專利名稱：與癌癥相關(guān)的基因的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請基于2001年11月26日提交的在先日本專利申請第2001-359503號，并要求其優(yōu)先權(quán)，原申請的全部內(nèi)容引入本文作參考。
MK基因和癌癥的聯(lián)系最近已得到闡明。例如，據(jù)報(bào)道，MK基因在癌組織如維爾姆斯瘤、結(jié)腸直腸癌、胃癌、肺癌和食管癌中的表達(dá)是正常組織中的10倍(Cancer Res.，53，1281-1285，1993)。此外，另有報(bào)道截短的MK mRNA(tMK mRNA)在癌組織中表達(dá)(Biochem.Biophys.Res.Commun.，219，256-260，1996，和Aridome，K.，等.Br.J.Cancer，78，472-477，1998)。還提出了通過MK基因表達(dá)頻率分析診斷癌癥的方法(特開平6-113898)。然而，MK基因和這一基因中的突變之間的關(guān)系仍不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到上述情況，本發(fā)明的目的是提供從與癌癥相關(guān)的MK基因中的突變位點(diǎn)及其基因型預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法。
本發(fā)明基于本發(fā)明者的如下發(fā)現(xiàn)存在于Midkine基因內(nèi)含子3上的第62個核苷酸，也就是MK基因上的808位置中的多態(tài)基因型與癌癥發(fā)病相關(guān)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者基于現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了下面的過程。即，測定個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(1)獲得來自個體的樣品；(2)分析關(guān)于上面(1)的樣品的Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象；和(3)基于上面(2)中分析的多態(tài)現(xiàn)象確定癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。
具體實(shí)施方案1.與癌癥相關(guān)的基因本發(fā)明者以前闡明了突變及其基因型的存在，并且已經(jīng)進(jìn)行了報(bào)道(Ahmed，K.M.，Shitara，Y.，Kuwano，H.，Takenoshita，S.，Ushimuro，K.，和Shinozawa，T.，Genetic variations of the midkine(MK)gene inhuman sporadic colorectal and gastric cancers，(人散發(fā)性結(jié)腸直腸癌和胃癌中Midkine(MK)基因的遺傳變異)，International joumal ofmolecular medicine 6281-287，2000)。
這次，本發(fā)明者比較了癌癥患者突變位點(diǎn)的基因型和正常人突變位點(diǎn)的基因型。然后，闡明了突變基因和癌癥發(fā)病間的關(guān)系。換言之，本發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)存在于Midkine基因的內(nèi)含子3上的第62個堿基的突變與癌癥的發(fā)病有關(guān)。
MK基因示意圖見

圖1(圖1)。與癌癥發(fā)病有關(guān)的突變存在于內(nèi)含子3(圖1中稱為“Int.3”)。突變位點(diǎn)相應(yīng)于從外顯子3(圖1中稱為“Ex.3”)開始數(shù)的內(nèi)含子3第62位。此外，根據(jù)通常的記述，該位點(diǎn)相應(yīng)于808位，其中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)為+1。在本說明書中，本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的突變位點(diǎn)稱為“MK808”。
可以存在于MK808突變位點(diǎn)的基因型是鳥嘌呤(下文中稱為G或g)和胸腺嘧啶(下文中稱為T或t)。在野生型中，兩種等位基因的基因型都是G，也就是G/G純合子(下文中稱為G/G或G/G型)。在突變型中，一種情況是等位基因中的一個基因型是T，也就是G/T雜合子(下文中稱為G/T或G/T型)，另一種情況是兩個等位基因的基因型都是T，也就是T/T純合子(下文中稱為T/T或T/T型)。當(dāng)人的MK808的基因型是G/T或T/T時，他與G/G基因型的人相比更易患癌癥。
此外，當(dāng)MK808的基因型是G/T雜合子或T/T純合子時，認(rèn)為與野生型的情況相比，來自MK基因的前mRNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。由于這一前mRNA二級結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，認(rèn)為產(chǎn)生了截短形MK mRNA(截短的MK mRNA，tMK mRNA)。因此，當(dāng)預(yù)期產(chǎn)生tMK mRNA時，具有這些基因型的人被認(rèn)為比預(yù)期不具有這些基因型的人更易患癌癥。
具體而言，預(yù)期產(chǎn)生短形(截短的)MK mRNA的情況如下也就是，在包括MK808的MK基因的任何基因座或區(qū)域(例如內(nèi)含子2、外顯子3和內(nèi)含子3)中的等位基因中觀察到非野生型的基因型的情況。此外，觀察到非野生型的基因型的情況是，例如，產(chǎn)生任何突變的情況。2.術(shù)語本文中所用的術(shù)語“與癌癥相關(guān)的基因”是對癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)有影響的基因。換言之，它是其基因型對癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)有影響的基因。本文中所用的術(shù)語“基因型”顯示要注意的基因座的等位基因的存在狀態(tài)。
本文中所用的術(shù)語“MK808”顯示突變，它是本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的基因，也就是多態(tài)現(xiàn)象。本文所用的術(shù)語“多態(tài)現(xiàn)象”和“多態(tài)基因”表示占據(jù)一個基因座的多個等位基因組，或?qū)儆谠摰任换蚪M的單個等位基因。此外，由于MK808是單個核苷酸置換，它的突變通常稱為SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單個核苷酸多態(tài)現(xiàn)象)。
本文所用的術(shù)語“癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)”指作為對象的個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的程度。因此，當(dāng)發(fā)病危險(xiǎn)高時，個體易患癌癥。
本文所用術(shù)語“癌癥”整體指各種惡性腫瘤，也就是癌癥和肉瘤。它的實(shí)例包括結(jié)腸直腸癌、胃癌、食管癌、喉癌、舌癌(tonguecancer)、肺癌、肝細(xì)胞瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌和子宮癌等。特別地，與其他癌癥發(fā)病相比，MK808或內(nèi)含子2、外顯子3和內(nèi)含子3中的突變與結(jié)腸直腸癌發(fā)病的關(guān)系具有更強(qiáng)的傾向性。3.預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法根據(jù)本發(fā)明，可以利用上述知識預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。測定癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
參考圖2，結(jié)腸直腸癌被用作本發(fā)明的測定癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的例子。下面所有的操作由操作者手工進(jìn)行。
操作者從受預(yù)測的個體采集樣品如血等，并開始預(yù)測。在步驟2a中，按要求對采集的樣品進(jìn)行處理如純化和提取，接著測定樣品中的MK808的基因型。接著進(jìn)行步驟2b的處理。
在步驟2b中，測定步驟2a中測定的MK808的基因型是G/T或T/T還是G/G。根據(jù)步驟2b的測定結(jié)果，當(dāng)基因型是G/T或T/T時，進(jìn)行步驟2c的處理，當(dāng)基因型測定為G/G時，進(jìn)行步驟2d的處理。
在步驟2c中，從步驟2b的測定結(jié)果預(yù)測個體具有結(jié)腸直腸癌發(fā)病的高危險(xiǎn)。然后結(jié)束所有預(yù)測步驟。
在步驟2d中，從步驟2b的測定結(jié)果預(yù)測個體沒有結(jié)腸直腸癌發(fā)病的高危險(xiǎn)。然后終止所有預(yù)測步驟。
可用于本發(fā)明的測定多態(tài)基因型的方法可以是任何已知的方法。例如，從得自作為對象的個體的樣品制備含有對象多核苷酸的核酸，并且可以測定基因型。
作為本發(fā)明的方法的對象的“個體”可以是任意的哺乳動物，包括人、狗、貓、牛、山羊、豬、綿羊和猴，但是人，尤其是日本人是最優(yōu)選的個體。
本文所用的“樣品”指采集于生物個體的生物樣品，如血、血清、淋巴、組織、毛和耳垢。此外，如果需要，“樣品”可以是通過對生物樣品進(jìn)行必需的任意預(yù)處理，如勻漿和提取而獲得的樣品?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)作為對象的生物樣品選擇預(yù)處理。
要從樣品制備的核酸可以從DNA制備。例如，從對象制備基因組DNA樣品的方法可以是通常使用的任何方法，如用苯酚-氯仿方法、鹽析方法或市售試劑盒從對象的外周血中的血細(xì)胞如白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞提取的方法。
當(dāng)多核苷酸的量少時，根據(jù)需要可以進(jìn)行擴(kuò)增多核苷酸的操作。例如，可以通過用酶如DNA聚合酶等進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(下文中縮寫為PCR)進(jìn)行擴(kuò)增操作。
根據(jù)需要，在進(jìn)行提取操作和/或擴(kuò)增操作后測定MK808的基因型。
測定基因型的方法，可以是在克隆后測序的任何通常使用的方法，如直接測序法、SSCP法、寡核苷酸雜化法和特異性引物法。作為測定基因型的其他方法，可以使用其他已知方法，如用限制酶進(jìn)行的PCR-RFLP法(PCR-限制酶片段長度多態(tài)現(xiàn)象方法)、PCR-SSP(PCR-特異性序列引物)法、組合斑點(diǎn)印跡法和PCR的PCR-SSO(PCR-序列特異性寡核苷酸)法，和PCR-SSCP法。然而該方法并不局限于這些。
根據(jù)上述方法測定MK808的基因型，根據(jù)其結(jié)果可以預(yù)測結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)。
此外，測定MK808的基因型并測定與癌癥相關(guān)的本身已知的基因的基因型，接著根據(jù)結(jié)果以綜合測定癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。而且，該方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。即使在這種情況下，根據(jù)所測定的基因型，例如，顯示將癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)與所研究的基因型相關(guān)聯(lián)的信息的表格，得到相應(yīng)的癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)，由此確定癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。
如上所述，MK808的基因型影響結(jié)腸直腸癌的發(fā)病。也就是，根據(jù)MK808的基因型，可能測定高概率個體中結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)。然而癌癥發(fā)病不僅與MK808的基因型有關(guān)，還受其他遺傳因素和各種環(huán)境因素的復(fù)合因素的影響。因此，除了與癌癥有關(guān)的基因的信息外，還可以加入其他遺傳因素的信息以進(jìn)行預(yù)測。例如，信息可以是與其他遺傳因素有關(guān)的信息，和與環(huán)境因素有關(guān)的信息，例如，老化、食物攝入的傾向、奢侈品等。顯示將那些因素與癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的信息的表格可以用于這種方法的情況中。測定方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，根據(jù)需要，可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明的上述方法加以改變。
此外，本發(fā)明的上述方法也可以用計(jì)算機(jī)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
換言之，本發(fā)明提供用計(jì)算機(jī)測定個體中結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(1)由操作者將用來自個體的樣品測定的MK808的基因型輸入計(jì)算機(jī)；(2)根據(jù)以前存儲在計(jì)算機(jī)的存儲裝置中的將結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)和基因型相關(guān)聯(lián)的表格，基于上面(1)中輸入的基因型由計(jì)算機(jī)測定結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)；和(3)由計(jì)算機(jī)向操作者顯示(2)中獲得的測定結(jié)果。
例如，可以如下所述實(shí)施該方法。
圖3是顯示用于實(shí)施本發(fā)明的方法的裝置的一個實(shí)施方案的框圖。處理裝置4與輸入裝置2、顯示裝置3和存儲裝置5相連。如圖3所示，本實(shí)施方案的計(jì)算機(jī)1至少裝有用于由操作者向計(jì)算機(jī)1輸入數(shù)據(jù)的輸入裝置2，用于顯示各種信息的顯示裝置3，處理裝置4如控制計(jì)算機(jī)和進(jìn)行各種處理的處理器和CPU，存儲程序的存儲裝置5，工作臺等。輸入裝置2可以是，例如，鍵盤和鼠標(biāo)。
用計(jì)算機(jī)測定個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法的實(shí)例在下面參考圖4得到闡述。
于此，處理裝置4是主要的控制部分，它集中控制計(jì)算機(jī)的各部分，運(yùn)行存儲在存儲部分的預(yù)測程序，預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。當(dāng)操作者輸入來自作為預(yù)測對象的個體的MK808的基因型的信息時，輸入的信息存儲在存儲裝置5中(圖3中)，并轉(zhuǎn)移到步驟4b。于此，要輸入的基因型的信息可以是特定基因型和原始數(shù)據(jù)，它可以是代表對象基因型信息的任何信息。
在步驟4b中，處理裝置4通過讀出并研究存儲裝置5中預(yù)先存儲的將結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)與基因型相關(guān)聯(lián)的表格1(圖5)，從所記錄的信息得到相應(yīng)的結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)，方法轉(zhuǎn)移到步驟4c。
在步驟4c中，處理裝置4基于步驟4b中測定結(jié)果確定結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)。也就是，當(dāng)MK808的基因型是G/T或T/T時，它決定方法轉(zhuǎn)移到步驟4d，當(dāng)MK808的基因型是G/G時，它決定方法轉(zhuǎn)移到步驟4e。
在步驟4d中，處理裝置4預(yù)測個體具有易患結(jié)腸直腸癌的高概率，方法轉(zhuǎn)移到步驟4f。
在步驟4f中，處理裝置4在顯示裝置3中顯示步驟4d中的預(yù)測結(jié)果，和/或?qū)⑺涗浽诖鎯ρb置5中，結(jié)束所有預(yù)測方法。于此，顯示可以以圖像輸出，所述圖像顯示以前存儲在存儲裝置5中的結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)。此外，根據(jù)需要可以設(shè)置從步驟4f轉(zhuǎn)移到步驟4a的循環(huán)。
在步驟4e中，處理裝置4預(yù)測個體沒有易患結(jié)腸直腸癌的高概率，方法轉(zhuǎn)移到步驟4g。
在步驟4g中，處理裝置4在顯示裝置3中顯示步驟4e中的預(yù)測結(jié)果，和/或?qū)⑺涗浽诖鎯ρb置5中，結(jié)束所有預(yù)測方法。于此，顯示可以以圖像輸出，所述圖像顯示以前存儲在存儲裝置5中的結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)。此外，根據(jù)需要可以設(shè)置從步驟4g轉(zhuǎn)移到步驟4a的循環(huán)。
本文所用的“表格”是將癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)與基因型相關(guān)聯(lián)的信息。例如，圖5顯示一個實(shí)例，其中表1以圖表形式顯示。本文所用的表格和圖表可以是那些將癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)和基因型相關(guān)聯(lián)的信息。換言之，當(dāng)它是能實(shí)際顯示癌癥發(fā)病和基因型間的關(guān)系的記述時，例如，“○”、“×”和“△”可能較好，或者由簡化的值評分(例如1、2、3、4和5等)可能較好。
此外，在上述方法中，只有MK808得到測定并作為信息輸入，進(jìn)行預(yù)測。然而，除MK808的信息之外，可以通過考慮與癌癥相關(guān)的其他本身已知的基因，和/或環(huán)境因素，并且作為信息輸入，來進(jìn)行癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的預(yù)測。在這種情況下，與要輸入的信息一致的表格的構(gòu)成可以改變。
此外，本發(fā)明的上述方法可以根據(jù)需要改變，只要它不偏離本申請的發(fā)明范圍。
此外，用于實(shí)施用上述計(jì)算機(jī)預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法的程序也在本申請的發(fā)明范圍內(nèi)。該程序是，例如，用于預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的程序，它使計(jì)算機(jī)用作(1)用于記錄用來自個體的樣品測定的MK808的基因型信息的數(shù)據(jù)記錄裝置；(2)用于根據(jù)以前存儲在計(jì)算機(jī)中的將基因型和結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的表格，基于上面(1)中記錄的基因型，分析結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)的裝置；以及(3)用于輸出上面(2)中獲得的預(yù)測結(jié)果的輸出裝置。
此外，該程序可以使計(jì)算機(jī)用作用于輸入用來自個體的樣品測定的MK808的基因型的信息的輸入裝置，以預(yù)測個體中結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)。另外，可以通過存儲在任何本身已知的存儲介質(zhì)中來提供程序。
此外，用于預(yù)測個體中結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)的預(yù)測裝置也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述預(yù)測裝置包括
(1)用于存儲將基因型與結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的表格的存儲裝置；(2)用于輸入用來自作為測試對象的個體的樣品測定的MK808的基因型的信息的輸入裝置；(3)用于基于通過輸入裝置輸入的基因型和由存儲裝置存儲的表格，預(yù)測結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)的預(yù)測裝置；和(4)用于顯示預(yù)測裝置的預(yù)測結(jié)果的顯示裝置。
此外，本發(fā)明提供用計(jì)算機(jī)預(yù)測個體中結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(1)將用來自個體的樣品測定的MK808的基因型的信息存儲在數(shù)據(jù)存儲裝置中；(2)根據(jù)以前存儲在計(jì)算機(jī)中的將結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)和基因型相關(guān)聯(lián)的表格，基于上面(1)中存儲的基因型，預(yù)測結(jié)腸直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)；和；(3)輸出上面(2)中獲得的預(yù)測結(jié)果。
如上所述，當(dāng)預(yù)測產(chǎn)生短形MK mRNA時，認(rèn)為與沒有預(yù)測產(chǎn)生短形MK mRNA的情況相比，對象易患癌癥。在上述方法中，用MK808的實(shí)例被顯示為Midkine基因的多態(tài)位點(diǎn)。然而，如上所述，可以通過檢測MK基因的另一位點(diǎn)和區(qū)域的突變而類似地預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。在這種情況下，通過上述方法，如預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法和用計(jì)算機(jī)預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法測定的多態(tài)基因型可以是，例如，是否測定了MK的mRNA變成短型的。此外，可以通過任何本身已知的方法來進(jìn)行檢測突變的方法。4.預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的多核苷酸此外，本發(fā)明提供能用于預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的多核苷酸。
為方便起見，本說明書中所用的術(shù)語“多核苷酸”指多核苷酸、寡核苷酸等。此外，在此“多核苷酸”指通過磷酸酯鍵結(jié)合2個或更多個核苷酸而獲得的物質(zhì)。核苷酸包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，但并不局限于這些。此外，作為本發(fā)明的一個實(shí)施方案的多核苷酸可以是從人分離的MK基因，和基于其獲得的DNA和RNA等。此外，本發(fā)明中的“多核苷酸”還表示人工合成的核酸如肽核酸、嗎啉代核酸、甲基膦酸核酸和S-寡核酸。
為了獲得需要的序列，可以合成多核苷酸，也可以從生物樣品制備多核苷酸。當(dāng)從生物樣品制備多核苷酸時，從個體采集樣品，接著可以進(jìn)行從樣品提取多核苷酸的操作。作為從生物成分提取多核苷酸的方法，除了可以使用苯酚提取和乙醇沉淀外，還可以使用任意的提取方法。
為了檢測MK808，可以將本發(fā)明提供的多核苷酸用作測定來自個體的樣品的多核苷酸序列的核酸探針和引物。
例如，核酸探針可以以提供在DNA微陣列的基底(一般稱為DNA芯片)上的狀態(tài)使用。含有本發(fā)明的多核苷酸作為核酸探針的DNA微陣列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，依照本發(fā)明可以使用的DNA微陣列是具有作為探針用于檢測和/或分析MK基因上的突變的核酸的裝置。用于進(jìn)行分析，如檢測作為對象的核酸的DNA微陣列利用核酸探針和要檢測的核酸的雜交?？梢酝ㄟ^本身已知的方法生產(chǎn)DNA微陣列。
本發(fā)明提供的多核苷酸是由下面(a)至(o)的多核苷酸組成或包括它們(a)SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中顯示的多核苷酸。
(b)SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中顯示的多核苷酸。這些堿基序列不是通常檢測到的MK808的G或T，而序列是A和C。這些序列優(yōu)選地用作用于測定來自個體的樣品的多核苷酸的序列的探針。例如，當(dāng)分析SNP位點(diǎn)的基因型時，其對于提高所獲得的結(jié)果的可靠性有用。
(c)在上面(a)和(b)中顯示的多核苷酸中，除了與癌癥有關(guān)的MK808之外的一個或多個核苷酸被缺失、置換或添加的修飾的多核苷酸。
(d)一種多核苷酸，其為含有MK808位點(diǎn)的MK基因的部分片段。例如，該片段可以是約10個核苷酸至約500個核苷酸。優(yōu)選為約10個核苷酸至約100個核苷酸。當(dāng)將它用作核酸探針時，它更優(yōu)選為約10個核苷酸至約30個核苷酸。
(e)上面(a)至(d)中描述的多核苷酸的互補(bǔ)鏈。
此外，包含上述多核苷酸的所謂DNA微陣列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語“DNA微陣列”用作不僅含有一般稱為DNA微陣列的裝置，還含有一般稱為DNA芯片的裝置的集合術(shù)語。
作為本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供的DNA微陣列是可以用于一般基因分析的裝置。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，DNA微陣列的基本結(jié)構(gòu)的特征在于，用于檢測MK808基因上的突變的多核苷酸作為核酸探針提供在基底上。此外，可以通過任何一種本身已知的方法生產(chǎn)DNA微陣列。
例如，根據(jù)本發(fā)明可以用作引物的多核苷酸可以是用于擴(kuò)增用于檢測或分析MK808基因上的突變的多核苷酸的多核苷酸。這種引物的實(shí)例可以是具有SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10中顯示的序列的多核苷酸。
以下用實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。[實(shí)施例]1.MK基因的多態(tài)現(xiàn)象的分析(1)對象用在Gunma大學(xué)附屬醫(yī)院治療的癌癥患者(98例結(jié)腸直腸癌、60例胃癌、37例乳腺癌、32例肺癌和51例食管癌)作為癌癥患者組。用正常志愿者組作為對照組，其由Gunma大學(xué)職員和學(xué)生86人組成。所有癌癥患者和正常志愿者都是日本人。(2)基因組DNA的提取首先，從采集自各組個體的樣品中提取基因組DNA。
對于癌癥患者，將通過在Gunma大學(xué)附屬醫(yī)院中進(jìn)行的手術(shù)從癌癥患者切除的腫瘤組織用作樣品。此外，腫瘤組織是相應(yīng)于中心部分的部分，從整個腫瘤來看，這部分清楚地確定為腫瘤，也使用腫瘤周圍清楚地確定為不是腫瘤的部分。將采集的組織樣品在切除后立即冷凍在液氮中，并在-80℃保存。
用十二烷基磺酸鈉(下文中稱為SDS)、Protenase K(由和光純藥社制造)處理冷凍保存的組織后，通過苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀來提取DNA。
從正常志愿者采血作為樣品。用QIAamp Blood Kit(注冊商標(biāo)，QIAamp Blood Kit，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)使用手冊從采集的外周血純化基因組DNA。(3)MK基因的PCR擴(kuò)增用SEQ ID Nos.5至8作為引物，通過PCR擴(kuò)增上面(2)中提取的基因組DNA。根據(jù)下面的方法進(jìn)行通過PCR的擴(kuò)增。從上面(2)中獲得的純化基因組DNA取50ng，放入10μL反應(yīng)溶液中，所述反應(yīng)溶液含有0.2μM引物的有義和反義，0.2mM dNTP，10mMTris-HCl(25℃下pH＝8.8)，1.5mM MgCl2，0.5U Taq DAN聚合酶(由Sawadi Co.制造)，10％二甲基亞砜(DMSO，由和光純藥社制造)(取決于引物)和0.1μL[α32P]dCTP(約3000 Ci/mmol，10mCi/mL，由Amasham Co.制造)。PCR反應(yīng)在DNA熱循環(huán)儀(PE，由Applied Biosystems Co.制造)中進(jìn)行35個包括下面步驟的循環(huán)，95℃一分鐘，60～66℃ 40秒，70℃ 50分鐘。(4)單鏈DNA高級結(jié)構(gòu)的多態(tài)現(xiàn)象分析在上述(3)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在94℃在85％甲酰胺中熱修飾5分鐘后，將其冷卻并進(jìn)行電泳。電泳在12℃，25W或40W恒定輸出功率的條件下，用含有5％或10％甘油的5％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行。電泳后，將凝膠在真空下干燥，通過在室溫下將分離的DNA整夜暴露在柯達(dá)XAR膠片上進(jìn)行它的放射自顯影。(5)DNA核苷酸序列的分析將具有不同遷移程度的DNA片段從干燥的凝膠中提取出，在與上面(3)中相同的條件下用有義和反義引物(分別在SEQ ID Nos.9和10中描述)再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增35個循環(huán)。獲得的PCR產(chǎn)物是357個堿基對的片段(下文中稱為bp)。接著，用由Invitrogene Co.制造的TA克隆試劑盒將這一片段摻入載體，用島津公司制造的DNA測序儀(DSQ 1000型)測定DNA的核苷酸序列。
此外，為了簡單檢測G/G和G/T多態(tài)現(xiàn)象，進(jìn)行通過限制酶AvaII(New England Biolab，美國)測試斷裂，接著在1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳的方法。對象MK808在限制酶斷裂序列(5′-GGACC-3′)中。通過從G到T的突變將這一斷裂序列轉(zhuǎn)化成非斷裂序列(5′-GTACC-3′)。因此，可以測定多態(tài)基因型，如下面的結(jié)果所示。2.結(jié)果圖6(圖6)代表性地顯示了上面項(xiàng)目1的(5)的結(jié)果中獲得的電泳結(jié)果。圖6顯示了泳道1的G/T型結(jié)腸直腸癌患者、正常志愿者等的結(jié)果，泳道2的G/G型結(jié)腸直腸癌患者、正常志愿者等的結(jié)果，泳道3的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(堿基對)的結(jié)果，和泳道4的AvaII沒有被處理的G/G或G/T型結(jié)腸直腸癌患者、正常志愿者等的結(jié)果。
當(dāng)MK808的基因型是G/G型時，對于通過上面項(xiàng)目1的(5)的PCR獲得的PCR產(chǎn)物而言，限制酶Ava II的識別位點(diǎn)也存在于來自等位基因的任何雙鏈DNA中。因此，當(dāng)MK808的基因型是G/G型時，檢測260bp和97bp的2個條帶。另一方面，當(dāng)MK808的基因型是G/T雜合子時，限制酶Ava II的識別位點(diǎn)并不存在于來自等位基因的雙鏈DNA的一側(cè)的PCR產(chǎn)物中。因此，當(dāng)MK808的基因型是G/T型時，除了260bp和97bp的2個條帶外，還檢測357bp的1個條帶。
表1顯示通過上述對所有癌癥患者和正常志愿者進(jìn)行的分析所獲得的結(jié)果。表1健康對照和癌癥患者中兩種基因型(G/G和G/T)的分布

a 在任何癌癥或?qū)φ諛悠分卸紱]有檢測到T/T基因型。b Fisher’s精確概率檢測。n.s.“無顯著性差異”表1顯示正常志愿者和癌癥患者各自基因型的G/G和T/T的分布和比例。在正常志愿者中G/T型的比例是2.3％(86例中有2例)。在癌癥患者中，結(jié)腸直腸癌是11.2％(98例中有11例)，胃癌是1.6％(60例中有1例)，食管癌是5.0％(59例中有3例)，肺癌是3.1％(32例中有1例)，乳腺癌是0％(37例中有0例)。根據(jù)這一結(jié)果，顯然結(jié)腸直腸癌患者中的G/T型比正常志愿者的更頻繁。此外，通過Fisher′s精確概率檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果，結(jié)腸直腸癌組和對照組間檢測到顯著性差異(P＝0.017)。此外，在具有G/T型的樣品(20例)中結(jié)腸直腸癌患者是11例(55％)，相反，正常志愿者是2例(10％)。顯然在結(jié)腸直腸癌和MK808的基因型G/T問存在顯著相關(guān)性。此外，在其他癌癥中，雖然具有G/T型的對象從0至15％變化，但觀察到癌癥患者中的百分比高于正常志愿者的趨勢。最后，提出主要是結(jié)腸直腸癌和MK808基因型G/T間的相關(guān)性。3.討論最近，許多研究已經(jīng)證明生長因子不僅促進(jìn)正常組織的增殖，而且誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化(Aaronson，S.A.，Science，2541146-1153，1991)。在許多人腫瘤中發(fā)現(xiàn)生長因子的過度表達(dá)，這一現(xiàn)象通常被認(rèn)為是癌發(fā)生的原因(Aaronson，S.A.，Science，2541146-1153，1991)。在人癌癥中觀察到MK基因的表達(dá)增加(Aridome，K.，Tsutsui，J.，Takao，S.，Kdomatsu，K.，Ozawa，M.，Aikou，T.和Muramatsu，T.，Jpn，J.CancerRes.，86655-661，1995)。此外，在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外顯子3缺失的MK mRNA的截短形式，而在正常細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)(Kaname，T.，Kadomatsu，K.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，219256-260，1996)。然而，腫瘤發(fā)生期間MK的生物學(xué)功能仍沒有得到闡明。
MK基因的遺傳多態(tài)性由本發(fā)明者通過PCR-SSCP和DNA測序得到鑒定，并已報(bào)道(Ahmed，K.M.，Shitara，Y.，Kuwano，H.，Takenoshita，S.，Uchinuro，K.和Shinozawa，T.，Int.J.Mol.，6281-287，2000)。這次，本發(fā)明者首次闡明了MK基因的多態(tài)現(xiàn)象和癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)之間的關(guān)系。本發(fā)明者還就從86例健康人，98例結(jié)腸直腸癌，60例胃癌，59例食管癌，32例肺癌，37例乳腺癌獲得的DNA進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，以證明MK808的基因型G/T和結(jié)腸直腸癌之間的關(guān)系。用Fisher′s精確概率計(jì)算方法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果，證明了G/T多態(tài)現(xiàn)象和結(jié)腸直腸癌之間的關(guān)系，概率為p＜0.017。
必需基因的幾項(xiàng)研究支持內(nèi)含子區(qū)多態(tài)現(xiàn)象的重要性。據(jù)報(bào)道，在hHSH2的內(nèi)含子12中單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象與結(jié)腸直腸癌危險(xiǎn)增加有關(guān)(Gessel，C.，Plaschke，J.，Pistorius，S.，Hahn，M.，F(xiàn)rank，S.，Hampl，M.，Gorgens，H.，Koch，R.，Saege，H.D.，和Schackert，H.K.Eur.J.Cancer，331869-1874，1997)。Mavridou等報(bào)道位于TP53基因的內(nèi)含子6上的61核苷的多態(tài)現(xiàn)象(G到A的轉(zhuǎn)變)與子宮癌危險(xiǎn)增加有關(guān)(Mavridou，D.，Gomall，R.，Campbell，I.G.，和Eccles，D.M.，Br.J.Cancer，77676-677，1998)。與外顯子中的突變不同，這些內(nèi)含子突變并不常導(dǎo)致基因的異常表達(dá)。然而，它對癌癥危險(xiǎn)的影響可能歸因于與另一可疑基因的連接(Sugimoto，K.M.，Toyoshima，H.，Sakai，R.，Miyagawa，K.，Hagiwara，K.，Ishikawa，F(xiàn).，Takaku，F(xiàn).，Yazaki，Y.，和Hirai，H.，Blood，792378-2383，1992)。
如這里所報(bào)道的，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雜合G/T多態(tài)現(xiàn)象與結(jié)腸直腸癌的危險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。這表明多態(tài)現(xiàn)象可能對結(jié)直腸的病因有貢獻(xiàn)。這一多態(tài)現(xiàn)象是MK基因的外顯子3和內(nèi)含子3中唯一檢測到的基因突變(Ahmed K.M.，Shitara Y.，Kuwano H.，Takenochita S.，Uchinuro K.和Shinozawa T.，Int.J.Mol.，628 1-287，2000)。這一多態(tài)現(xiàn)象似乎是MK mRNA異常剪接的原因。
在野生型MK前mRNA中，形成推定的包括內(nèi)含子3多態(tài)現(xiàn)象的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(圖7)。這一結(jié)構(gòu)的自由能是□G＝-21.9Kcal/mol。經(jīng)計(jì)算，G到T的轉(zhuǎn)化通過破壞位于莖3中內(nèi)含子3上第62位(也就是MK808)的堿基配對作用使這一莖-環(huán)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定(也就是從□G＝-21.9Kcal/mol降低到□G＝-14.7Kcal/mol)。G/T多態(tài)現(xiàn)象使前MK mRNA二級結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定可能擾亂這一RNA的剪接，導(dǎo)致tMK mRNA(和tMK蛋白)的產(chǎn)生。通過這一機(jī)理，可能解釋這一多態(tài)現(xiàn)象對MK功能的作用(或影響)。本文中上述自由能通過遺傳信息處理軟件“Genetyx-win”(3.1版)測定。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，將很容易獲得另外的優(yōu)勢和修飾。因此，從其廣義范疇來說，本發(fā)明并不局限于本文顯示和描述的這些具體細(xì)節(jié)和代表性的實(shí)施方案。因此，在不背離由所附權(quán)利要求及其等價(jià)物定義的總的發(fā)明構(gòu)思的實(shí)質(zhì)或范圍的前提下，可進(jìn)行各種修飾。
序列表<110>工藤憲雄<120>與癌癥相關(guān)的基因<130>02S1288<160>10<210>1<211>19<212>DNA<213>Midkine基因<400>1gcctgggggg acccttggg19<210>2<211>19<212>DNA<213>Midkine基因<400>2gcctgggggt acccttggg19<210>3<211>19<212>DNA<213>Midkine基因<400>3gcctgggggc acccttggg19<210>4<211>19<212>DNA<213>Midkine基因<400>4gcctggggga acccttggg19<210>5<211>20<212>DNA<213>Midkine基因<400>5gtcctgaact ctgttcctcg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>Midkine基因<400>6cacgcacccc agttctcaaa 20<210>7<211>21<212>DNA<213>Midkine基因<400>7gcaactggaa gaaggagttt g21<210>8<211>21<212>DNA<213>Midkine基因<400>8acttggaatt gtcccctcac a21<210>9<211>20<212>DNA<213>Midkine基因<400>9gtcctgaact ctgttcctcg 20<210>10<211>21<212>DNA<213>Midkine基因<400>10cacgcacccc agttctcaaa 20
權(quán)利要求
1.預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于包括以下步驟(1)獲得來自個體的樣品；(2)分析關(guān)于(1)的樣品的Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象；和(3)基于上面(2)中測定的多態(tài)現(xiàn)象預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1的預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于，通過測定多態(tài)現(xiàn)象的基因型來進(jìn)行上面(2)中描述的Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象的分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于，Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象是存在于內(nèi)含子2、外顯子3和內(nèi)含子3中的多態(tài)現(xiàn)象。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)的預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于，當(dāng)Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象與野生型不同時，則預(yù)測個體患癌癥的概率大。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)的預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于，當(dāng)預(yù)測Midkine基因的mRNA是截短型時，則預(yù)測個體患癌癥的概率大。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)的預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于，當(dāng)Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象是MK808，并且基因型是G/T雜合子或T/T純合子時，則預(yù)測個體患癌癥的概率大。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之任一項(xiàng)的預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，其特征在于，癌癥是結(jié)腸直腸癌。
8.用計(jì)算機(jī)預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(1)將用來自個體的樣品測定的Midkine基因的基因型信息記錄在數(shù)據(jù)記錄裝置中；(2)根據(jù)以前存儲在計(jì)算機(jī)中的將癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)和基因型相關(guān)聯(lián)的表格，基于上面(1)中記錄的基因型指示癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)；和(3)輸出上面(2)中獲得的預(yù)測結(jié)果。
9.用計(jì)算機(jī)預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟(1)由操作者將用來自個體的樣品測定的Midkine基因的基因型輸入計(jì)算機(jī)；(2)根據(jù)以前存儲在計(jì)算機(jī)的存儲裝置中的將癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)和基因型相關(guān)聯(lián)的表格，基于上面(1)中輸入的基因型，由計(jì)算機(jī)指示癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)；(3)由計(jì)算機(jī)向操作者顯示上面(2)中獲得的預(yù)測結(jié)果。
10.用于預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的程序，所述程序使計(jì)算機(jī)用作(1)用于記錄用來自個體的樣品測定的Midkine基因的基因型信息的裝置；(2)用于根據(jù)以前存儲在計(jì)算機(jī)中的將癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)和基因型相關(guān)聯(lián)的表格，基于上面(1)中記錄的基因型指示癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的裝置；以及(3)用于輸出上面(2)中獲得的預(yù)測結(jié)果的裝置。
11.預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的預(yù)測裝置，其特征在于包括(1)用于存儲將基因型和癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的表格的存儲裝置；(2)用于輸入用來自作為受測對象的個體的樣品測定的MK808的基因型信息的輸入裝置；(3)用于根據(jù)通過輸入裝置輸入的基因型和由存儲裝置存儲的表格，歸納癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的預(yù)測裝置；(4)用于顯示預(yù)測裝置的預(yù)測結(jié)果的顯示裝置。
12.包含作為測定MK808的基因型的核酸探針的至少一種多核苷酸的DNA微陣列，所述多核苷酸選自下列多核苷酸(a)選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.4的多核苷酸；(b)在上面(a)中顯示的多核苷酸中，除了與癌癥相關(guān)的MK808基因之外的一個或多個核苷酸被缺失、置換或添加的修飾的多核苷酸；(c)一種多核苷酸，其為含有MK808位點(diǎn)的MK基因的部分片段；(d)上面(a)至(d)中描述的多核苷酸的互補(bǔ)鏈。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)測個體中癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)的方法，所述方法包括(1)獲得來自個體的樣品，(2)分析有關(guān)(1)的樣品的Midkine基因的多態(tài)現(xiàn)象，(3)基于上面(2)中測定的多態(tài)現(xiàn)象預(yù)測癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)。
文檔編號G06Q10/04GK1421532SQ0215287
公開日2003年6月4日 申請日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月26日
發(fā)明者篠沢隆雄, 卡齊·莫基姆·艾哈邁德, 設(shè)樂芳范, 桑野博行, 竹之下誠一 申請人:工藤憲雄