(xù)至終端C4。如果對判定框5048處的測試的回答是是，則該方法繼續(xù)至終端C3。
從終端C4 (圖5G)，方法5000繼續(xù)至框5050，在那里方法5000從所有候選或可能的成員中選擇在保留時間方面最接近第一同位素峰并且間隔與原子質(zhì)量單位數(shù)(標(biāo)記)最接近的成員。所選成員成為成對同位素組的成員而另一成員是第一同位素峰。參見框5052。從經(jīng)排序的列表中移除所選成員，該所選成員是第二同位素組中的同位素峰并且對應(yīng)于第一同位素組中的第一同位素峰。參見框5054。在判定框5056處執(zhí)行測試以確定是否已達(dá)到對搜索其他同位素組的限制。如果對判別框5056處的測試的回答是是，則方法5000繼 續(xù)至另一延續(xù)終端("終端C5")。如果對判別框5056處的測試的回答是否，則方法5000 繼續(xù)至框5058，在那里該方法使用另一原子質(zhì)量單位數(shù)來搜索可能包含成對同位素峰的另 一同位素組。該方法然后繼續(xù)至終端C3，并且跳回到框5042，在那里重復(fù)以上處理步驟。
從終端C5(圖5H)，方法5000繼續(xù)至框5060，在那里從經(jīng)排序的列表中移除來自 第一同位素組的第一同位素峰。在判定框5062處執(zhí)行測試以確定是否已達(dá)到對進(jìn)一步搜 索成對同位素峰的限制。如果對判定框5062處的測試的回答是是，則該方法繼續(xù)至終端D。 如果對判定框5062處的測試的回答是否，則該方法繼續(xù)至框5064，在那里方法5000在經(jīng)排 序的列表中選擇作為具有最強(qiáng)強(qiáng)度的排名最高的同位素峰的另一同位素峰。該方法然后繼 續(xù)至終端C3，并且跳回到框5042，在那里重復(fù)以上處理步驟。 從退出終端D (圖5A)，方法5000繼續(xù)至一組方法步驟5006，其在延續(xù)終端("終 端E")和退出終端("終端F")之間定義。該組方法步驟描述計算成對特征特性以使得能 夠執(zhí)行搜索以便找出感興趣的成對特征。 從終端E (圖51)，方法5000繼續(xù)至框5066，在那里該方法已找到一組成對同位素 組，每一同位素組都包含來自對照樣品的同位素峰和來自處理樣品的另一同位素峰。計算 屬于一個同位素組的對的所有成員的強(qiáng)度之和。例如，如果存在三對，每一對都包括源自對 照樣品的成員，則對源自對照樣品的三個成員的峰強(qiáng)度求和。對源自處理樣品的其余三個 成員的峰強(qiáng)度求和。通過取來自處理樣品的同位素峰的強(qiáng)度之和作為被除數(shù)并且取來自對 照樣品的同位素峰的強(qiáng)度之和作為除數(shù)來為每一對創(chuàng)建比率。參見框5068。對每一比率取 常用對數(shù)。參見框5070。計算每一比率的每一常用對數(shù)的誤差。參見框5072。通過該方法 計算成對同位素組的其他特性。參見框5074。該方法繼續(xù)至另一延續(xù)終端("終端E1")。
從終端El (圖5J)，方法500繼續(xù)至框5076，在那里為所有成對同位素組的比率的 常用對數(shù)生成P值。對于差異檢測，用戶指定差異閾值。參見框5078。執(zhí)行測試以確定是 否存在小于閾值的P值。參見判定框5080。如果對判定框5080處的測試的回答是否，則方 法5000繼續(xù)至框5082，在那里根據(jù)閾值實(shí)驗(yàn)無差異地表達(dá)。該方法繼續(xù)至另一延續(xù)終端 ("終端E2")。如果對判定框5080處的測試的回答是是，則方法5000繼續(xù)至框5084，在那 里向用戶呈現(xiàn)具有小于閾值的P值的特征的列表。該方法繼續(xù)至退出終端F并終止執(zhí)行。
從終端E2 (圖5K)，方法5000繼續(xù)至框5086，在那里方法5000標(biāo)識沒有標(biāo)識的特 征。在判定框5088處執(zhí)行測試以確定用戶是否希望執(zhí)行靶向分析。如果對判定框5088處 的測試的回答是否，則方法5000繼續(xù)至退出終端F并終止執(zhí)行。如果對判定框5088處的 測試的回答是是，則方法5000繼續(xù)至框5090，在那里用戶使用所生成的特征列表來選擇用 于進(jìn)行靶向分析的特征。使用串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)來標(biāo)識肽序列以及來自所選特征的其他信 息。參見框5092。該方法繼續(xù)至退出終端F并終止執(zhí)行。 盡管示出和描述了各說明性實(shí)施例，但是可以認(rèn)識到，可在其中作出各種改變而 不背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
一種用于找出生物樣品中的成對特征的方法，包括在不必標(biāo)識特征的核酸序列的情況下，從將對照樣品和與所述對照樣品具有跟蹤關(guān)系的處理樣品放在一起作為制備樣品的實(shí)驗(yàn)中形成合成圖像；以及從所述合成圖像中找出感興趣的特征對，一感興趣的特征對中的一個成員根據(jù)所述跟蹤關(guān)系而與所述對中的另一成員相關(guān)聯(lián)，所述跟蹤關(guān)系描述用于在合成圖像上找出所述對中的兩個成員的約束。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述跟蹤關(guān)系通過用非放射性、穩(wěn)定的同位素的原子質(zhì)量單位數(shù)來對所述處理樣品的實(shí)例進(jìn)行同位素標(biāo)記來創(chuàng)建，而所述對照樣品的實(shí)例不進(jìn)行同位素標(biāo)記。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述跟蹤關(guān)系通過反向標(biāo)記來創(chuàng)建，其中所述對照樣品的實(shí)例用先前用于對所述處理樣品進(jìn)行同位素標(biāo)記的相同的原子質(zhì)量單位數(shù)來進(jìn)行同位素標(biāo)記，而所述處理樣品的實(shí)例不進(jìn)行同位素標(biāo)記。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述跟蹤關(guān)系通過跟蹤代謝實(shí)驗(yàn)中一個或多個分子的添加或丟失來創(chuàng)建。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，找出感興趣的特征對包括找出同位素組，每一同位素組表示對照樣品或處理樣品，以及建立共同數(shù)量的同位素峰以搜索感興趣的特征對。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括計算比率的自然對數(shù)，所述比率包括被除數(shù)和除數(shù)，所述被除數(shù)是表示所述處理樣品的同位素組的同位素峰的強(qiáng)度的總和，所述除數(shù)是表示所述對照樣品的另一同位素組的同位素峰的強(qiáng)度的總和。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括計算比率的自然對數(shù)的誤差以產(chǎn)生所述比率的P值，所述P值指示所述處理樣品的差異表達(dá)水平。
8. —種其上存儲有計算機(jī)可執(zhí)行指令的可存儲的計算機(jī)可讀介質(zhì)，所述指令用于實(shí)現(xiàn)一種用于找出生物樣品中的成對特征的方法，所述方法包括在不必標(biāo)識特征的核酸序列的情況下，從將對照樣品和與所述對照樣品具有跟蹤關(guān)系的處理樣品放在一起作為制備樣品的實(shí)驗(yàn)中形成合成圖像；以及從所述合成圖像中找出感興趣的特征對，一感興趣的特征對中的一個成員根據(jù)所述跟蹤關(guān)系而與所述對中的另一成員相關(guān)聯(lián)，所述跟蹤關(guān)系描述用于在合成圖像上找出所述對中的兩個成員的約束。
9. 如權(quán)利要求8所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，所述跟蹤關(guān)系通過用非放射性、穩(wěn)定的同位素的原子質(zhì)量單位數(shù)來對所述處理樣品的實(shí)例進(jìn)行同位素標(biāo)記來創(chuàng)建，而所述對照樣品的實(shí)例不經(jīng)歷同位素標(biāo)記。
10. 如權(quán)利要求9所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，所述跟蹤關(guān)系通過反向標(biāo)記來創(chuàng)建，其中所述對照樣品的實(shí)例用先前用于對所述處理樣品進(jìn)行同位素標(biāo)記的相同的原子質(zhì)量單位數(shù)來進(jìn)行同位素標(biāo)記，而所述處理樣品的實(shí)例不進(jìn)行同位素標(biāo)記。
11. 如權(quán)利要求8所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，所述跟蹤關(guān)系通過跟蹤代謝實(shí)驗(yàn)中一個或多個分子的添加或丟失來創(chuàng)建。
12. 如權(quán)利要求8所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，找出感興趣的特征對包括找出同位素組，每一同位素組表示對照樣品或處理樣品，以及建立共同數(shù)量的同位素峰以搜索感興趣的特征對。
13. 如權(quán)利要求8所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，還包括計算比率的自然對數(shù)， 所述比率包括被除數(shù)和除數(shù)，所述被除數(shù)是表示所述處理樣品的同位素組的同位素峰的強(qiáng) 度的總和，所述除數(shù)是表示所述對照樣品的另一同位素組的同位素峰的強(qiáng)度的總和。
14. 如權(quán)利要求13所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，還包括計算比率的自然對數(shù) 的誤差以產(chǎn)生所述比率的P值，所述P值指示所述處理樣品的差異表達(dá)水平。
15. —種用于找出感興趣的特征對的系統(tǒng)，包括色譜和質(zhì)譜儀的集合，其用于接收一起提交對照樣品和處理樣品以供處理的制備樣 圖像處理流水線，其用于在制備樣品上提取特征并計算特性創(chuàng)建來自所述制備樣品的合成圖像并處理所述合成圖像；以及成對特征處理器，其用于處理來自所述合成圖像的特征以找出根據(jù)關(guān)系彼此相關(guān)聯(lián)的 感興趣的特征對，而不必首先標(biāo)識所述特征的核酸序列。
16. 如權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述圖像處理流水線包括合成圖像產(chǎn)生器，其執(zhí)行數(shù)據(jù)內(nèi)插、圖像對齊、圖像噪聲過濾、背景校正以及所述合成圖像的形成。
17. 如權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述圖像處理流水線包括合成圖像處理 器，其提取包括峰、同位素組和電荷組的特征并計算特征特性。
18. 如權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述成對特征處理器包括特征排序器，其 用于將具有最強(qiáng)信號的特征排在首位以便優(yōu)先進(jìn)行處理。
19. 如權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述成對特征處理器包括成對特征檢測 器，其通過搜索所述合成圖像，根據(jù)所述關(guān)系來找出感興趣的特征對。
20. 如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述成對特征處理器包括成對特征特性 處理器，其通過取比率的自然對數(shù)的誤差來產(chǎn)生P值，每一比率都包括被除數(shù)和除數(shù)，所述 被除數(shù)是表示所述處理樣品的同位素組的同位素峰的強(qiáng)度的總和，所述除數(shù)是表示所述對 照樣品的另一同位素組的同位素峰的強(qiáng)度的總和。
全文摘要
執(zhí)行一種找出肽、代謝物或其他物質(zhì)的成對同位素組的技術(shù)而不必標(biāo)識特征。可使用任何合適的同位素標(biāo)記方法，諸如SILAC或ICAT。該技術(shù)可通過基于單一同位素對重和輕標(biāo)記的肽進(jìn)行配對來標(biāo)識同位素對。該技術(shù)搜索具有在可由用戶調(diào)整的容差范圍內(nèi)的保留時間和質(zhì)量/電荷的同位素組。支持多標(biāo)記位點(diǎn)以及反向標(biāo)記以便限制或減少偏差。可將多個副本合并成合成圖像。
文檔編號G06F19/00GK101743604SQ200880024770
公開日2010年6月16日 申請日期2008年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日
發(fā)明者A·斯波里多諾夫, A·邦達(dá)連科, L·翁 申請人:微軟公司