編碼ncrna的超保守區(qū)域的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了用于區(qū)分人癌癥的方法，包括使用一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄的超保守區(qū)域（T-UCR）的表達(dá)特征譜，其中UCR的基因組定位與分析的癌癥相關(guān)基因組元件之間的相關(guān)性（association）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高度顯著，并且與對(duì)于miRNA所報(bào)導(dǎo)的相關(guān)性相當(dāng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】編碼NCRNA的超保守區(qū)域
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年8月4日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880108689.2的同名申請(qǐng)的分
案申請(qǐng)。
[0002]交叉引用相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求2008年8月4日提交的PCT申請(qǐng)PCT/US08/072081 (其要求2007年8月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案60/963，329的優(yōu)先權(quán))的權(quán)益，其全部公開(kāi)內(nèi)容明確地通過(guò)引用合并入本文。
[0004]關(guān)于聯(lián)邦政府支助的研究的聲明
[0005]本發(fā)明是在無(wú)任何政府支助的情況下進(jìn)行的，因此政府在本發(fā)明中不具有權(quán)利。
[0006]背景
[0007]總體來(lái)說(shuō)，癌癥是美國(guó)和全世界范圍內(nèi)死亡率和發(fā)病率的重要來(lái)源。然而，癌癥是種類(lèi)繁多的具有不同病因?qū)W的疾病。因此研究者未能開(kāi)發(fā)涵蓋幾種類(lèi)型以上的癌癥的治療或診斷檢測(cè)。
[0008]例如，癌癥與許多不同種類(lèi)的染色體特征相關(guān)。一個(gè)這樣的染色體特征是某些基因的基因組結(jié)構(gòu)的擾亂(pe rturbation)，例如腫瘤抑制基因的缺失或突變?；驍U(kuò)增或啟動(dòng)子激活(例如，通過(guò)病毒整合)、表觀(guān)遺傳修飾(例如，DNA甲基化的變化)和染色體易位導(dǎo)致的原癌基因的激活也可引起癌癥發(fā)生(cancerigenesis)。基因組結(jié)構(gòu)中牽涉癌癥的病因?qū)W的此類(lèi)擾亂稱(chēng)為“癌癥相關(guān)基因組區(qū)域”或“CAGR”。
[0009]染色體脆性位點(diǎn)是另一類(lèi)牽涉癌癥的病因?qū)W的染色體特征。染色體脆性位點(diǎn)是當(dāng)DNA合成在中期被干擾時(shí)顯示異常高的缺口或斷裂發(fā)生的基因組DNA的區(qū)域。這些脆性位點(diǎn)被分類(lèi)為“稀有的”或“普通的”。如它們的名稱(chēng)所暗示的，稀有脆性位點(diǎn)是不常見(jiàn)的。此類(lèi)位點(diǎn)與二或三核苷酸重復(fù)相關(guān)，可通過(guò)葉酸缺乏在中期染色體中誘導(dǎo)，并且以孟德?tīng)柗绞椒蛛x。示例性稀有脆性位點(diǎn)是脆性X位點(diǎn)。
[0010]當(dāng)在抑制DNA聚合酶的姆腸霉素(aphidocolin)或5_氮雜胞苷存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，顯現(xiàn)普通型脆性位點(diǎn)。已鑒定了至少89個(gè)普通型脆性位點(diǎn)，在每一個(gè)人染色體中發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)這樣的位點(diǎn)。因此，雖然對(duì)它們的功能了解甚少，但普通型脆性位點(diǎn)代表了人染色體結(jié)構(gòu)的基本組成部分。
[0011 ] 脆性位點(diǎn)的體外誘導(dǎo)導(dǎo)致增加的姐妹染色單體交換和高比率的染色體缺失、擴(kuò)增和易位，然而脆性位點(diǎn)在體內(nèi)與染色體斷裂點(diǎn)共定位。此外，在腫瘤細(xì)胞中研究的大多數(shù)普通型脆性位點(diǎn)含有大的基因座內(nèi)缺失或易位，已鑒定許多腫瘤在多個(gè)脆性位點(diǎn)中具有缺失。因此染色體脆性位點(diǎn)在機(jī)制上參與產(chǎn)生許多通常見(jiàn)于癌細(xì)胞中的染色體損傷。
[0012]所有惡性細(xì)胞在編碼癌蛋白(oncoprotein)基因或腫瘤抑制基因的DNA基因座上具有特殊的改變(Balmain等，2003; Wooster和Weber, 2003)。該常見(jiàn)特征最近已被擴(kuò)展至包括一大類(lèi)稱(chēng)為microRNA(miRNA)的非編碼RNA(ncRNA) (Ambros, 2004),所述RNA也參與癌癥的起始和進(jìn)展(Calin等,2002; Croce和Calin, 2005; Berezikov和Plasterk, 2005a; Esquela-Kerscher 和 Slack, 2006; Calin 和 Croce, 2006a)。MiRNA 在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上影響基因表達(dá)的調(diào)控(Ambros，2003; Ambros, 2004)。[0013]miRNA和其他類(lèi)型的ncRNA在人腫瘤發(fā)生中的參與程度還不清楚。因此，存在對(duì)進(jìn)一步研究癌癥中發(fā)生改變的分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的需要。
[0014]存在對(duì)鑒定新型分子標(biāo)記物和潛在治療劑的另外的需要。
[0015]人基因組的超保守區(qū)域(UCR) (Bejerano等，2004b)也是在不同物種間幾乎完全保守的miRNA(Berezikov等，2005b)。例如，已顯示miR-16_l/miR-15a簇的活性分子是慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的起始的必需參與者(Calin等，2005a)，并且在人、小鼠和大鼠中完全保守，在10個(gè)已測(cè)序的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物物種的9個(gè)中高度保守(Berezikov等，2005b)。比較序列分析已鑒定了許多高度保守的基因組序列。一些此類(lèi)區(qū)域不產(chǎn)生翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物，從而被認(rèn)為是非基因的(non-genic)。已將不同的名稱(chēng)用于該類(lèi)序列:保守非基因序列(CNG) (Dermitzakis 等，2005)、保守非編碼序列(CNS/CNC) (Meisler, 2001)、多物種保守序列(MCS) (Thomas等,2003)或高度保守區(qū)域(HCR) (Duret等,1993)。
[0016]UCR是位于基因區(qū)域內(nèi)和基因區(qū)域間的保守序列的亞組(subset)。它們?cè)谌恕⒋笫蠛托∈蠡蚪M的直系同源區(qū)域之間是絕對(duì)保守的(100%) (Bejerano等，2004b)。與其他保守序列區(qū)域不同，53%的UCR被分類(lèi)為非外顯子的(non-exonic) (' N' ,481個(gè)中256個(gè)無(wú)編碼蛋白質(zhì)的證據(jù))，而其他47%被指定為外顯子的('E'，481個(gè)中111個(gè)與已知的蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA交疊)或可能外顯子的('P'，481個(gè)中114個(gè)具有不確定的與蛋白質(zhì)編碼基因交疊的證據(jù))。
[0017]非編碼功能性基因組區(qū)域的大部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有顯著的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)并且是含有其他具有功能性非編碼意義的序列的簇的組成部分(Bejerano等，2004a)。UCR代表可能具有功能但不編碼蛋白質(zhì)的一小部分人基因組，并且一直以來(lái)被稱(chēng)為人基因組的“暗物質(zhì)(dark matter)”(Bejerano等，2004a)。由于高度的保守程度,UCR對(duì)于哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物的個(gè)體發(fā)生(ontogeny)和種系發(fā)生(phylogeny)具有基本的功能重要性。這可通過(guò)最近的發(fā)現(xiàn):在4億多年前的總鰭魚(yú)(lobe-finned fish)和陸生脊椎動(dòng)物中具有活性并且在“活化石”腔棘魚(yú)(coelacanth)中保持活性的來(lái)源于新型反轉(zhuǎn)錄子的遠(yuǎn)側(cè)增強(qiáng)子和超保守外顯子來(lái)舉例說(shuō)明(Bejerano等，2006)。
[0018]UCR的功能重要性的另外的實(shí)驗(yàn)證據(jù)基于具有靶向的突變的小鼠的分析。缺乏超保守元件或高度保守序列的基因沙漠(gene desert)的兆堿基缺失(Megabase deletion)導(dǎo)致產(chǎn)生明顯無(wú)可檢測(cè)表型的活小鼠(Nobrega等，2004)。相比之下，含有數(shù)個(gè)UCR的基因沙漠(例如圍繞人染色體13g21.33上的DA CHI基因的兩個(gè)基因沙漠)經(jīng)顯示含有遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子，它們中的一些由UCR序列組成(Nobrega等，2003)。
[0019]雖然對(duì)癌癥相關(guān)疾病的治療進(jìn)行了相當(dāng)多的研究，但此類(lèi)疾病仍然難以有效地診斷和治療。因此，在本領(lǐng)域存在對(duì)用于診斷和/或治療癌癥的改良的方法的需要。本發(fā)明滿(mǎn)足了這些需要，并且還提供了其他相關(guān)有利方面。
[0020]發(fā)明概述
[0021]本文中描述了 UCR在一大組人白血病和癌中的狀態(tài)的全面基因組探詢(xún)(interrogation)。
[0022]我們調(diào)查了 UCR在各種正常樣品和癌癥樣品中的基因組范圍的表達(dá)，而且我們?cè)u(píng)估了此類(lèi)序列的基因組定位與已知的參與癌癥的區(qū)域之間的關(guān)系。
[0023]此外，我們鑒定了 miRNA在癌癥相關(guān)UCR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能性作用。[0024]本文中還描述了癌癥系統(tǒng)中差異表達(dá)的UCR可改變惡性細(xì)胞的功能特征的證據(jù)。
[0025]通過(guò)將這些數(shù)據(jù)與牽涉人腫瘤發(fā)生中的miRNA的精心建立的模型組合，本文還描述了其中編碼和非編碼RNA的改變?cè)趷盒阅[瘤的起始和進(jìn)展中協(xié)同作用的模型。
[0026]在一個(gè)廣泛的方面，本文中描述了區(qū)分人癌癥的方法，其包括使用一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄的超保守區(qū)域(T-UCR)表達(dá)特征譜，其中UCR的基因組定位與分析的癌癥相關(guān)基因組元件之間的相關(guān)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是高度顯著的并且與對(duì)于miRNA所報(bào)導(dǎo)的相關(guān)性相當(dāng)。
[0027]附圖概述
[0028]本專(zhuān)利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)以彩色制成的圖。具有彩色附圖的本專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)案的拷貝將應(yīng)請(qǐng)求且支付必要的費(fèi)用后由Office提供。
[0029]圖1A-1E.不同類(lèi)型的UCR的轉(zhuǎn)錄特征:[0030]圖1A.顯示不同UCR在正常組織中的表達(dá)的Northern印跡。在uc.246 (E)和UC.269A(N)的情況下，長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的存在通過(guò)RACE克隆實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)。對(duì)于一些組織，獲得一式兩份的樣品以確認(rèn)重現(xiàn)性。用U6進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。左側(cè)上的箭頭顯示已鑒定的轉(zhuǎn)錄物。
[0031]圖1B.T-UCR 291和73A的表達(dá)(針對(duì)18S rRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化)通過(guò)在正常⑶5+/CD19+淋巴細(xì)胞和惡性CLL樣品中進(jìn)行qRT-PCR(圖)和微陣列分析(圖下的標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)字)來(lái)驗(yàn)證。對(duì)于qRT-PCR和微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)比較，P-值是顯著的。各框代表對(duì)于正常人(藍(lán)色)和CLL患者(紅色)所測(cè)量的表達(dá)的分布，框的末端界定了第25和第75百分位數(shù)，直線(xiàn)表示中位數(shù)，條棒界定了第10和第90百分位數(shù)。
[0032]圖1C.在19個(gè)組織的I個(gè)或多個(gè)組織中表達(dá)的UCR的數(shù)目，如通過(guò)微陣列分析所顯示的；顯示了 UCR類(lèi)型(E，N，P)的數(shù)目。發(fā)現(xiàn)了 4種類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄:遍在表達(dá)的UCR(在19個(gè)不同組織的18或19個(gè)中)、在大部分組織(10至17個(gè))中表達(dá)的UCR、在少數(shù)組織(2至9個(gè))中表達(dá)的UCR和組織特異性表達(dá)的UCR。
[0033]圖1D.在所有分析的組織中遍在轉(zhuǎn)錄(單向和雙向地)的各UCR類(lèi)型(E、N、P)的百分?jǐn)?shù)；各UCR類(lèi)型的絕對(duì)數(shù)目示于框中。
[0034]圖1E.在來(lái)自3個(gè)不同供體的CD19+B細(xì)胞中有義或反義鏈UCR73、133和269(相對(duì)于18S rRNA)的表達(dá)。有義/反義鏈特異性實(shí)時(shí)RT-PCR用于驗(yàn)證利用微陣列分析觀(guān)察到的UCR的鏈特異性表達(dá)；各圖的下方是CDS+樣品的微陣列結(jié)果的平均值+1-標(biāo)準(zhǔn)差。如下命名微陣列探針:有義基因組探針命名為“ + ”，而針對(duì)互補(bǔ)序列的探針命名為“A+”。
[0035]圖2A-2B.根據(jù)UCR表達(dá)的組織和腫瘤的層次聚類(lèi)(Hierarchical clustering)。使用芯片的非外顯子UCR進(jìn)行的22個(gè)正常人組織(圖2A)和133個(gè)白血病和癌癥(圖2A\B)的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)(Unsupervised cluster)。將組織類(lèi)型(圖2A)或癌癥與白血病(圖2B)良好區(qū)分的一些T-UCR在右邊展開(kāi)。樣品示于列中，T-UCR示于行中。與其在所有樣品中的中位表達(dá)相比，綠色標(biāo)示的基因被下調(diào)，紅色表示被上調(diào)，黃色表示無(wú)變化。組織和腫瘤的完整UCR特征譜可見(jiàn)于圖5和6中。
[0036]圖3A-3E.T-UCR代表miRNA的直接的靶(按出現(xiàn)的順序，分別為SEQ ID N0.1-3、2,4-8 和 2):
[0037]圖3A.互補(bǔ)T-UCR::miRNA的位點(diǎn)的實(shí)例。uc.348::miR-155配對(duì)顯示為互補(bǔ)性水平較低的實(shí)例，與其他4對(duì)相互作用配對(duì)的基因(對(duì)于所述配對(duì)的基因發(fā)現(xiàn)更高水平的互補(bǔ)性)相比較。[0038]圖3Β.通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的miR-155、uc.160和uc.346A在9個(gè)CLL患者中的表達(dá)的關(guān)系。來(lái)自4個(gè)不同個(gè)體的淋巴細(xì)胞用作正常對(duì)照。
[0039]圖3C.直接的miRNA::T-UCR相互作用。針對(duì)轉(zhuǎn)染對(duì)照海腎螢光素酶標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲(chóng)螢光素酶表達(dá)的相對(duì)抑制。pGL-3 (Promega)用作空載體。以一式三份進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)4至 8 次。(n=12-24)。
[0040]圖3D.MEG-Ol細(xì)胞中miR-155轉(zhuǎn)染對(duì)uc.160和uc.346A的表達(dá)水平的作用。在轉(zhuǎn)染后O、24和48小時(shí)時(shí)通過(guò)qRT-PCR測(cè)量作用。
[0041]圖3E.顯示mir-24-l與uc.160以及miR-155與uc.346A的表達(dá)值之間的散點(diǎn)圖。回歸線(xiàn)顯示兩個(gè)基因之間的負(fù)相關(guān)性。相應(yīng)的陣列探針的名稱(chēng)示于Y和X軸。兩種探針都識(shí)別miRNA基因的成熟形式。
[0042]圖4A-4D.T-UCR 73A(P)在結(jié)腸癌細(xì)胞中充當(dāng)癌基因。
[0043]圖4A.不同SiRNA在C0L0-320細(xì)胞中的表達(dá)抑制作用。我們使用來(lái)自Dharmacon的siRNA對(duì)照作為參照值。使用最有效的兩個(gè)siRNA和4個(gè)不同的siRNA的混合物(包括這兩個(gè)最有效的siRNA)。
[0044]圖4B.在C0L0-320結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中使用siRNA_uc73A減少u(mài)c.73A(P)基因表達(dá)的抗增殖作用。所有結(jié)果表示3個(gè)獨(dú)立的一式三份實(shí)驗(yàn)的中位數(shù)。uc.73A(P)表達(dá)的水平通過(guò)RT-PCR來(lái)測(cè)量。兩個(gè)星號(hào)表示P〈0.01的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的作用，而一個(gè)星號(hào)表示P〈0.05的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的作用。
[0045]圖4C.uc.73A(P)的減少的水平(通過(guò)使用不同siRNA)導(dǎo)致增強(qiáng)的C0L0-329細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，如通過(guò)膜聯(lián)蛋白-V染色測(cè)定所顯示的。我們使用來(lái)自Dharmacon的siRNA對(duì)照作為參照值。
[0046]圖4D.不同siRNA對(duì)uc.73A(P)的抑制不影響SW620結(jié)腸癌細(xì)胞的存活。所有結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立的一式三份實(shí)驗(yàn)的中位數(shù)。
[0047]圖5.通過(guò)Northern印跡測(cè)定的人正常和惡性組織中的UCR表達(dá)。顯示正常單核細(xì)胞(MNC)和CLL樣品中uc.192 (N)和uc.246 (E)的表達(dá)。用U6探針進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。左側(cè)的箭頭顯示已鑒定的轉(zhuǎn)錄物。在凝膠圖像下方的是來(lái)自微陣列實(shí)驗(yàn)的CLL和MNC樣品中的UCR的標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)值的平均值；p-值來(lái)自ANOVA統(tǒng)計(jì)。
[0048]圖6.通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的人正常和惡性組織中的UCR表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的⑶5+/⑶19+陽(yáng)性淋巴細(xì)胞和人慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)樣品中的相對(duì)基因表達(dá)。CLL和⑶5+樣品的UCR微陣列值示于圖下方；p-值來(lái)自ANOVA統(tǒng)計(jì)。
[0049]圖7.22個(gè)正常人組織的T-UCR表達(dá)特征譜。組織和UCR的聚類(lèi)顯示正常人組織中獨(dú)特的UCR表達(dá)模式。樣品示于列中，T-UCR示于行中。與其在所有樣品中的中位表達(dá)相比較，綠色標(biāo)示的基因被下調(diào)，紅色表示被上調(diào)，黃色表示無(wú)變化。
[0050]圖8.173個(gè)癌和相應(yīng)的正常組織的T-UCR表達(dá)特征譜。將來(lái)自白血病和正常血細(xì)胞的樣品與上皮來(lái)源的癌和組織分開(kāi)。樣品示于列中，T-UCR示于行中。與其在所有樣品中的中位表達(dá)相比較，綠色標(biāo)示的基因被下調(diào)，紅色表示被上調(diào)，黃色表示無(wú)變化。
[0051]圖9.通過(guò)定量RT-PCR測(cè)定的不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中的uc.73A(P)基因的表達(dá)。正常結(jié)腸中的表達(dá)代表4個(gè)不同樣品的中位數(shù)值。我們使用β肌動(dòng)蛋白來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0052]圖10.在48小時(shí)時(shí)，siRNAl在C0L0-320和Sff-620細(xì)胞中對(duì)uc.73A(P)的抑制。在兩種類(lèi)型的細(xì)胞中都獲得與對(duì)照SiRNA(Dharmacom)相比較相當(dāng)?shù)囊种扑?。盡管如此，只在C0L0-320細(xì)胞中觀(guān)察到生物學(xué)效應(yīng)，其中當(dāng)與正常結(jié)腸中的表達(dá)相比較時(shí)T-UCR過(guò)表達(dá)大約2.5倍。
[0053]圖11.通過(guò)輕微干擾而導(dǎo)致的uc.73A(P)下調(diào)在C0L0-320細(xì)胞但非SW-620細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。利用胱天蛋白酶-3測(cè)定在C0L0-320中獲得的數(shù)據(jù)(上圖)，其中發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞顯著增加，在對(duì)照細(xì)胞SW620中獲得的數(shù)據(jù)(下圖)，其中未發(fā)現(xiàn)差異。C0L0-320表達(dá)高水平的uc.73A(P)，然而在SW620中，表達(dá)與正常結(jié)腸水平相當(dāng)。
[0054]圖12-表1.白血病和癌癥中最顯著差異表達(dá)的UCR。
[0055]圖13-表2.混合效應(yīng)泊松回歸產(chǎn)生UCR與目的區(qū)域的相關(guān)性。
[0056]圖14-表3.其表達(dá)與CLL患者中差異表達(dá)的互補(bǔ)miRNA負(fù)相關(guān)的T-UCR。
[0057]圖15-表4.22個(gè)人正常組織中的T-UCR的表達(dá)(3個(gè)組織是兩份的，來(lái)自2個(gè)不同的個(gè)體)。
[0058]圖16-表 5.通過(guò) ANOVA 分析(P〈0.005)鑒定的(GeneSpring GX 軟件)在 CLL、CRC和HCC中差異表達(dá)的T-UCR。
[0059]圖17-表 6.UCR 的基因組定位與 CAGR 相關(guān)。(如(Bejerano 等，2004) ； (Calin等，2004)中的數(shù)據(jù)庫(kù))。
[0060]圖18-表7.CLL患者中miRNA與T-UCR的表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)性。考慮以0.01的閾值或1%的假陽(yáng)性結(jié)果通過(guò) FDR法驗(yàn)證的所有的負(fù)相關(guān)性(R相關(guān)性低至0.40)。
[0061]實(shí)施方案的描述
[0062]如本文中所用的，“CAGR”包括含有與正常DNA不同的且與癌癥相關(guān)的遺傳或表觀(guān)遺傳變化(或遺傳或表觀(guān)遺傳變化的潛能)的基因組DNA的任何區(qū)域。示例性遺傳變化包括單鏈和雙鏈斷裂(包括在可能的癌基因或腫瘤抑制基因中或其附近的常見(jiàn)斷裂點(diǎn)區(qū)域);染色體異位；DNA中的突變、缺失、插入(包括病毒、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子整合)和擴(kuò)增(包括基因復(fù)制)；暗示存在腫瘤抑制基因的最小雜合性丟失(LOH)區(qū)域；和暗示存在癌基因的最小擴(kuò)增區(qū)域。示例性表觀(guān)遺傳變化包括DNA甲基化模式的任何變化(例如，DNA超甲基化或低甲基化，特別是在啟動(dòng)子區(qū)域中)。
[0063]人基因組中許多已知的miR基因在CAGR中或其附近，包括正好位于與多種癌癥相關(guān)的最小LOH區(qū)域或最小擴(kuò)增區(qū)域中的80個(gè)miR基因。其他miR基因位于斷裂點(diǎn)區(qū)域、缺失區(qū)域或擴(kuò)增區(qū)域中或其附近。
[0064]例如，與CAGR相關(guān)的癌癥包括白血病(例如，AML、CLL、幼淋巴細(xì)胞性白血病(pro-lymphocytic leukemia))、肺癌(例如，小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌)、食管癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、腦癌(例如，星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤(medul1blastoma)、腦膜瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma))、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、上皮癌、鼻咽癌(例如，口或喉鱗狀細(xì)胞癌)、淋巴瘤(例如，濾泡性淋巴瘤)、子宮癌(例如，惡性纖維組織細(xì)胞瘤)、肝癌(例如，肝細(xì)胞癌)、頭頸癌(例如，頭頸鱗狀細(xì)胞癌)、腎癌、雄性生殖細(xì)胞腫瘤、惡性間皮瘤、骨髓增生異常綜合征、卵巢癌、胰腺或膽管癌、前列腺癌、甲狀腺癌(例如，散發(fā)性濾泡性甲狀腺腫瘤(sporadic follicular thyroid tumor))和尿路上皮癌(urothelial cancer)。
[0065]如本文中所用的，“FRA”包括染色體中的任何稀有或普通型脆性位點(diǎn)；例如，可通過(guò)在DNA復(fù)制期間使細(xì)胞經(jīng)歷脅迫誘導(dǎo)的FRA。例如，稀有FRA可通過(guò)在DNA復(fù)制期間使細(xì)胞經(jīng)歷葉酸缺乏來(lái)誘導(dǎo)。普通型FRA可通過(guò)在DNA復(fù)制期間用蚜腸霉素或5-氮雜胞苷處理細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)。染色體脆性位點(diǎn)的鑒定或誘導(dǎo)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)；參見(jiàn)，例如，Arlt 等(2003), Cytogenet.Genome Res.100:92-100 和 Arlt 等(2002), Genes, Chromosomes and Cancer 33:82-92,其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0066]大約20%的已知的人miR基因位于克隆的FRA中(13個(gè)miR)或其3Mb (22個(gè)miR)內(nèi)。實(shí)際上，脆性位點(diǎn)內(nèi)的miR基因的相對(duì)發(fā)生率比非脆性位點(diǎn)中的高9.12倍。此外，在研究人核型中的113個(gè)脆性位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)61個(gè)miR基因位于與FRA相同的染色體條帶中。
[0067]例如，與FRA相關(guān)的癌癥包括膀胱癌、食管癌、肺癌、胃癌癥、腎癌癥、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)、血液腫瘤(hematopoietic tumors)、實(shí)體瘤和白血病。
[0068]下列實(shí)施例用于例證本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，隨后的實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了本
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)施中行之有效的技術(shù)，從而可被認(rèn)為構(gòu)成本發(fā)明實(shí)施的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)當(dāng)理解，可在公開(kāi)的特定實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變并且依然獲得相同或相似的結(jié)果，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
[0069]實(shí)施例1
[0070]基因組范圍的特征譜分析揭示超保守區(qū)(UCR)在正常人組織中的廣泛轉(zhuǎn)錄。
[0071]為了研究UCR在人癌癥中的參與狀況，我們通過(guò)Northern印跡法、定量PCR (qRT-PCR)和微陣列分析了 481個(gè)長(zhǎng)度在200bp以上的基因組區(qū)域(Bejerano等，2004b)。
[0072]外顯子(E)和非外顯子(N)UCR探針在大范圍的長(zhǎng)度上檢測(cè)來(lái)自不同正常組織的轉(zhuǎn)錄物(以有義或反義-A，方向)(圖1A和圖5)。
[0073]兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度通過(guò)克隆cDNA(利用來(lái)自正常人結(jié)腸的外顯子uc.246 (E)和來(lái)自正常人骨髓的非外顯子uc.269A(N)的5'-和3' -RACE)來(lái)確認(rèn)。這兩個(gè)cDNA中均不包含有效長(zhǎng)度的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，從而確認(rèn)它們可能是非蛋白質(zhì)編碼性質(zhì)的。我們稱(chēng)為非編碼超保守基因nc-UCG的此類(lèi)非剪接的全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度是可變的(對(duì)于超保守基因UCG.246為大約0.8kb，對(duì)于超保守基因UCG.269A為大約1.8kb和2.8kb)。
[0074]此類(lèi)nc-UCG的轉(zhuǎn)錄可始于富含多腺嘌呤的基因組區(qū)域，如最近對(duì)來(lái)自小鼠的幾個(gè)長(zhǎng)ncRNA所提及的(Furuno等，2006)。
[0075]我們使用微陣列分析，然后通過(guò)qRT-PCR和Northern印跡確認(rèn)比較了來(lái)自正常和患病組織的幾個(gè)UCR的轉(zhuǎn)錄水平。正常⑶5+/⑶19+淋巴細(xì)胞中uc.291 (P)和uc.73A(P)的表達(dá)顯著高于CLL細(xì)胞中的表達(dá)(P〈0.05)(圖1B)。已在不同的研究中驗(yàn)證了使用該微陣列平臺(tái)獲得的數(shù)據(jù)(Calin 等,2005a; Yanaihara 等,2006; Volinia 等,2006)。
[0076]將獨(dú)立的兩組正常⑶5細(xì)胞包括在微陣列和定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的事件增強(qiáng)了我們的數(shù)據(jù)的說(shuō)服力。當(dāng)在CD5/CD19陽(yáng)性B細(xì)胞和惡性B細(xì)胞的兩個(gè)不同的組中利用qRT-PCR和微陣列來(lái)研究uc.291 (P)和uc.73A(P)時(shí)，由兩種測(cè)定檢測(cè)到的差異表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(圖1B)。[0077]此外，qRT-PCR和Northern印跡(分別11個(gè)和6個(gè)UCR)產(chǎn)生與微陣列結(jié)果一致的結(jié)果(圖5和圖6)。
[0078]通過(guò)使用微陣列分析，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的UCR(在本文中稱(chēng)為T(mén)-UCR)以遍在和組織特異性的方式在正常人組織中表達(dá)(圖1C)。
[0079]大約34%的推定的T-UCR(325/962)在所有19個(gè)組織樣品具有強(qiáng)度高于背景(計(jì)算為空白點(diǎn)的平均信號(hào)+2SD)的雜交信號(hào)。在B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)最大數(shù)目的T-UCR，然而在卵巢中發(fā)現(xiàn)最低數(shù)目。大約93%的UCR(962個(gè)中的890個(gè))在至少一個(gè)樣品中表達(dá)高于背景，從而我們將這些UCR當(dāng)作T-UCR。3種不同類(lèi)型的UCR以相似的頻率轉(zhuǎn)錄:41%的外顯子UCR、33%的可能的外顯子UCR和30%的非外顯子UCR。
[0080]微陣列平臺(tái)以有義和反義方向包含推定的T-UCR。在所有分析的正常組織中，962個(gè)UCR中有84個(gè)(9%)是雙向轉(zhuǎn)錄的，而241個(gè)只從一條鏈轉(zhuǎn)錄(圖1D，圖1E和表4)。
[0081]由于基因組DNA的痕量污染可能妨礙通過(guò)微陣列分析進(jìn)行的雙向轉(zhuǎn)錄的鑒定，因此我們將uc.269 (N)、uc.233 (E)和uc.73 (P)的微陣列結(jié)果與鏈特異性qRT-PCR的結(jié)果相比較。在所有3種情況下，數(shù)據(jù)是一致的，顯示來(lái)自I條鏈的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄(圖1E)。
[0082]要指出的是，在所有19個(gè)組織中表達(dá)的156個(gè)非外顯子T-UCR中，92個(gè)(大約60%)是基因間的，而64個(gè)是基因內(nèi)的。在后者中，與宿主基因相比較，37個(gè)以反義方向存在，這表明大約83%(129/156)的非外顯子T-UCR不代表已知的宿主基因的長(zhǎng)前體轉(zhuǎn)錄物的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄(intronic transcription),但代表真實(shí)的獨(dú)立的非編碼轉(zhuǎn)錄物。
[0083]與miRNA —樣(Liu等，2004)，我們?cè)谠煅M織(由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞代表，各自從兩個(gè)健康個(gè)體收集)和非造血組織中進(jìn)行了 T-UCR表達(dá)的層次聚類(lèi)。將來(lái)自不同個(gè)體的相同類(lèi)型的組織聚類(lèi)為最近鄰(closest neighbor)(圖2A和圖7)。
[0084]這些發(fā)現(xiàn)表明，UCR在大部分情況下代表了正常人組織中的非編碼轉(zhuǎn)錄物，并且這些T-UCR的表達(dá)是組織特異性的。`
[0085]人白血病和癌癥中的獨(dú)特UCR特征
[0086]由于已廣泛地描述了蛋白質(zhì)編碼基因和miRNA在癌細(xì)胞中的大范圍的基因表達(dá)變化(Esquela-Kerscher 和 Slack, 2006; Calin 和 Croce, 2006a; Calin 和 Croce, 2006b; Lu等，2005)，因此我們研究了 UCR在一組173個(gè)樣品(包括133個(gè)人癌癥組織和40個(gè)相應(yīng)的正常組織)中的表達(dá)。
[0087]樣品的層次聚類(lèi)顯示，不同類(lèi)型的癌癥按照它們的發(fā)育來(lái)源產(chǎn)生不同的聚類(lèi):白血病(CLL)和正常造血組織分別從結(jié)腸直腸癌(CRC)和肝細(xì)胞癌(HCC)以及它們的正常對(duì)應(yīng)物分支而來(lái)(圖8);此外，特定類(lèi)型的UCR似乎在腫瘤類(lèi)型中差異表達(dá)(圖2B)。
[0088]因?yàn)椴煌慕M織具有特定的UCR特征，因此該聚類(lèi)模式可以是腫瘤的不同組織特異性來(lái)源的結(jié)果。因此，我們比較了相同來(lái)源的正常和腫瘤細(xì)胞之間的UCR表達(dá)。在962個(gè)可能的T-UCR中，88個(gè)(9.1%)以統(tǒng)計(jì)學(xué)上高度顯著的水平(P〈0.005)在至少一種類(lèi)型的癌癥中差異表達(dá)(表1和表5)。
[0089]我們發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)相比較在癌癥中被下調(diào)和上調(diào)的T-UCR。通過(guò)將各癌癥類(lèi)型與相應(yīng)的正常組織相比較，我們發(fā)現(xiàn)CLL特征由19個(gè)UCR (8個(gè)被上調(diào)和11個(gè)被下調(diào))組成、CRC特征由61個(gè)UCR(59個(gè)被上調(diào)和2個(gè)被下調(diào))組成以及HCC特征由8個(gè)UCR(3個(gè)被上調(diào)和5個(gè)被下調(diào))組成(表5)。[0090]18個(gè)特征轉(zhuǎn)錄物是外顯子UCR (20%)，28個(gè)是可能的外顯子UCR (32%)以及42個(gè)是非外顯子UCR(48%)。在18個(gè)外顯子T-UCR中，9個(gè)代表已知的宿主蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄物的反義方向。從而我們證明了 T-UCR表達(dá)特征譜可用于區(qū)分人癌癥。
[0091]UCR通常位于脆性位點(diǎn)和牽涉癌癥的基因組區(qū)域
[0092]我們將UCR的基因組定位與之前報(bào)導(dǎo)的在人腫瘤中鑒定的非隨機(jī)遺傳改變和如所描述的克隆的脆性位點(diǎn)(FRA)的基因組定位相比較(Calin等，2004b)。我們使用之前報(bào)導(dǎo)的一組186個(gè)miRNA(Calin等，2004b)和一組297個(gè)鋅指蛋白質(zhì)編碼基因(ZNF) (genome,ucsc.edu)(熟知的顯示與癌癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族(Huntley等，2006))。
[0093]我們之前報(bào)導(dǎo)了 miRNA基因通常位于FRA位點(diǎn)、HOX基因簇和牽涉癌癥的基因組區(qū)域例如最小雜合性丟失區(qū)域(LOH)和最小擴(kuò)增區(qū)域(統(tǒng)稱(chēng)為癌癥相關(guān)基因組區(qū)域(CAGR))(Calin 等,2004b)。
[0094]通過(guò)使用高分辨陣列比較基因組雜交(aCGH)，最近的研究確認(rèn)了 miRNA基因座在人癌癥中以高頻率展示基因組改變(Zhang等，2006)。此外，通過(guò)分析NC1-60細(xì)胞系中的miRNA表達(dá)，另一個(gè)小組發(fā)現(xiàn)候選腫瘤抑制基因和致癌miRNA位于CAGR中(Gaur等，2007)。
[0095]在本文中，我們顯示UCR的基因組定位與分析的癌癥相關(guān)基因組元件之間的相關(guān)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是高度顯著的并且與對(duì)于miRNA所報(bào)導(dǎo)的相當(dāng)。ZNF轉(zhuǎn)錄因子未顯示與任何分析的目的區(qū)域的任何顯著相關(guān)性(表2和表6)。
[0096]對(duì)于更小的參與RNA剪接的蛋白質(zhì)編碼基因的家族(80個(gè)基因，數(shù)據(jù)未顯示)相似地不存在相關(guān)性。例如，UCR或miRNA與最小LOH區(qū)域?qū)Ψ侨笔Щ蚪M區(qū)域的相關(guān)性的概率在兩種情況下都低于0.001 (分別地，IRR為2.02和4.08)。我們使用通常存在于FRA位點(diǎn)中的人乳頭狀瘤病毒16(HPV16)整合位點(diǎn)作為內(nèi)部對(duì)照。如果UCR與FRA顯著相關(guān)，那么我們預(yù)期發(fā)現(xiàn)與HPV16整合位點(diǎn)的相關(guān)性。這正好是我們對(duì)于UCR和miRNA而非對(duì)于ZNF蛋白質(zhì)編碼基因(表2)或參與RNA剪接的蛋白質(zhì)編碼基因(數(shù)據(jù)未顯示)所觀(guān)察到的。
[0097]另外的數(shù)據(jù)舉例說(shuō)明了 UCR的基因組定位的重要性。首先，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與所有其他UCR(189個(gè)中的97個(gè)對(duì)292個(gè)中的71個(gè))相比較時(shí)，遍在表達(dá)的T-UCR (圖1C中，在18或19個(gè)正常組織中表達(dá))以明顯更高的頻率位于CAGR中(P〈0.005，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn))。第二，在人癌癥中差異表達(dá)的T-UCR位于與該類(lèi)型的癌癥特異性相關(guān)的CAGR中。例如，染色體區(qū)域13g21.33-g22.2與對(duì)家族性CLL的易感性相關(guān)(Ng等，2007)。在該間隔內(nèi)，在篩選的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的任一個(gè)基因中未發(fā)現(xiàn)突變。
[0098]我們鑒定了位于該CAGR內(nèi)的7個(gè)UCR(uc.347至uc.353)的簇。其中兩個(gè)，uc.349A(P)和uc.352 (N)屬于在正常和惡性B-CLL CD5陽(yáng)性細(xì)胞之間差異表達(dá)的T-UCR。
[0099]這表明，至少在該情況下，不是蛋白質(zhì)編碼基因而是UCR代表了位于CAGR內(nèi)的“未知的”肇事者(culprit)。這些數(shù)據(jù)一起提供了 UCR位于在惡變過(guò)程中發(fā)生改變的基因組區(qū)域內(nèi)的證據(jù)，并且表明T-UCR可能是癌癥易感性的候選基因。
[0100]通過(guò)與HiiciORNA直接相互作用對(duì)T-UCR進(jìn)行的負(fù)調(diào)節(jié)
[0101]為了開(kāi)始功能性表征一些參與人癌癥的UCR，我們?cè)谙嗤M的上面研究的CLL樣品中進(jìn)行了基因組范圍的表達(dá)研究。我們發(fā)現(xiàn)5個(gè)UCR:uc.269A (N)、uc.160 (N)、uc.215 (N)、uc.346A(P)和uc.348 (N)的特征能夠區(qū)分之前通過(guò)70-kDa的zeta相關(guān)蛋白(ZAP-70)的表達(dá)區(qū)別的兩個(gè)主要CLL預(yù)后組群。[0102]這5個(gè)T-UCR在它們的表達(dá)水平上展示了與CLL中報(bào)導(dǎo)的miRNA表達(dá)特征負(fù)相關(guān)的變化(Cahn 等，2005a)(表 3)。
[0103]然而不希望受理論束縛，本
【發(fā)明者】現(xiàn)于本文中認(rèn)為該發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了 miRNA與T-UCR之間的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的可能性。我們通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)UCR中的3個(gè)與13個(gè)特征m i RNA中的5個(gè)具有顯著的反義互補(bǔ)性，從而產(chǎn)生6個(gè)可能的相互作用對(duì):uc.160::rniR-24> uc.160::miR_155、uc.160::miR_223、uc.160::miR_146a、uc.346A::miR-155 和 uc.-348::miR_29b(圖 3A)。
[0104]在所分析的miRNA:: UCR對(duì)中，驗(yàn)證了對(duì)于miRNA:: mRNA相互作用所描述的5'-末端“6堿基種子(base seed)”互補(bǔ)性規(guī)則；此外，3'-末端互補(bǔ)性的水平是可變的:高于60%的互補(bǔ)性(對(duì)于miR-24::ucl60或miR-155::uc.346A對(duì))至低于25%的互補(bǔ)性(對(duì)于miR-155::uc.160對(duì))。作為對(duì)照，當(dāng)比較隨機(jī)產(chǎn)生的5個(gè)UCR與13個(gè)miRNA的組合時(shí)，有義和反義互補(bǔ)性不顯著。
[0105]通過(guò)針對(duì)來(lái)自獨(dú)立組的CLL患者和正常對(duì)照的淋巴細(xì)胞的選擇的T-UCR和miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證特定T-UCR與預(yù)測(cè)的相互作用miRNA (interactor miRNA)的微陣列表達(dá)值之間的負(fù)相關(guān)性(圖3B)。
[0106]我們進(jìn)行了 miRNA::UCR相互作用(牽涉在CLL的攻擊形式(Calin等，2005)、一些淋巴瘤和癌(Eis 等,2005;Kluiver 等,2005;Volinia 等,2006))中過(guò)表達(dá)的 miR-155 以及在來(lái)自CLL患者的原始轉(zhuǎn)錄物中攜帶突變的miR-24-l和miR29_b (Calin等，2005a))的體外測(cè)定。
[0107]我們將UCR uc.160 (N)、uc.346A (P)和uc.348 (N)克隆到螢光素酶報(bào)告基因載體中以評(píng)估與miR-155、m iR-24-l或miR-29-b的可能的直接相互作用。我們對(duì)4個(gè)miR:: T-UCR配對(duì)觀(guān)察到螢光素酶表達(dá)的一致且可重現(xiàn)的減少，與體外發(fā)生的相互作用一致(圖 3C)。
[0108]相比之下，uc.348 (N)不與miR155相互作用(如通過(guò)螢光素酶測(cè)定表明的)，這是與這兩個(gè)基因在CLL患者中的正表達(dá)相關(guān)性和低序列互補(bǔ)性(圖3A)相一致的結(jié)果。
[0109]體內(nèi)相互作用
[0110]為了確定這些相互作用是否在體內(nèi)發(fā)生，我們將miR-155轉(zhuǎn)染入MEGOl白血病細(xì)胞并且估量uc.346A和uc.160 (兩者在該細(xì)胞系中都良好地表達(dá))的水平。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，miR-155顯著減少這兩個(gè)T-UCR的表達(dá)水平；在48小時(shí)后，外源miR-155水平的減少伴隨著T-UCR表達(dá)的增加(圖3D)。
[0111]該可恢復(fù)效應(yīng)支持特異性miRNA對(duì)T-UCR的調(diào)控。由于已證明“ZAP-70特征”的基因的該相互作用，我們研究所有miRNA與T-UCR在所有50個(gè)CLL患者的基因組范圍水平上的表達(dá)之間的相關(guān)性。有趣地，我們發(fā)現(xiàn)87個(gè)miRNA (在點(diǎn)在芯片上的235個(gè)miRNA中，37%)與T-UCR的表達(dá)水平之間的顯著負(fù)相關(guān)(以低于0.01的假檢出率(FDR))(表7)。
[0112]此外，在相關(guān)基因中，我們鑒定了經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明相互作用的miR-24-l::uc.160和miR155::uc346A(P)對(duì)(圖 3E)。
[0113]此外，在實(shí)驗(yàn)中不相互作用的miR-155和uc.348不是該列表的成員。針對(duì)其鑒定到陽(yáng)性螢光素酶測(cè)定的其他可能的相互作用對(duì)是miR-15-a::uc.78和miR16::uc.78(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，非編碼T-UCR代表miRNA的可能的靶，并且此類(lèi)相互作用對(duì)于癌癥患者可具有生物學(xué)和預(yù)后意義。
[0114]T-UCR可充當(dāng)癌基因
[0115]為了擴(kuò)展T-UCR的功能特征，我們?cè)诎┌Y模型中檢查了 uc.73A(P)的生物學(xué)效應(yīng)。由于這是結(jié)腸癌中在統(tǒng)計(jì)學(xué)上最顯著(P〈0.001)上調(diào)的T-UCR之一，我們決定研究其在表達(dá)高水平uc.73A(P)的C0L0-320結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中下調(diào)的作用。我們使用其中該基因的表達(dá)與正常結(jié)腸細(xì)胞無(wú)差別的SW620結(jié)腸癌細(xì)胞作為對(duì)照(圖9)。
[0116]兩個(gè)小干擾RNA(siRNAUPsiRNA3)以及4個(gè)siRNA的混合物(siRNApool)被設(shè)計(jì)為靶向uc.73A(P)并且被轉(zhuǎn)染入C0L0-320和SW620細(xì)胞。在48小時(shí)(圖4A和圖10)、72小時(shí)和144小時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)后在用siRNAl、3和混合物處理的C0L0-320細(xì)胞中uc.73A(P)的表達(dá)顯著減少。對(duì)于SW-620細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果(圖6)。
[0117]C0L0-320細(xì)胞的生長(zhǎng)在用特異性siRNA處理144小時(shí)后與未處理的(空)或siRNA-處理的對(duì)照細(xì)胞相比較顯著降低(P〈0.05，在96小時(shí)時(shí)，和P〈0.005，在144小時(shí)時(shí))(圖 4B)。
[0118]相比之下，SW620對(duì)照細(xì)胞的增殖未發(fā)生顯著變化(在96和144小時(shí)時(shí)，分別地P=0.83和P=0.23)(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)胞周期研究顯示，在C0L0-320細(xì)胞但非SW620細(xì)胞中sub-Gl部分的細(xì)胞增加(表明凋亡細(xì)胞的存在，數(shù)據(jù)未顯示)，該發(fā)現(xiàn)通過(guò)細(xì)胞凋亡特異性膜聯(lián)蛋白V測(cè)定(圖4C和圖4D)和通過(guò)胱天蛋白酶-3測(cè)定(圖11)驗(yàn)證。
[0119]此外，對(duì)細(xì)胞增殖和存活的作用的強(qiáng)度與siRNA產(chǎn)生的抑制的程度成正比(圖4)。
[0120]這些數(shù)據(jù)表明在結(jié)腸直腸癌中，uc.73A(P)如癌基因一樣通過(guò)增加惡性細(xì)胞數(shù)目(作為減少的細(xì)胞凋亡的結(jié)果)來(lái)起作用。
[0121]討論`
[0122]根據(jù)分子腫瘤學(xué)的教導(dǎo)，癌癥是牽涉腫瘤抑制基因和癌基因蛋白的遺傳疾病(Bishop, 1991;Hunter, 1991; Weinberg, 1991)。最近的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地支持 microRNA 參與大多數(shù)分析的癌癥的發(fā)病機(jī)理，并且為人癌癥的分子體系結(jié)構(gòu)(molecular architecture)增加了新的一層復(fù)雜性(Calin 等，2002;Esquela-Kerscher and Slack, 2006;Calin 和Croce，2006a)。然而，MiRNA僅代表特定的一組參與人癌癥的ncRNA。已顯示，在前列腺癌中反義基因內(nèi)ncRNA水平與腫瘤分化的程度相關(guān)(Reis等，2005)并且MALAT-1 ncRNA的表達(dá)預(yù)示早期非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和存活(Ji等，2003)，從而暗示ncRNA與腫瘤生物學(xué)之間的更深層的關(guān)聯(lián)。
[0123]為了明確地闡明該問(wèn)題，我們?cè)诨蚪M水平上研究了全新的ncRNA種類(lèi)，即轉(zhuǎn)錄的非編碼超保守區(qū)(T-UCR)。我們使用生物信息學(xué)工具來(lái)證明UCR位于在惡變過(guò)程中被靶向的基因組區(qū)域中(這預(yù)示著其可能參與人腫瘤發(fā)生)。
[0124]如現(xiàn)在本文中所顯示的，我們能夠通過(guò)RACE擴(kuò)增來(lái)克隆相應(yīng)于uc.246(E)和uc.269A (N)的cDNA，只要UCR是被表達(dá)的并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法克隆的真實(shí)的基因(在本文中稱(chēng)為nc-UCG)。
[0125]各種表達(dá)技術(shù)(包括Northern印跡法、qRT-PCR和基因組范圍的微陣列特征譜分析)證明UCR頻繁轉(zhuǎn)錄并且在人白血病和癌癥中存在獨(dú)特的特征。我們將注意力集中于慢性淋巴細(xì)胞性白血病(西方國(guó)家中最常發(fā)生的成人白血病)(Chiorazzi等,2005)、結(jié)腸直腸癌(工業(yè)化國(guó)家中最常見(jiàn)的癌癥之一)(de la Chapelle，2004)和肝細(xì)胞癌(在美國(guó)增加最快速的癌癥類(lèi)型)(Wilson, 2005)。
[0126]我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于所有檢查的腫瘤類(lèi)型，當(dāng)與相應(yīng)的正常細(xì)胞相比較時(shí)，惡性細(xì)胞具有獨(dú)特的UCR表達(dá)譜，這表明T-UCR表達(dá)中的顯著變化牽涉惡變過(guò)程。
[0127]表征T-UCR的改變?cè)谌税┌Y中的功能意義不是繁瑣的工作?？杉僭O(shè)T-UCR的許多推定的功能，包括對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因或其他非編碼RNA的反義抑制作用，或作為“非特異性(aspecific)”miRNA的作用，意指具有獨(dú)特性的miRNA例如非常長(zhǎng)的前體(例如uc.339 (P)，其具有為通常miRNA的兩倍的前體長(zhǎng)度)。幾個(gè)UCR不像基因一樣起作用并且被發(fā)現(xiàn)具有如增強(qiáng)子一樣的調(diào)控功能(Nobrega等，2003;Pennacchio等，2006),然而其他UCR代表了具有已知/未知癌癥相關(guān)性的蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子的事實(shí)使該難題變得更復(fù)雜。特別有趣的區(qū)域是在大約700kb中含有7個(gè)UCR的DA CHI基因座(Bejerano等，2004b)。來(lái)自該區(qū)域的UCR中的3個(gè)在分析的癌癥中差異表達(dá)，其中兩個(gè)是CLL特征的成員。在小鼠模型中大部分來(lái)自該基因座的經(jīng)掃描的保守區(qū)域是增強(qiáng)子，包括在我們的研究中不在任何分析的組織中表達(dá)的uc.351 (N)。
[0128]有趣地，未能具有增強(qiáng)子功能的僅有的兩個(gè)區(qū)域是uc.348 (N)和uc.352 (N)，兩者都被分類(lèi)為非編碼性的并且兩者在人癌癥中都差異表達(dá)。進(jìn)一步增加對(duì)此類(lèi)特定T-UCR的興趣是由于發(fā)現(xiàn)該基因組區(qū)域與對(duì)家族性CLL的易感性相關(guān)并且已知的蛋白質(zhì)編碼基因中沒(méi)有一個(gè)發(fā)生突變(Ng等，2007)。
[0129]最近發(fā)現(xiàn)，來(lái)自人基因組的非編碼部分的數(shù)十bp的短片段(block)(稱(chēng)為pyknon)存在于幾乎所有已知的蛋白質(zhì)編碼基因內(nèi)(Rigoutsos等，2006)。然而pyknon與UCR不同，含有pyknon數(shù)目最多(4個(gè))的超保守元件是uc.73 (P)，我們發(fā)現(xiàn)其為在CLL和CRC中最差異表達(dá)的T-UCR之一。這些吸引人的觀(guān)察結(jié)果暗示著uc.73 (P)對(duì)具有互補(bǔ)序列的編碼基因的可能的調(diào)控作用。
[0130]通過(guò)進(jìn)一步探索該T-UCR在人癌癥中的參與情況，我們能夠證明uc.73⑵在結(jié)腸癌中的致癌功能，因?yàn)槠溥^(guò)表達(dá)的減少誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡并且特別地在異常表達(dá)該T-UCR的結(jié)腸癌細(xì)胞中具有抗增殖作用。`
[0131]我們的發(fā)現(xiàn):另一種類(lèi)型的ncRNA，T-UCR，在高百分比的分析的白血病和癌癥中在基因組水平上發(fā)生了一致的改變，支持其中編碼和非編碼基因參與人腫瘤發(fā)生并且在其中協(xié)同作用的模型(Calin和Croce, 2006b)。
[0132]此外，CLL患者中UCR與miRNA的表達(dá)之間的相關(guān)性產(chǎn)生了其中兩個(gè)或更多個(gè)類(lèi)型的ncRNA相互作用和影響表型的復(fù)雜功能調(diào)控途徑的吸引人的可能性。
[0133]我們還證明其中兩個(gè)不同類(lèi)型的ncRNA相互作用的miRNA::T-UCR相互作用的存在。
[0134]我們發(fā)現(xiàn)在高百分比的白血病和癌癥中nc-UCG在基因組水平上發(fā)生了一致的改變，并且在白血病中可能與miRNA相互作用。該發(fā)現(xiàn)為其中編碼和非編碼基因參與人腫瘤發(fā)生且在其中協(xié)同作用的模型提供了支持。
[0135]實(shí)施例1
[0136]實(shí)驗(yàn)方法
[0137]A) RACE克隆和通過(guò)微陣列、qRT-PCR和Northern印跡法進(jìn)行的表達(dá)分析
[0138]DRACE 克降[0139]使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增短產(chǎn)物的PCR引物的各種組合來(lái)分析6個(gè)UCR (uc.47 (N)、UC.1lO(N)、uc.192 (N)、uc.246(E)、uc.269A (N)和 uc.352 (N))在大腦、睪丸、骨髓、小腸、結(jié)腸和肝組織中的表達(dá)。此類(lèi)產(chǎn)物包括在微陣列分析中用于探針的40-聚體和全長(zhǎng)大于200bp的UCR序列。通過(guò)在5 ^和:V方向上快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)來(lái)克隆兩個(gè)UCR產(chǎn)物，一個(gè)外顯子uc.246 (E)和一個(gè)非外顯子uc.269A (N)。按照廠(chǎng)商方案(Marathon-readycDNAs, Clontech, Palo Alto, CA)，從其克隆序列的組織來(lái)源是骨髓、白細(xì)胞、胎兒腦和結(jié)腸。
[0140]2)通討微陣列講行的UCR表汰研究
[0141]使用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)從 19 個(gè)正常人組織(Liu 等,2004)和從50個(gè)來(lái)自經(jīng)診斷患有CLL的患者的CLL樣品中提取總RNA。從美國(guó)CLL ResearchConsortium institutions中的所有患者獲得知情同意。如(Calin等，2005a)中所報(bào)導(dǎo)的，使用來(lái)自6個(gè)健康個(gè)體的CDS+B細(xì)胞(4個(gè)不同的樣品，兩個(gè)為來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的健康個(gè)體的混合物)和來(lái)自3個(gè)個(gè)體的單核細(xì)胞(MNC)作為對(duì)照。還從在University ofFerrara, University of Bologna 和 University Tor Vergata, Rome (Italy)收集的 78 個(gè)原發(fā)性結(jié)腸直腸癌、21個(gè)正常結(jié)腸粘膜、9個(gè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌和4個(gè)正常肝提取RNA。按照用于保護(hù)人類(lèi)受試者的制度化指導(dǎo)方針(institutional guideline),所有樣品都在書(shū)面知情同意的情況下獲得。
[0142]利用如(soe.ucsc.edu/_jill/ultra)中的總共481個(gè)人UCR序列開(kāi)發(fā)微陣列芯片。對(duì)于每一個(gè)UCR，設(shè)計(jì)兩個(gè)40聚體的探針，一個(gè)相應(yīng)于有義基因組序列(稱(chēng)為“ + ”)，另一個(gè)相應(yīng)于互補(bǔ)序列(稱(chēng)為“A+” )。設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如(Liu等，2004)所述。將每一個(gè)寡聚物以一式兩份印制在兩個(gè)不同的載玻片位置，從而可獲得一式四份的數(shù)值用于分析。數(shù)千個(gè)(3484)空白點(diǎn)用于背景扣除。如在其他地方(Liu等，2004; Calin等，2004a)所詳述的，進(jìn)行RNA提取和微陣列實(shí)驗(yàn)(由UCR微陣列裝配、靶的制備和陣列雜交組成)。
[0143]簡(jiǎn)而言之，使用隨機(jī)六聚物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄用生物素標(biāo)記5μ g來(lái)自各組織樣品的RNA。在我們的第二版miRNA-芯片(ArrayExpress目錄號(hào):A_MEXP_258)上進(jìn)行雜交，所述芯片含有962個(gè)UCR探針、238個(gè)用于`成熟miRNA的探針和143個(gè)用于前體miRNA的探針。以一式兩份將各寡聚物印制在兩個(gè)不同的載玻片位置。使用GenePix 4000B掃描儀(AxonInstruments),利用鏈霉抗生物素-Alexa647綴合物(單色信號(hào))的生物素結(jié)合檢測(cè)雜交信號(hào)。使用GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments)對(duì)圖像進(jìn)行定量。
[0144]在GeneSpringGX7.3 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)中對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和分析。22個(gè)組織樣品的表達(dá)數(shù)據(jù)使用Bioconductor中的Lowess功能(Limmapackage)來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,然后使用GeneSpring標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)確定中位數(shù)；用于測(cè)定UCR表達(dá)水平的閾值計(jì)算為空白點(diǎn)的平均值+2SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。使用GeneSpring軟件的on-chip和on-gene中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)對(duì)腫瘤進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用平均連鎖(average linkage)和皮爾森相關(guān)性(Pearson correlation)作為相似性的量度來(lái)進(jìn)行層次聚類(lèi)。通過(guò)對(duì)倍數(shù)變化進(jìn)行過(guò)濾，然后使用GeneSpring軟件的ANOVA (方差分析)統(tǒng)計(jì)以及Benjamin和Hochberg校正(以減少假陽(yáng)性)來(lái)進(jìn)行腫瘤和正常組織的統(tǒng)計(jì)比較。將對(duì)倍數(shù)變化的過(guò)濾設(shè)定為1.2，因?yàn)橐延糜谑褂孟嗤酒治龅膍icroRNA的該閾值[參見(jiàn)例如(Cahn等，2005a; Cimmino等，2005; 1rio等，2005)]經(jīng)證明反映真實(shí)的生物學(xué)差異。通過(guò)將ANOVA結(jié)果與SAM(微陣列的顯著性分析)和PAM(微陣列的預(yù)測(cè)分析)分析組合來(lái)鑒定在CLL患者之間差異表達(dá)的T-UCR(其按照70-kDa的zeta相關(guān)蛋白(ZAP-70)的表達(dá)分組)。將它們的表達(dá)與microRNA的表達(dá)(Calin等,2005a)相比較。使用MIAMExpress將所有數(shù)據(jù)提交至ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)，并且可使用登錄號(hào)E-TABM-184檢索所述數(shù)據(jù)。
[0145]3) UCR 的定量 RT-PCR。
[0146]定量RT-PCR是我們用于確認(rèn)微陣列結(jié)果的第一方法。我們利用qRT-PCR在不同的樣品組合(包括15至17個(gè)從50個(gè)樣品的陣列組隨機(jī)選擇的CLL樣品和各種正常CD19+/CD5+B細(xì)胞以及B和T淋巴細(xì)胞對(duì)照)中驗(yàn)證了 11個(gè)UCR (包括uc.73(P)/73A(P)、uc.135 (E)、uc.160 (N)、uc.233 (E) /233A (E)、uc.269 (N) /269A (N)、uc.289 (N)、uc.291 (P)和uc.346A(P))的微陣列數(shù)據(jù)。未用于微陣列研究的另外一組3個(gè)正常⑶19+/⑶5+陽(yáng)性B細(xì)胞購(gòu)自AllCells (Berkeley, CA)，并且用作獨(dú)立的確認(rèn)組。在所有情況下，qRT-PCR數(shù)據(jù)確認(rèn)了微陣列數(shù)據(jù)。使用無(wú)RNA酶的DNA酶I處理RNA，然后使用隨機(jī)引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。為了確定有義或反義UCR轉(zhuǎn)錄物是否被表達(dá)，使用Thermoscript RT和基因特異性(即有義或反義)引物反轉(zhuǎn)錄總RNA。RT條件如(Schmittgen等，2004)所描述的。使用實(shí)時(shí)PCR和SYBR green檢測(cè),利用經(jīng)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增與微陣列上的寡核苷酸探針相同的40bp的區(qū)域的PCR引物擴(kuò)增cDNA。使用公式2" dcT,其中dCT=(CTUCR-CT18s rRNA)，來(lái)測(cè)定每一個(gè)UCR相對(duì)于18S rRNA的相對(duì)量。將相對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)乘以106以簡(jiǎn)化表述。
[0147]4) T-UCR 的 Northern 印跡分析
[0148]我們通過(guò)Northern 印跡法分析了 5 個(gè) UCR:uc.110 (N)、uc.192 (N)、uc.246 (E)、uc.269A(N)和uc.352 (N)，然后通過(guò)RACE實(shí)驗(yàn)克隆其中兩個(gè)。對(duì)于第6個(gè)UCR，uc.47 (N)，未顯示數(shù)據(jù)。將總RNA在15%PAA-尿素凝膠上進(jìn)行電泳(Calin等，2002)。RNA來(lái)源包括一式二份或一式三份的11個(gè)正`常組織(乳腺、肝、肺、腎和胰腺)(購(gòu)自Ambion和Clontech)和實(shí)驗(yàn)室中制備的4個(gè)正常MNC樣品和16個(gè)CLL樣品。由于這代表通過(guò)Northern印跡法進(jìn)行的對(duì)UCR表達(dá)的研究，因而我們使用來(lái)自相同組織的多個(gè)樣品來(lái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。探針經(jīng)設(shè)計(jì)與芯片上的寡核苷酸同一，以檢測(cè)與微陣列相同的轉(zhuǎn)錄物，如(Calin等，2002)所描述的進(jìn)行雜交。
[0149]B)數(shù)據(jù)庫(kù)和統(tǒng)計(jì)分析
[0150]I)用于基因組定位的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0151]用于本文中報(bào)導(dǎo)的所有研究的UCR數(shù)據(jù)庫(kù)如(Bejerano等，2004b)所公布的。我們將我們的分析限制于481個(gè)長(zhǎng)度在200個(gè)堿基對(duì)(bp)以上的區(qū)段。脆性位點(diǎn)(FRA)數(shù)據(jù)庫(kù)和癌癥相關(guān)基因組區(qū)域(CAGR)的數(shù)據(jù)庫(kù)如之前(Cain等，2004b)所公布的。
[0152]2)基因組定位的統(tǒng)計(jì)分析。
[0153]為了檢測(cè)超保守區(qū)域(UCR)的發(fā)生與脆性位點(diǎn)、癌癥中被擴(kuò)增的區(qū)域和癌癥中的缺失區(qū)域相關(guān)的假設(shè)，我們使用隨機(jī)效應(yīng)Poisson和負(fù)二項(xiàng)回歸模型。在這些模型下，“事件”被定義為UCR的數(shù)目，暴露“時(shí)間”(即脆性位點(diǎn)對(duì)非脆性位點(diǎn))定義為目的區(qū)域的非交疊長(zhǎng)度。區(qū)域的“長(zhǎng)度”是確切的(如果已知的話(huà))，或估計(jì)為IMb (如果未知的話(huà))。例如，對(duì)于各染色體，計(jì)算所有非交疊脆性位點(diǎn)的總長(zhǎng)度，并且將其用作脆性位點(diǎn)的暴露時(shí)間。然后我們計(jì)數(shù)各染色體的脆性位點(diǎn)內(nèi)發(fā)生的UCR的數(shù)目。各染色體的剩余長(zhǎng)度(總Mb-脆性位點(diǎn)Mb)假定是非脆性的，并且假定各染色體中的剩余UCR在非脆性區(qū)域發(fā)生。然后對(duì)于各區(qū)域，擬合備選的隨機(jī)效應(yīng)模型，零膨脹泊松和零膨脹負(fù)二項(xiàng)模型，在這三個(gè)模型中，使用 Akaike' s Information Criteria(基于對(duì)數(shù)似然(log likelihood)和參數(shù)的數(shù)目)選擇最佳模型。該相同方法用于分析來(lái)自鋅指蛋白的表達(dá)的數(shù)據(jù)。對(duì)于具有UCR的脆性位點(diǎn)和具有鋅指蛋白的L0H，最佳擬合模型是零膨脹負(fù)二項(xiàng)模型。對(duì)于所有其他情況，報(bào)導(dǎo)了 Poisson模型。當(dāng)具有零事件的分類(lèi)的數(shù)目大于對(duì)于泊松分布預(yù)期的時(shí)，零膨脹負(fù)二項(xiàng)模型是優(yōu)選的。當(dāng)事件的總數(shù)對(duì)于區(qū)域太少時(shí)，模型似然(model likelihood)不能收斂，結(jié)果未報(bào)導(dǎo)。泊松、零膨脹泊松和零膨脹負(fù)二項(xiàng)回歸模型中的隨機(jī)效應(yīng)是單個(gè)染色體，因?yàn)槿旧w內(nèi)的數(shù)據(jù)被假定是相關(guān)的。各模型中的固定效應(yīng)由待比較的區(qū)域類(lèi)型的指示變量(indicator variable)組成。我們報(bào)導(dǎo)了發(fā)生率比(IRR)、發(fā)生率比的兩側(cè)95%置信區(qū)間和兩側(cè)P值(用于檢驗(yàn)發(fā)生率比為1.0的假設(shè))。IRR顯著大于I表示區(qū)域內(nèi)UCR的數(shù)目的增加高于偶然事件所預(yù)期的。
[0154]使用兩個(gè)獨(dú)立比例的差異的漸近檢驗(yàn)來(lái)比較miRNA和鋅指蛋白的聚簇的比例，其中我們報(bào)導(dǎo)了差異、差異的95%的置信區(qū)間和P值。要指出的是，當(dāng)與microRNA相比較時(shí)，基因的ZNF轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型顯示顯著更低的聚簇(聚簇定義為至少兩個(gè)相同種類(lèi)的基因在小于50kb基因組距離上的定位)(32%，95/297聚簇的ZNF基因?qū)?8%，90/186聚簇的miRNA,差異=16.4%, 95%CI=(7.5%, 25.2%)，Ρ〈0.001)。使用 STATA ν7.0 和 StatXact v7.0 進(jìn)行所有計(jì)算。
[0155]3) UCR和miRNA的微陣列表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析。
[0156]在實(shí)施例1I和本文的數(shù)據(jù)中提供了詳細(xì)描述。簡(jiǎn)而言之，輸入數(shù)據(jù)由一列T-UCR和一列miRNA( “種子”)以及相應(yīng)的表達(dá)值的矩陣組成。我們計(jì)算r，各對(duì)(miR，UC)基因的斯皮爾曼秩相關(guān)系數(shù)；即，我們估計(jì)相關(guān)性檢驗(yàn)的P-值，并且選擇其相關(guān)性值在給定的剔除值(value of rejecti on)上是顯著的基因。如果進(jìn)行大量的相關(guān)性檢驗(yàn),則通過(guò)使用假檢出率(FDR)修正多重檢驗(yàn)的P值，如(Benjamini和Hochberg, 1995)中所述。這樣，P值控制高于真實(shí)空檢驗(yàn)(truly null test)數(shù)目的假陽(yáng)性數(shù)目，而FDR控制高于顯著檢驗(yàn)數(shù)目的假陽(yáng)性數(shù)目。
[0157]C)功能研究
[0158]I)通過(guò)與microRNA盲接相互作用講行的UCR下調(diào)。
[0159]使用螢光素酶終止密碼子的緊鄰下游的XbaI位點(diǎn)將uc.160，uc.346A和uc.348的基因組序列克隆入PGL3-對(duì)照載體(Clontech)。如ATCC所推薦的，培養(yǎng)人巨核細(xì)胞MEG-01和宮頸癌HeLa細(xì)胞系。按照廠(chǎng)商的方案使用siPORT neoFX (Ambion)，用0.4 μ g螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因載體和0.08 μ g含有海腎螢光素酶的對(duì)照載體PRL-TK(Promega)在12孔板中共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)于每一個(gè)孔，使用IOnM miRNA-有義前體和混雜的寡核苷酸(Ambion)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用雙螢光素酶測(cè)定(Promega)連續(xù)測(cè)量螢火蟲(chóng)和海腎螢光素酶活性。以一式三份進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行4至6天不等的天數(shù)(n=12至18)。
[0160]使用實(shí)時(shí)PCR分析超保守RNA和成熟miRNA的表達(dá)。如上所述，利用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定UCR RNA的表達(dá)。如所描述的(Chen等，2005)，使用針對(duì)miR-155的TaqMan環(huán)狀引物測(cè)定(Applied Biosystems)分析成熟miRNA的表達(dá)。成熟miRNA的表達(dá)表示為2_dCT,其中dCT=CTmiRNA-CTI ss rRNA);將數(shù)據(jù)乘以106以簡(jiǎn)化表述。[0161]關(guān)于患者的相關(guān)性，使用一組13個(gè)樣品(包括9個(gè)CLL患者和4個(gè)正常淋巴細(xì)胞樣品)，如本文中所述分析miR-155、uc.346A和uc.160的水平。為了在MEGOl中鑒定miR-155轉(zhuǎn)染的“體內(nèi)”效應(yīng)，在使用Lipofectamine試劑用pre_miRNA155 (Ambion)轉(zhuǎn)染后0、24和48小時(shí)，如所描述的利用qRT-PCR測(cè)量uc.346A和uc.160的水平。
[0162]2)uc.73A(P)抑制對(duì)癌細(xì)胞增殖的作用。
[0163]通過(guò)使用Dharmacon 算法(Dharmacon siDESIGN(harmacon.com/sidesign))輸入U(xiǎn)CR的完整序列來(lái)設(shè)計(jì)針對(duì)uc.73A(P)的siRNA。檢測(cè)8個(gè)最高等級(jí)的靶序列。在轉(zhuǎn)染后48、72和144小時(shí)，利用半定量RT-PCR評(píng)估性能。使用最有效的兩個(gè)siRNA和4個(gè)不同siRNA (包括這兩個(gè))的混合物。我們稱(chēng)這些siRNA為siRNAl、siRNA3和siRNApool。對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定，將人結(jié)腸癌細(xì)胞系C0L0-320和SW620培養(yǎng)于補(bǔ)充有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)染前一天將IxlO4個(gè)細(xì)胞鋪板在96孔板中。按照廠(chǎng)商的方案，通過(guò)使用Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),以 200nM 的終濃度用 siRNA-uc.73A (P)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將 siCONTROL 非祀向性 siRNA 混合物(Dharmacon Research, LaFayette, CO, USA)用作陰性對(duì)照。每隔一天(在第48小時(shí)和96小時(shí))在相同的條件下重復(fù)轉(zhuǎn)染。為了評(píng)估細(xì)胞數(shù)目，使用 CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (PromegaU.S.，Madison, WI, USA)。使用 ELISA 酶標(biāo)儀(plate reader) (Spectra MAX, MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA)測(cè)量在490nm處的吸光率,分別在第0、48、96和144小時(shí)時(shí)進(jìn)行讀數(shù)。對(duì)于各處理以一式三份進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定3次。使用t檢驗(yàn)計(jì)算相對(duì)于時(shí)間O在不同時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞數(shù)目之間的統(tǒng)計(jì)差異。[0164]對(duì)于細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡測(cè)定，將細(xì)胞以6xl05個(gè)細(xì)胞/孔鋪板在6孔板中。第二天然后每48小時(shí)，用200nM siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。收集細(xì)胞，將其固定在冷的70%乙醇中，進(jìn)行至少 30 分鐘。在第 48,96 和 144 小時(shí)時(shí)在 50 μ g/mL PI (Sigma Aldrich, St.Louis, MO)和 5ig/mL 無(wú) DNA 酶 RNA 酶(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)的 PBS 溶液中進(jìn)行碘化丙啶(PI)染色。按照廠(chǎng)商的方法，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)和使用PE-綴合的單克隆活性胱天蛋白酶-3抗體細(xì)胞凋亡試劑盒(BD Biosciences)在第O和144小時(shí)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凋亡染色，然后使用FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)獲取數(shù)據(jù)。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 3 次。
[0165]本研究中所述的克隆的T-UCR的GeneBank登錄號(hào)如下:DQ644536 (UCG.246)、DQ644537 (UCG.269A,短的形式)和 DQ644538 (UCG.269A,長(zhǎng)的形式)。
[0166]實(shí)施例1I
[0167]實(shí)驗(yàn)方法
[0168]UCR與miRNA的微陣列表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)分析。
[0169]輸入數(shù)據(jù)由一列UCG和一列miRNA( “種子”)以及相應(yīng)的表達(dá)值矩陣組成。我們計(jì)算r，各對(duì)(miR，UCR)基因的斯皮爾曼秩相關(guān)系數(shù)，基于秩評(píng)定的數(shù)據(jù)趨勢(shì)相關(guān)性的非參數(shù)量度；即，我們?cè)u(píng)估相關(guān)性檢驗(yàn)的P-值，并且選擇其相關(guān)性值在給定的剔除值上是顯著的基因。通過(guò)假定相關(guān)性值使用學(xué)生氏t累積分布進(jìn)行分布，來(lái)進(jìn)行P值的評(píng)估，自由度的數(shù)目相應(yīng)于微陣列實(shí)驗(yàn)中樣品的數(shù)目。P值測(cè)量單個(gè)相關(guān)性(在幾對(duì)基因間)的“良好性”，從而，以了解真實(shí)的相關(guān)性是偶然產(chǎn)生的還是代表生物學(xué)上重要的信息，我們選擇重排列的方法，對(duì)每一行(miR或UCR)改變樣品的順序，以不同的改變的樣品順序計(jì)算基因?qū)?miR, UCR)之間的相關(guān)性。我們重復(fù)樣品的重排列并計(jì)算相關(guān)性100次，這樣，每一個(gè)真實(shí)的相關(guān)性具有100個(gè)隨機(jī)相關(guān)性用于比較。通過(guò)使用所有(100*n° MIR*n° UC)隨機(jī)相關(guān)性和真實(shí)相關(guān)性，我們基于隨機(jī)相關(guān)性秩評(píng)定和真實(shí)相關(guān)性的位置計(jì)算P值。
[0170]如果進(jìn)行大量的相關(guān)性檢驗(yàn)，則通過(guò)使用假檢出率(FDR)修正多重檢驗(yàn)的P值，如(Benjamini和Hochberg, 1995)中所述。這樣,P值控制高于真實(shí)空檢驗(yàn)數(shù)目的假陽(yáng)性數(shù)目，而FDR控制高于顯著檢驗(yàn)數(shù)目的假陽(yáng)性數(shù)目。已提出幾種估計(jì)該數(shù)目的方法，我們采用由Tom Nichols (參見(jiàn) fro1.sourceforge.net/documents/technical/matlab/FDR)設(shè)計(jì)的角軍決方法，所述方法通過(guò)將單個(gè)檢驗(yàn)獲得的P值乘以與所進(jìn)行的檢驗(yàn)的總數(shù)相關(guān)的指數(shù)的組合來(lái)重新調(diào)整該P(yáng)值。逐個(gè)種子地進(jìn)行修正，意指種子列表中的基因被認(rèn)為是獨(dú)立的檢驗(yàn)。該統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的廢物過(guò)濾(tripe filtering)允許祀向提取候選基因的入圍名單,從而節(jié)約用于進(jìn)行隨后的昂貴且耗時(shí)的遺傳分析的資源。
[0171]為了建立miR-24-l與uc.160表達(dá)值之間的散點(diǎn)圖，我們使用MatLab函數(shù)ROBUSTFIT繪制回歸線(xiàn)，以解釋這兩個(gè)基因之間的負(fù)相關(guān)性的假設(shè)。注意，只有11.67%(7/60)的點(diǎn)(表達(dá)值的對(duì))是離群值。
[0172]實(shí)施例1II
[0173]另外的實(shí)施例和信息
[0174]如本文中所用的，miR和UCR可互換使用；以非限定性方式包括:“miR基因產(chǎn)物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”是指來(lái)自miR基因的未經(jīng)加工的(例如，前體)或已加工的(例如，成熟)RNA轉(zhuǎn)錄物。
[0175]使用UCR(miRNA)進(jìn)行的診斷
[0176]在一個(gè)方面，本文`中提供了診斷受試者是否患有癌癥或處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一種UCR的水平和將測(cè)試樣品中該miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。如本文中所用的，“受試者”可以是患有或懷疑患有癌癥的任何哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是患有或懷疑患有癌癥的人。
[0177]可在從受試者獲得的生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可通過(guò)常規(guī)的活組織檢查技術(shù)從懷疑患有癌癥相關(guān)疾病的受試者中取出組織樣品(例如，來(lái)自腫瘤)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從受試者中取出血液樣品，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離血細(xì)胞(例如，白細(xì)胞)以用于DNA提取。優(yōu)選在開(kāi)始放射療法、化學(xué)療法或其他療法之前從受試者獲得血液或組織樣品?？蓮氖茉囌叩奈词苡绊懙慕M織、從正常人個(gè)體或正常個(gè)體的群體或從相應(yīng)于受試者的樣品的大部分細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞獲得相應(yīng)的對(duì)照組織或血液樣品。然后將對(duì)照組織或血液樣品與來(lái)自受試者的樣品一起進(jìn)行處理，以便可將從受試者的樣品的細(xì)胞中給定的miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來(lái)自對(duì)照樣品的細(xì)胞的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平進(jìn)行比較。生物樣品的參照miR表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)也可用作對(duì)照。
[0178]與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，從受試者獲得的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變(例如，增加或減少)表示受試者中存在癌癥相關(guān)疾病。
[0179]在一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平高于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)來(lái)自受試者的細(xì)胞或組織樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”。
[0180]在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平低于對(duì)照樣品中相應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“下調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)從來(lái)自受試者的細(xì)胞或組織樣品中的該基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量低于從對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中的相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因的表達(dá)“下調(diào)”。
[0181]可根據(jù)一個(gè)或多個(gè)RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)確定對(duì)照和正常樣品中相對(duì)miR基因表達(dá)。所述標(biāo)準(zhǔn)可包括例如OmiR基因表達(dá)水平、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR基因表達(dá)水平、受試者的未受影響的組織中miR基因的表達(dá)水平或之前獲得的正常人對(duì)照的群體的miR基因表達(dá)的平均水平。
[0182]可使用適合用于檢測(cè)生物樣品中RNA表達(dá)水平的任何技術(shù)測(cè)量樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。用于測(cè)定生物樣品(例如,細(xì)胞、組織)中的RNA表達(dá)水平的合適技術(shù)(例如，Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。在特定的實(shí)施方案中，使用Northern印跡分析檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如,可通過(guò)在核酸提取緩沖液存在的情況下進(jìn)行勻漿，接著進(jìn)行離心來(lái)從細(xì)胞純化總的細(xì)胞RNA。沉淀核酸，然后通過(guò)用DNA酶處理和沉淀來(lái)除去DNA。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在瓊脂糖凝膠上通過(guò)凝膠電泳分離RNA分子，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾器。然后通過(guò)加熱將RNA固定在濾器上。使用適當(dāng)標(biāo)記的與所述RNA互補(bǔ)的DNA或RNA探針進(jìn)行特定RNA的檢測(cè)和定量。參見(jiàn)，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等人，eds.，第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989, Chapter7,其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0183]用于給定的miR基因產(chǎn)物的Northern印跡雜交的合適的探針可根據(jù)核酸序列產(chǎn)生，其包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物具有至少大約70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%或完全的互補(bǔ)性的探針。用于制備標(biāo)記的DNA和RNA探針的方法以及用于其與祀核苷酸序列的雜交的條件描述于Molecular Cloning:ALaboratory Manual, J.Sambrook 等人,eds.,第 2 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989, Chapters 10和11，其`公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0184]在一個(gè)非限定性實(shí)例中，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、14C或35S ;重金屬；能夠用作已標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合對(duì)成員的配體(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗體)；熒光分子；化學(xué)發(fā)光分子；酶等來(lái)標(biāo)記核酸探針。
[0185]可通過(guò)Rigby 等人(1977)，J.Mol.Biol.113:237-251 的切口平移法(nicktranslation method)或 Fienberg 等人(1983)，Anal.Biochem.132:6-13 的隨機(jī)引物法(其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)將探針標(biāo)記至高比放射性(specific activity)。后者是選擇用于從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的方法。例如，按照切口平移法通過(guò)用高放射性的核苷酸置換預(yù)先存在的核苷酸，可能制備具有大大超過(guò)IO8Cpm/微克的比放射性的32P-標(biāo)記的核酸探針。然后可通過(guò)將雜交濾器暴露于照相膠片來(lái)進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測(cè)。暴露于雜交濾器的照相膠片的光密度掃描提供了 miR基因轉(zhuǎn)錄物水平的精確測(cè)量。使用另一個(gè)方法，可通過(guò)計(jì)算機(jī)化的成像系統(tǒng)例如可從AmershamBiosciences, Piscataway, N.T獲得的Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager 定量miR基因轉(zhuǎn)錄物水平。
[0186]當(dāng)不能進(jìn)行DNA或RNA探針的放射性核素標(biāo)記時(shí)，可使用隨機(jī)引物法將類(lèi)似物例如dTTP類(lèi)似物5- (N- (N-生物素基-ε -氨基己酰基)_3_氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸摻入探針?lè)肿?。可通過(guò)與偶聯(lián)至熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶的結(jié)合生物素的蛋白質(zhì)例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和抗體(例如抗生物素抗體)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)生物素化的探針寡核苷酸。
[0187]除了 Northern和其他RNA雜交技術(shù)外,可使用原位雜交技術(shù)來(lái)測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄物的水平。該技術(shù)需要比Northern印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，其包括將整個(gè)細(xì)胞置于顯微鏡蓋玻片上和用含有放射性標(biāo)記的或另外標(biāo)記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測(cè)細(xì)胞的核酸含量。該技術(shù)特別適合用于分析來(lái)自受試者的組織活檢樣品。原位雜交技術(shù)的實(shí)施在美國(guó)專(zhuān)利5，427，916 (其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。
[0188]在一個(gè)非限定性實(shí)例中，用于給定的miR基因產(chǎn)物的原位雜交的合適的探針可從核酸序列產(chǎn)生。并且包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物具有至少大約70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%或完全的互補(bǔ)性的探針，如上所述的。
[0189]細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)數(shù)目還可通過(guò)對(duì)miR基因轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物(RT-PCR)來(lái)進(jìn)行測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)例如來(lái)自存在于相同樣品中的“持家”基因的mRNA的水平相比較來(lái)定量miR基因轉(zhuǎn)錄物的水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的合適的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。用于進(jìn)行定量和半定量RT-PCR的方法和其變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。
[0190]在一些情況下，可能期望同時(shí)測(cè)定樣品中多個(gè)不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在其他情況下，可能期望測(cè)定與癌癥關(guān)聯(lián)的所有已知miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估數(shù)百種miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平非常費(fèi)時(shí)并且需要大量的總RNA(例如，對(duì)于每一個(gè)Northern印跡需要至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。
[0191]為了克服這些限制，可構(gòu)建以微芯片形式(即，微陣列)存在的寡核苷酸文庫(kù)(oligolibrary),該文庫(kù)包含`特異于一組miR基因的一組寡核苷酸(例如,寡脫氧核苷酸)探針。使用該微陣列，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，且將它們與微陣列上的探針寡核苷酸雜交以產(chǎn)生雜交特征譜或表達(dá)特征譜來(lái)測(cè)定生物樣品中多個(gè)microRNA的表達(dá)水平。然后將受試樣品的雜交特征譜與對(duì)照樣品的雜交特征譜比較，從而確定在癌細(xì)胞中具有改變的表達(dá)水平的microRNA。
[0192]如本文中所使用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”是指能夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸?！鞍泄押塑账帷被颉鞍泄衙撗鹾塑账帷笔侵复龣z測(cè)(例如，通過(guò)雜交)的分子?！癿iR-特異性探針寡核苷酸”或“特異于miR的探針寡核苷酸”是指具有選擇用于與特定miR基因產(chǎn)物或特定miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。
[0193]特定樣品的“表達(dá)特征譜”或“雜交特征譜”本質(zhì)上是樣品的狀態(tài)指紋；雖然兩種狀態(tài)可能具有相似表達(dá)的任何特定基因，但同時(shí)評(píng)價(jià)大量基因允許產(chǎn)生對(duì)于細(xì)胞的狀態(tài)是獨(dú)特的基因表達(dá)特征譜。即，正常組織可與癌(例如，腫瘤)組織相區(qū)別，并且在癌組織中，可確定不同的預(yù)后狀態(tài)(例如，良好的或不良的長(zhǎng)期存活希望)。通過(guò)比較不同狀態(tài)中癌組織的表達(dá)特征譜，獲得關(guān)于哪個(gè)基因在這些狀態(tài)的各狀態(tài)中是很重要(包括基因的上調(diào)和下調(diào))的信息。在癌組織中差異表達(dá)的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá)的鑒定允許以許多方法使用該信息。[0194]在一個(gè)非限定性實(shí)例中，可評(píng)估特定的治療方案(例如，以確定化療藥物是否改善特定患者的長(zhǎng)期預(yù)后)。類(lèi)似地，可通過(guò)將患者樣品與已知的表達(dá)特征譜比較來(lái)進(jìn)行或確認(rèn)診斷。此外，這些基因表達(dá)特征譜(或個(gè)體基因)允許篩選抑制癌癥表達(dá)特征譜或?qū)⒉涣碱A(yù)后特征譜轉(zhuǎn)變成更好的預(yù)后特征譜的藥物候選物。
[0195]因此，本文中還提供了診斷受試者是否患有癌癥或處于發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，該方法包括逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交特征譜，和將受試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品或參照標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的雜交特征譜比較，其中至少一種miRNA的信號(hào)的改變表示受試者患有癌癥或處于發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0196]在一個(gè)實(shí)施方案中，微陣列包含大部分所有已知的人miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，微陣列包含一種或多種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。
[0197]可利用基因特異性寡核苷酸探針(所述探針從已知的miRNA序列產(chǎn)生)制備微陣列。對(duì)于各miRNA，陣列可包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種探針包含活性成熟序列，而另一種探針特異于miRNA的前體。陣列還可包含可用作雜交嚴(yán)格性條件的對(duì)照的對(duì)照，例如與人直系同源物只相異于少數(shù)幾個(gè)堿基的一個(gè)或多個(gè)小鼠序列。還可將來(lái)自?xún)蓚€(gè)物種的tRNA或其他RNA(例如，rRNA.mRNA)印制在微芯片上，從而為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對(duì)穩(wěn)定的陽(yáng)性對(duì)照。還可將用于非特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)合適的對(duì)照包含在微芯片上。為了該目的，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性選擇序列。
[0198]可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)制備微陣列。例如，在位置C6上對(duì)合適長(zhǎng)度例如40個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行5'-胺修飾，并且使用可商購(gòu)獲得的微陣列系統(tǒng)例如GeneMachine OmniGrid? 1 00 Microarrayer 和 Amersham CodeLink? 活化的載玻片進(jìn)行印制。通過(guò)用標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來(lái)制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡聚物。在第一鏈合成后，使RNA/DNA雜交物變性以降解RNA模板。然后將所制備的標(biāo)記的靶cDNA在雜交條件(例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中進(jìn)行18小時(shí)，然后在37°C下于0.75X TNT (TrisHCl/NaCl/Tween20)中清洗40分鐘)下與微陣列芯片雜交。在陣列上的其中固定的探針DNA識(shí)別樣品中的互補(bǔ)靶cDNA的位置上，發(fā)生雜交。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記陣列上的其中發(fā)生結(jié)合的確切位置，從而允許自動(dòng)檢測(cè)和定量。輸出信號(hào)由一列雜交事件組成，其標(biāo)示了特定cDNA序列的相對(duì)豐度，從而標(biāo)示了患者樣品中相應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對(duì)豐度。
[0199]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記的cDNA寡聚物是從生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過(guò)使用例如鏈霉抗生物素蛋白_Alexa647綴合物直接檢測(cè)包含生物素的轉(zhuǎn)錄物來(lái)處理微陣列，和使用常規(guī)掃描方法掃描微陣列。陣列上的各點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中相應(yīng)的miR的豐度成比例。
[0200]使用陣列對(duì)于miRNA表達(dá)的檢測(cè)具有幾個(gè)有利方面。第一，可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上鑒定相同樣品中的數(shù)百個(gè)基因的整體表達(dá)。第二，通過(guò)寡核苷酸探針的仔細(xì)設(shè)計(jì)，可鑒定成熟分子和前體分子的表達(dá)。第三，與Northern印跡分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用2.5yg總RNA可提供可重現(xiàn)的結(jié)果。數(shù)目相對(duì)有限的miRNA (每物種數(shù)百個(gè))允許對(duì)數(shù)個(gè)物種構(gòu)建共同的微陣列，其中對(duì)每一物種使用不同的寡核苷酸探針。這樣的工具允許分析各已知的miR在不同條件下的跨物種表達(dá)。[0201]除了用于特定miR的定量表達(dá)水平測(cè)定外，包含相應(yīng)于miRNome的大部分(優(yōu)選整個(gè)miRNome)的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于進(jìn)行miR基因表達(dá)特征譜分析，以分析miR的表達(dá)模式?？墒共煌膍iR特征與已建立的疾病標(biāo)志物關(guān)聯(lián)或直接與疾病狀態(tài)關(guān)聯(lián)。
[0202]按照本文中描述的表達(dá)特征譜分析法，對(duì)來(lái)自懷疑患有癌癥相關(guān)疾病的受試者的樣品的總RNA進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄以提供一組與樣品中的RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的靶寡脫氧核苷酸。然后將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供樣品的雜交特征譜。結(jié)果是顯示樣品中miRNA的表達(dá)模式的樣品的雜交特征譜。雜交特征譜包括來(lái)自靶寡脫氧核苷酸(其來(lái)自樣品)與微陣列中的miRNA-特異性探針寡核苷酸結(jié)合的信號(hào)。所述特征譜可記錄為結(jié)合的存在或不存在(信號(hào)對(duì)O信號(hào))。
[0203]更優(yōu)選地，記錄的特征譜包括來(lái)自各雜交的信號(hào)的強(qiáng)度。將所述特征譜與從正常的(即非癌的)對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較。信號(hào)的改變表示受試者中存在癌癥或發(fā)生癌癥的傾向。
[0204]用于測(cè)量miR基因表達(dá)的其他技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，并且包括用于測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄和降解的速率的各種技術(shù)。
[0205]本文中還提供了測(cè)定患有癌癥的受試者的預(yù)后的方法，該方法包括測(cè)量受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，所述水平與癌癥相關(guān)疾病的特定預(yù)后(例如，良好或積極的預(yù)后，不良或不利的預(yù)后)相關(guān)。
[0206]根據(jù)這些方法，與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較，測(cè)試樣品中與特定預(yù)后相關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的改變表明受試者患有具有特定預(yù)后的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物與不利的(即，不良的)預(yù)后相關(guān)。不利預(yù)后的實(shí)例包括但不限于低存活率和快速疾病發(fā)展。在某些實(shí)施方案中，這樣測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，即通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將該靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸`的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交特征譜，然后將受試樣品的雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較來(lái)進(jìn)行測(cè)量。
[0207]不希望受任何理論束縛，據(jù)信，細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物水平的改變可導(dǎo)致這些miR的一種或多種預(yù)期的靶失調(diào)，這可導(dǎo)致癌癥形成。因此，改變miR基因產(chǎn)物水平(例如，通過(guò)減少在癌細(xì)胞中被上調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平，通過(guò)增加在癌細(xì)胞中被下調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平)可成功地治療癌癥。
[0208]因此，本文中還提供了抑制受試者中的腫瘤發(fā)生的方法，所述受試者患有或懷疑患有癌癥，其中至少一種miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中失調(diào)(例如，下調(diào)，上調(diào))。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物(例如，miR-29家族)在癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，方法包括施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，或其分離的變體或生物活性片段，以便在受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖。
[0209]例如，當(dāng)miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí),對(duì)受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可抑制癌細(xì)胞的增殖。對(duì)受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物可與在癌細(xì)胞中被下調(diào)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物(例如，miR基因產(chǎn)物)相同或其可以是其變體或生物活性片段。
[0210]如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的“變體”是指與相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有低于100%的同一性并且具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性的miRNA。這樣的生物活性的實(shí)例包括但不限于靶RNA分子的表達(dá)的抑制(例如，抑制靶RNA分子的翻譯，調(diào)節(jié)靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工)和與癌癥相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程(例如，細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡)的抑制。此類(lèi)變體包括物種變體和其為miR基因中一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換、缺失、插入)的結(jié)果的變體。在某些實(shí)施方案中，變體與相應(yīng)的野生型miR 基因產(chǎn)物至少大約 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 或 99% 的同一。
[0211]如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的“生物活性片段”是指miR基因產(chǎn)物的RNA片段，其具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)生物活性。如上所述，此類(lèi)生物活性的實(shí)例包括但不限于靶RNA分子的表達(dá)的抑制和與癌癥相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程的抑制。在某些實(shí)施方案中，生物活性片段的長(zhǎng)度是至少大約5、7、10、12、15或17個(gè)核苷酸。
[0212]在特定的實(shí)施方案中，可將分離的miR基因產(chǎn)物與一種或多種另外的抗癌療法組合來(lái)對(duì)受試者施用。適當(dāng)?shù)目拱┋煼òǖ幌抻诨瘜W(xué)療法、放射療法和其組合(例如，放化療(chemoradiation))。
[0213]當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被上調(diào)時(shí)，方法包括對(duì)受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物(在本文中稱(chēng)為miR基因表達(dá)-抑制化合物)，以便癌細(xì)胞的增殖被抑制。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR表達(dá)-抑制化合物特異于選自miR29家族的miR基因產(chǎn)物(包括miR_29a、miR_29b、miR-29c和其組合)。
[0214]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”、“醫(yī)治”和“療法”是指改善與疾病或病況例如癌癥相關(guān)的癥狀，包括預(yù)防或延遲疾病癥狀的發(fā)作，和/或減少疾病或病況的癥狀的嚴(yán)重性或頻率。術(shù)語(yǔ)“受試者”、“患者”和“個(gè)體”在本文中定義為包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他?？?、羊科、馬科、犬科、貓科、嚙齒目或鼠科物種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。
[0215]如本文中所使用的，分離的miR基因產(chǎn)物的“有效量”是足以在患有癌癥的受試者中抑制癌細(xì)胞增殖的量。通過(guò)考慮因素例如受試者的大小和體重；疾病侵入的程度；受試者的年齡、健康和性別；施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對(duì)給定的受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。
[0216]例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量。腫瘤塊的大致重量可通過(guò)計(jì)算腫瘤塊的大致體積來(lái)測(cè)定，其中I立方厘米的體積大約等于I克。基于腫瘤塊的重量的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可在大約10至500微克/克腫瘤塊的范圍之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，腫瘤塊可以是至少大約10微克/克腫瘤塊，至少大約60微克/克腫瘤塊或至少大約100微克/克腫瘤塊。
[0217]分離的miR基因產(chǎn)物的有效量還可基于待治療的受試者的大致或估計(jì)的體重。優(yōu)選，如本文中所描述的，胃腸外或腸內(nèi)施用這樣的有效量。例如，對(duì)受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可在大約5至大約3000微克/kg的體重，大約700至1000微克/kg的體重的范圍內(nèi)，或大于大約1000微克/kg的體重。
[0218]本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對(duì)給定的受試者施用分離的miR基因產(chǎn)物的合適的給藥方案。例如，可對(duì)受試者施用一次(例如，作為單次注射或沉積(deposition))miR基因產(chǎn)物?？蛇x擇地，可以每天I次或2次對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行大約3至大約28天,特別地大約7至大約10天的時(shí)期。在特定的給藥方案中，每天I次施用miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行7天。當(dāng)給藥方案包括多次施用時(shí)，應(yīng)理解，對(duì)受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量可包括在整個(gè)給藥方案期間施用的基因產(chǎn)物的總量。
[0219]如本文中使用的，“分離的” miR基因產(chǎn)物是合成的或通過(guò)人工介入從天然狀態(tài)改變或取出的miR基因產(chǎn)物。例如，合成的miR基因產(chǎn)物，或部分或完全從其天然狀態(tài)的共存材料分離的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以以大體上純化的形式存在，或可以存在于已將所述miR基因產(chǎn)物遞送入其中的細(xì)胞中。因此，有意地被遞送至細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是“分離的”分子。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，本文所描述的分離的miR基因產(chǎn)物可用于制造用于治療受試者(例如，人)中的癌癥的藥物。
[0220]分離的miR基因產(chǎn)物可使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成RNA分子或合成試劑的提供商包括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, U.S.A.) > Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, U.S.A.) >Glen Research (Sterling, VA, U.S.A.)、ChemGenes (Ashland, MA, U.S.A.)和Cruachem(Glasgow, UK)。
[0221]可選擇地，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組環(huán)形或線(xiàn)性DNA質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適的啟動(dòng)子包括例如U6或Hl RNA pol III啟動(dòng)子序列或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或可調(diào)控的啟動(dòng)子。
[0222]可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。還可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞并且在其中直接表達(dá)。下面更詳細(xì)地論述重組質(zhì)粒將miR基因產(chǎn)物遞送`至癌細(xì)胞的用途。
[0223]miR基因產(chǎn)物可從分開(kāi)的重組質(zhì)粒表達(dá)，或它們可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后通過(guò)合適的加工系統(tǒng)(包括但不限于癌細(xì)胞中現(xiàn)有的加工系統(tǒng))將該前體分子加工成功能性miR基因產(chǎn)物。其他合適的加工系統(tǒng)包括例如體外果蠅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)(例如，如屬于Tuschl等人的美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)2002/0086356中所描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)和大腸桿菌RNA酶III系統(tǒng)(例如，如屬于Yang等人的美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0014113中所描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)。
[0224]適合用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇、用于將核酸序列插入質(zhì)粒以表達(dá)基因產(chǎn)物的方法以及將重組質(zhì)粒遞送至目的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。參見(jiàn)，例如，Zeng 等(2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat.Biotechnol，20:446-448;Brummelkamp 等(2002), Science 296:550-553;Miyagishi 等(2002), Nat.Biotechnol.20:497-500;Paddison等(2002), Genes Dev.16:948-958;Lee等(2002), Nat.Biotechnol.20:500-505;和 Paul 等(2002), Nat.Biotechnol.20:505-508,其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0225]在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV立即早期啟動(dòng)子(intermediate-early promoter)控制下編碼miR前體RNA的序列。如本文中所使用的，“在啟動(dòng)子的控制下”是指編碼miR基因產(chǎn)物的核酸序列位于啟動(dòng)子的3'端，以便啟動(dòng)子可起始miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
[0226]miR基因產(chǎn)物還可從重組病毒載體表達(dá)。預(yù)期miR基因產(chǎn)物可從兩個(gè)分開(kāi)的重組病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病毒載體表達(dá)的RNA或所述RNA可在癌細(xì)胞中直接表達(dá)。下面更詳細(xì)地論述重組病毒載體將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
[0227]本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RNA序列的任何合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括但不限于U6或Hl RNA pol III啟動(dòng)子序列，或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載體還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或可調(diào)控的啟動(dòng)子。
[0228]可使用能夠接受miR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如，來(lái)源于腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(LV)、彈狀病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體?？赏ㄟ^(guò)用來(lái)自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化載體或通過(guò)置換不同的病毒衣殼蛋白(如果合適)來(lái)改變病毒載體的趨向性。
[0229]例如，可用來(lái)自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本發(fā)明的慢病毒載體?？赏ㄟ^(guò)對(duì)載體進(jìn)行工程改造以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來(lái)制備本發(fā)明的AAV載體，使之靶向不同的細(xì)胞。例如，在血清型2型基因組上表達(dá)血清型2型衣殼的AAV載體稱(chēng)為AAV2/2。AAV2/2載體中的該血清型2型衣殼基因可用血清型5型衣殼基因替換，從而產(chǎn)生AAV2/5載體。用于構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)；參見(jiàn)，例如，Rabinowitz，J.E.，等(2002)，J.Virol.76:791-801，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0230]適合用于本發(fā)明 的重組病毒載體的選擇、用于將用于表達(dá)RNA的核酸序列插入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法和表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi) ο 參見(jiàn)，例如,Dornburg (1995), Gene Therap.2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques6:608-614; MiIIer (1990), Hum.Gene Therap.1:5-14;和 Anderson (1998), Nature392:25-30,其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0231]特別合適的病毒載體是來(lái)源于A(yíng)V和AAV的載體。用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適的AV載體、用于構(gòu)建重組AV載體的方法以及用于將載體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20:1006-1010，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適的AAV載體、用于構(gòu)建重組AAV載體的方法以及用于將載體遞送至革巴細(xì)胞的方法描述于 Samulski 等(1987), J.Virol.61:3096-3101;Fisher 等(1996), J.Virol, 70:520-532; Samulski 等(1989), J.Virol.63:3822-3826;美國(guó)專(zhuān)利 5，252，479;美國(guó)專(zhuān)利5，139,941;國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/13788;和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/24641，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含CMV立即早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。
[0232]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包含在人U6RNA啟動(dòng)子控制下的與polyT終止序列有效連接的編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“與polyT終止序列有效連接”是指編碼有義或反義鏈的核酸序列以5'方向與polyT終止信號(hào)緊密鄰接。在從載體轉(zhuǎn)錄miR序列的過(guò)程中，polyT終止信號(hào)用于終止轉(zhuǎn)錄。
[0233]在本發(fā)明的治療方法的其他實(shí)施方案中，可對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表達(dá)”是指治療后miR基因產(chǎn)物的前體和/或活性成熟形式的產(chǎn)量低于治療前產(chǎn)生的量。通過(guò)使用例如上述用于診斷方法的測(cè)定miR轉(zhuǎn)錄物水平的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定miR的表達(dá)在癌細(xì)胞中是否已被抑制。抑制可在基因表達(dá)的水平上(即，通過(guò)抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或在加工的水平上(例如，通過(guò)抑制miR前體至成熟的活性miR的加工)發(fā)生。
[0234]如本文中所使用的，抑制miR表達(dá)的化合物的“有效量”是足以在患有癌癥(例如，癌癥)的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖的量。通過(guò)考慮因素，例如受試者的大小和體重；疾病侵入的程度；受試者的年齡、健康和性別；施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對(duì)給定的受試者施用的miR表達(dá)抑制化合物的有效量。
[0235]例如，表達(dá)抑制化合物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量，如本文中所描述的。抑制miR表達(dá)的化合物的有效量還可基于待治療的受試者的大致的或估計(jì)的體重，如本文中所描述的。
[0236]本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對(duì)給定的受試者施用抑制miR表達(dá)的化合物的適當(dāng)?shù)慕o藥方案。
[0237]用于抑制miR基因表達(dá)的合適的化合物包括雙鏈RNA (例如短或小干擾RNA或“siRNA”)、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這些化合物中的每一種可被靶向給定的miR基因產(chǎn)物并且干擾靶miR基 因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，抑制其翻譯，誘導(dǎo)其切割或破壞)。
[0238]例如，給定的miR基因的表達(dá)可通過(guò)用分離的雙鏈RNA (“dsRNA”)分子誘導(dǎo)miR基因的RNA干擾來(lái)抑制，所述雙鏈RNA分子與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90%、例如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定的實(shí)施方案中，dsRNA分子是“短或小干擾RNA”或“siRNA”。
[0239]用于本方法的siRNA包括長(zhǎng)度大約17個(gè)核苷酸至大約29個(gè)核苷酸、優(yōu)選長(zhǎng)度大約19至大約25個(gè)核苷酸的短雙鏈RNA。siRNA包含通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick堿基配對(duì)相互作用(在下文中稱(chēng)為“堿基配對(duì)”)退火在一起的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包含與祀miR基因產(chǎn)物內(nèi)包含的核酸序列大體上同一的核酸序列。
[0240]如本文中所使用的，siRNA中與靶mRNA內(nèi)包含的靶序列“大體上同一”的核酸序列是與靶序列同一的核酸序列或與靶序列相異于I或2個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的有義和反義鏈可包括兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子或可包括其中兩個(gè)互補(bǔ)部分堿基配對(duì)并且通過(guò)單鏈“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”區(qū)域共價(jià)連接的單個(gè)分子。
[0241]siRNA還可以是與天然存在的RNA相異于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變的經(jīng)改變的RNA。這樣的改變可包括非核苷酸材料的添加(例如至siRNA的末端或至siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸的添加)，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修飾或用脫氧核糖核苷酸對(duì)siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。
[0242]siRNA的一條或兩條鏈還可包含:V懸突。如本文中所用的，“3,懸突”是指從雙鏈RNA鏈的3'-末端延伸的至少一個(gè)未配對(duì)的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，siRNA包含至少一個(gè)長(zhǎng)度為I至大約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)、長(zhǎng)度為I至大約5個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為I至大約4個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為大約2至大約4個(gè)核苷酸的3'懸突。在特定的實(shí)施方案中，3'懸突存在于siRNA的兩條鏈上，且其長(zhǎng)度為2個(gè)核苷酸。例如，siRNA的各條鏈可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3^懸突。
[0243]siRNA可通過(guò)化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文對(duì)分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于屬于Gewirtz的美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)2002/0173478和屬于Reich等人的美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0018176，兩者的全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0244]給定的miR基因的表達(dá)還可通過(guò)反義核酸抑制。如本文中所使用的，“反義核酸”是指通過(guò)RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變靶RNA的活性。適合用于本方法的反義核酸是通常包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸(PNA))。反義核酸可包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)或95-100%互補(bǔ)的核酸序列。
[0245]不希望受任何理論束縛，據(jù)信，反義核酸激活RNA酶H或降解miR基因產(chǎn)物/反義核酸雙鏈體的另一種細(xì)胞核酸酶。
[0246]反義核酸還可包含對(duì)核酸主鏈或?qū)μ呛蛪A基部分(或它們的等價(jià)物)的修飾，從而增加靶特異性、核酸酶抗性、遞送或與分子的功效相關(guān)的其他性質(zhì)。此類(lèi)修飾包括膽固醇部分、雙鏈體嵌入劑例如吖啶或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。
[0247]反義核酸可通過(guò)化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文對(duì)分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測(cè)的示例性方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi);參見(jiàn)，例如，Ste in和Cheng (1993), Science 261:1004以及屬于Woolf等人的美國(guó)專(zhuān)利5，849，902，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0248]給定的miR基因的表達(dá)還可通過(guò)酶促核酸(enzymatic nucleic acid)抑制。如本文中所使用的“酶促核酸”是指包含與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列具有互補(bǔ)性的底物結(jié)合區(qū)并且能夠特異性切割miR基因產(chǎn)物的核酸。酶促核酸底物結(jié)合區(qū)可以例如與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)或95-100%互補(bǔ)。酶促核酸還可包括在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)上的修飾。
[0249]用于本方法的示例性酶促核酸包括從頭甲基轉(zhuǎn)移酶包括DNMT3A和DNMT3B，如本文中的實(shí)施例中所描述的。
[0250]酶促核酸可通過(guò)化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文對(duì)分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995), Nucl.Acids Res.23:2092-96; Hammann 等人(1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9:25-31;以及屬于Cech等人的美國(guó)專(zhuān)利4，987，071，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0251]至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一種用于抑制miR表達(dá)的化合物的施用將在患有癌癥的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖。
[0252]如本文中所使用的，“抑制癌細(xì)胞的增殖”是指殺死細(xì)胞或永久性或暫時(shí)地阻止或減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目在施用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物后保持恒定或減少，那么可推斷癌細(xì)胞增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加但腫瘤生長(zhǎng)的速度下降，則也可推斷癌細(xì)胞增殖被抑制。
[0253]受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞數(shù)目可通過(guò)直接測(cè)量或通過(guò)對(duì)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤塊的大小的估計(jì)來(lái)確定。例如，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目可通過(guò)免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)或經(jīng)設(shè)計(jì)用于檢測(cè)癌細(xì)胞的特征表面標(biāo)志物的其他技術(shù)來(lái)測(cè)量。
[0254]腫瘤塊的大小可通過(guò)直接目測(cè)觀(guān)察或通過(guò)診斷成像法例如X射線(xiàn)、磁共振成像、超聲和閃爍造影術(shù)(scintigraphy)來(lái)測(cè)定?？稍谑褂迷煊皠┗虿皇褂迷煊皠┑那闆r下使用用于測(cè)定腫瘤塊的大小的診斷成像法，這在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。腫瘤塊的大小還可通過(guò)物理方法例如組織塊的觸診或利用測(cè)量?jī)x器例如測(cè)徑器測(cè)量組織塊來(lái)測(cè)定。
[0255]可通過(guò)適合用于將此類(lèi)化合物遞送至受試者的癌細(xì)胞的任何方法來(lái)對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。例如，可通過(guò)適合于用此類(lèi)化合物或用包含編碼此類(lèi)化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法來(lái)施用miR基因產(chǎn)物或miR表達(dá)抑制化合物。
[0256]在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0257]用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括例如核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或前核(pronucleus)的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或由親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的核酸遞送、基因槍或微粒加速、磷酸鈣沉淀以及由病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
[0258]例如，細(xì)胞可用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)移化合物例如D0TAP(N-[1_(2，3-二油酰氧基)丙基]_N, N, N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或等價(jià)物例如LIP0FECTIN進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用的核酸的量對(duì)于實(shí)施本發(fā)明不是至關(guān)重要的；可接受的結(jié)果可用0.1-100微克核酸/IO5個(gè)細(xì)胞來(lái)獲得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大約0.5微克質(zhì)粒載體/IO5個(gè)細(xì)胞的比例。
`[0259]還可通過(guò)任何合適的腸內(nèi)或胃腸外施用途徑對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)施用途徑包括例如口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的胃腸外施用途徑包括例如血管內(nèi)施用(例如，靜脈內(nèi)團(tuán)注(bolus injection)、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)團(tuán)注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和至脈管系統(tǒng)內(nèi)的導(dǎo)管滴注)；組織外周(per1-tissue)和組織內(nèi)注射(例如，腫瘤外周和腫瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如通過(guò)滲透泵)；對(duì)目的組織的直接施用，例如通過(guò)導(dǎo)管或其他安置裝置(例如，視網(wǎng)膜丸劑(retinal pellet)或栓劑或包含多孔的、無(wú)孔的或凝膠狀材料的植入物)；以及吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注和直接注射入腫瘤。
[0260]在本方法中，miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物可以以裸露的RNA形式、與遞送試劑一起或以包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物的序列的核酸(例如，重組質(zhì)?；虿《据d體)的形式對(duì)受試者進(jìn)行施用。合適的遞送試劑包括例如Mirus Transit TKO 親脂試劑、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚陽(yáng)離子(例如,多聚賴(lài)氨酸)和脂質(zhì)體。
[0261 ] 含有表達(dá)miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體以及用于將此類(lèi)質(zhì)粒和載體遞送至癌細(xì)胞的技術(shù)在本文中進(jìn)行了論述和/或在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。
[0262]在特定的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體用于將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受試者。脂質(zhì)體還可增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)通常包括中性的或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常通過(guò)考慮因素例如期望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期來(lái)進(jìn)行指導(dǎo)。已知許多用于制備脂質(zhì)體的方法，例如如 Szoka 等人(1980), Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467;和美國(guó)專(zhuān)利 4, 235, 871、4，501, 728,4, 837，028和5，019, 369 (其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)中所描述的方法。
[0263]用于本方法的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。結(jié)合在癌細(xì)胞中普遍的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。
[0264]用于本方法的脂質(zhì)體還可進(jìn)行修飾以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(“RES”)清除。此類(lèi)經(jīng)修飾的脂質(zhì)體在表面具有調(diào)理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用-抑制部分和配體。
[0265]用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用-抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的巨大的親水聚合物。如本文中所使用的，調(diào)理作用-抑制部分，當(dāng)其通過(guò)化學(xué)或物理方式(例如通過(guò)將脂溶性錨嵌入膜本身或通過(guò)與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合)附著至膜時(shí)，與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。此類(lèi)抑制調(diào)理作用的親水聚合物形成了顯著減少脂質(zhì)體被MMS和RES吸收的保護(hù)性表面層；例如，如美國(guó)專(zhuān)利4，920，016中所描述的，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0266]適合于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有大約500至大約40，000道爾頓，更優(yōu)選大約2，000至大約20，000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類(lèi)聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍`生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線(xiàn)性的、分支的或樹(shù)枝狀聚酰胺-胺(polyamidoamine);聚丙烯酸；多元醇,例如與羧基或氨基化學(xué)連接的聚木糖醇和聚乙烯醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GMl。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合適的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物還可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、褐藻酸、角叉菜膠(carrageenan);胺化的多糖或低聚糖(線(xiàn)性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例如與碳酸的衍生物反應(yīng)從而與羧基連接的多糖或低聚糖。優(yōu)選，調(diào)理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱(chēng)為“PEG化的脂質(zhì)體”。
[0267]可通過(guò)許多熟知的技術(shù)中的任一種將調(diào)理作用抑制部分結(jié)合至脂質(zhì)體膜。例如，可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)可溶性錨結(jié)合，然后再與膜結(jié)合。類(lèi)似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(例如以30:12比例的四氫呋喃和水)在60°C下通過(guò)還原胺化作用，用硬脂酰胺脂質(zhì)可溶性錨衍生葡聚糖(dextran)聚合物。
[0268]用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保持更長(zhǎng)時(shí)間。因此，此類(lèi)脂質(zhì)體有時(shí)稱(chēng)為“隱形(stealth)”脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體在通過(guò)多孔或“滲漏”微脈管系統(tǒng)供養(yǎng)的組織中積累。因此，由此類(lèi)微脈管系統(tǒng)缺陷表征的組織例如腫瘤將有效地積累這些脂質(zhì)體；參見(jiàn) Gabizon 等(1988), Proc.Natl.Acad.Sc1., U.S.A., 18:6949-53。此外，減少的通過(guò)RES的吸收通過(guò)阻止脂質(zhì)體在肝和脾中的大量積累來(lái)降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適合用于將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細(xì)胞。
[0269]可在對(duì)受試者施用前，按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物配制為藥物組合物，有時(shí)稱(chēng)為“藥劑”。因此，本發(fā)明包括用于治療癌癥的藥物組合物。
[0270]在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物相應(yīng)于在癌細(xì)胞中，相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞具有減少的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物。
[0271]在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR表達(dá)抑制化合物。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因表達(dá)抑制化合物對(duì)于miR基因(所述miR基因的表達(dá)在癌細(xì)胞中比在對(duì)照細(xì)胞中高)是特異性的。
[0272]本發(fā)明的藥物組合物的特征在于至少是無(wú)菌的且無(wú)熱原的。如本文中所用的，“藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，例如如Remington' s Pharmaceutical Science,第17版，MackPublishing Company, Easton, Pa.(1985)中所描述的,其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。
[0273]本藥物組合物包含至少一種與藥學(xué)上可接受的載體混合的miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)(例如，按重量計(jì)算0.1至90%)，或其生理學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物額外包含一種或多種抗癌劑(例如，化學(xué)治療劑)。本發(fā)明的藥物制劑還可包含至少一種被脂質(zhì)體封裝的miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方 案中，藥物組合物包含為miR29a、miR-29b和miR-29c的一種或多種的miR基因或基因產(chǎn)物。
[0274]特別適合的藥學(xué)上可接受的載體是水、緩沖的水、生理鹽水、0.4%的鹽水、0.3%的
甘氨酸、透明質(zhì)酸等。
[0275]在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抗核酸酶降解的miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)。
[0276]本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)在Y -位置上進(jìn)行修飾的核糖核苷酸摻入miR基因產(chǎn)物來(lái)容易地合成抗核酸酶的核酸。適當(dāng)?shù)?'-修飾的核糖核苷酸包括在2，-位置上用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修飾的核糖核苷酸。
[0277]藥物組合物
[0278]本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑(osmolality adjusting agent)、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括例如生理上生物相容性緩沖劑(例如，氨丁三醇鹽酸鹽)、螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合絡(luò)合物(例如，DTPA鈣、CaNaDTPA-雙酰胺)的添加，或任選地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。本發(fā)明的藥物組合物可以以液體形式包裝使用或可以進(jìn)行凍干。[0279]對(duì)于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)無(wú)毒性的固體的藥學(xué)上可接受的載體:例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。
[0280]例如，用于口服施用的固體藥物組合物可包含上文所列的任何載體和賦形劑以及10-95%，優(yōu)選25%-75%的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可包含封裝在上文所述的脂質(zhì)體中的按重量計(jì)算0.01-20%，優(yōu)選1%-10%的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和噴射劑。需要時(shí)還可包含載體例如卵磷脂以用于鼻內(nèi)遞送。
[0281]本發(fā)明的藥物組合物還可包含一種或多種抗癌劑。在特定的實(shí)施方案中，組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)和至少一種化學(xué)治療劑。適合于本發(fā)明的方法的化學(xué)治療劑包括但不限于DNA-烷化劑、抗腫瘤抗生素劑、抗代謝劑(ant1-metabolic agent)、微管蛋白穩(wěn)定劑、微管蛋白去穩(wěn)定劑、激素拮抗劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、CDK抑制劑、細(xì)胞周期蛋白抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、反義核酸、三鏈螺旋DNA、核酸適體和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素劑(exotoxic agent)。用于本發(fā)明的組合物的適當(dāng)?shù)脑噭┑膶?shí)例包括但不限于阿糖胞苷(cytidine arabinoside)、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷(VP-16)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、順鉬(O)DP)、地塞米松、arglabin、環(huán)磷酰胺、溶肉瘤素(sarcolysin)、甲基亞硝脲、氟尿嘧唳、5-氟尿嘧唳(5FU)、長(zhǎng)春堿、喜樹(shù)堿、放線(xiàn)菌素D、絲裂霉素C、過(guò)氧化氫、奧沙利鉬、伊立替康、托泊替康、亞葉酸、卡莫司汀、鏈佐星、CPT-11、紫杉醇、它莫西芬、達(dá)卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶(arabinofuranosylcytosine)、伊馬替尼、氟達(dá)拉濱、多西他賽、F0LF0X4。
[0282]腫瘤發(fā)生的抑制劑
[0283]本文中還提供了鑒定腫瘤發(fā)生抑制劑的方法，所述方法包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量至少一種在癌細(xì)胞中具有減少的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物的水平。在提供試劑后，相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞(例如，未提供試劑)，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物的水平的增加表示測(cè)試試劑是腫瘤發(fā)生的抑制劑。
[0284]在其他實(shí)施方案中，方法包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑和測(cè)量至少一種在癌細(xì)胞中具有增加的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物的水平。在提供試劑后，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞(例如，未提供試劑)相比較，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的減少表示測(cè)試試劑是腫瘤發(fā)生的抑制劑。在特定的實(shí)施方案中，至少一種在癌細(xì)胞中具有增加的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR-29b、miR-29c 和其組合。
[0285]適當(dāng)?shù)脑噭┌ǖ幌抻谒幬?例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸)。試劑可重組產(chǎn)生、合成產(chǎn)生，或其可從天然來(lái)源分離(即，純化)。用于給細(xì)胞提供此類(lèi)試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，且下文中描述了幾種這樣的方法。用于檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法(例如，Northern印跡、原位雜交、RT-PCR、表達(dá)特征譜分析)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。在下文中也描述了幾種此類(lèi)方法。
[0286]實(shí)施例1V[0287]用于診斷、分期、預(yù)后、監(jiān)控和治療癌癥相關(guān)疾病的方法、試劑和試劑盒。
[0288]應(yīng)理解，本文所中有實(shí)施例在它們的范圍內(nèi)將被認(rèn)為是非限定性的。在下面部分更詳細(xì)地描述各個(gè)方面。
[0289]診斷方法
[0290]在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了評(píng)估患者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有聞?dòng)谡５陌l(fā)生癌癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的診斷方法，所述方法包括將患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平與對(duì)照例如來(lái)自無(wú)癌癥相關(guān)疾病的患者的樣品中的標(biāo)志物的正常表達(dá)水平相比較的步驟。
[0291]與正常水平相比，患者樣品中顯著更高的標(biāo)志物表達(dá)水平表示患者患有癌癥相關(guān)疾病或具有高于正常的發(fā)生癌癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0292]選擇標(biāo)志物以使該方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為至少大約10%，在某些非限定性實(shí)施方案中，大約25%、大約50%或大約90%。也優(yōu)選用于本方法的是與正常細(xì)胞相比較在至少大約20%，在某些非限定性實(shí)施方案中，大約50%或大約75%的細(xì)胞中差異表達(dá)至少2倍的標(biāo)志物。
[0293]在一個(gè)評(píng)估患者是否患癌癥相關(guān)疾病的診斷方法(例如，新檢測(cè)(“篩查”)、復(fù)發(fā)的檢測(cè)、反射測(cè)試(reflex testing))中，方法包括比較:a)患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平，和b)對(duì)照非癌癥相關(guān)疾病樣品中標(biāo)志物的正常表達(dá)水平。與正常水平相比較患者樣品中顯著更高的標(biāo)志物表達(dá)水平表示患者患有癌癥相關(guān)疾病。
[0294]還提供了用于評(píng)估抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的療法的效果的診斷方法。此類(lèi)方法包括比較:a)在對(duì)患者提供至少一部分治療之前從患者獲得的第一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)，和b)在提供部分治療后從患者獲得的第二樣品中標(biāo)志物的表達(dá)。相對(duì)于第一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平，第二樣品中顯著更低的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示療法對(duì)于抑制患者的癌癥相關(guān)疾病是有效的。
[0295]應(yīng)理解，在此類(lèi)方法中，“療法”可以是治療癌癥相關(guān)疾病的任何療法，包括但不限于藥物組合物、基因療法和生物療法例如抗體和趨化因子的施用。因此，本文中描述的方法可用于評(píng)估治療前、治療期間和治療后的患者，例如用于評(píng)估疾病狀態(tài)的減輕。
[0296]在某些方面，診斷方法關(guān)注于使用化學(xué)或生物試劑的療法。此類(lèi)方法包括比較:a)從患者獲得的并且在化學(xué)或生物試劑存在的情況下維持的第一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)，和b)從患者獲得的并且在所述試劑不存在的情況下維持的第二樣品中標(biāo)志物的表達(dá)。相對(duì)于第一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平，第二樣品中顯著更低的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示試劑對(duì)于抑制患者的癌癥相關(guān)疾病是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二樣品可以是從患者獲得的單個(gè)樣品的部分或從患者獲得的混合樣品的部分。
[0297]評(píng)估預(yù)后的方法
[0298]還提供了用于評(píng)估患者的癌癥相關(guān)疾病的進(jìn)展的監(jiān)控方法，所述方法包括:a)在第一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)山)在隨后的時(shí)間點(diǎn)及時(shí)重復(fù)步驟a);和(3)比較步驟a)和b)中檢測(cè)的表達(dá)水平，從而監(jiān)控患者的癌癥相關(guān)疾病的進(jìn)展。與第一時(shí)間點(diǎn)上的樣品的標(biāo)志物的表達(dá)水平相比，在隨后的時(shí)間點(diǎn)上的樣品中顯著更高的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示癌癥相關(guān)疾病已向前發(fā)展，而顯著更低的表達(dá)水平表示癌癥相關(guān)疾病已消退。
[0299]還提供了用于確定癌癥相關(guān)疾病是否已惡化或可能在將來(lái)惡化的診斷方法，所述方法包括比較:a)患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平，和b)對(duì)照樣品中標(biāo)志物的正常表達(dá)水平。與正常水平相比較，患者樣品中顯著更高的表達(dá)水平表示癌癥相關(guān)疾病已惡化或可能在將來(lái)惡化。
[0300]評(píng)估抑制性、治療性和/或有害組合物的方法
[0301]還提供了用于選擇抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的組合物的檢測(cè)方法。該方法包括步驟:a)從患者獲得含有細(xì)胞的樣品；b)在多種受試組合物存在的情況下分別維持樣品的等分；c)比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)；和(1)選擇其中的一種受試組合物，所述組合物，相對(duì)于在其他受試組合物存在的情況下標(biāo)志物的表達(dá)水平，顯著減少含有該受試組合物的等分中標(biāo)志物的表達(dá)水平。
[0302]另外提供了評(píng)估化合物在引起癌癥相關(guān)疾病中的有害潛能的檢測(cè)方法。該方法包括步驟:a)在化合物存在和不存在的情況下維持分開(kāi)的細(xì)胞等分jPb)比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)。相對(duì)于在化合物不存在的情況下維持的等分中標(biāo)志物的表達(dá)水平，在化合物存在的情況下維持的等分中顯著更高的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示化合物具有這樣的有害潛能。
[0303]此外，還提供了抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的方法。該方法包括步驟:a)從患者獲得含有細(xì)胞的樣品；b)在多種組合物存在的情況下分別維持樣品的等分；c)比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)；和d)對(duì)患者施用至少一種組合物，所述組合物，相對(duì)于在其他組合物存在的情況下標(biāo)志物的表達(dá)水平，在含有該組合物的等分中顯著降低標(biāo)志物的表達(dá)水平。
[0304]樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平可以例如通過(guò)檢測(cè)下列物質(zhì)在樣品中的存在來(lái)估量:相應(yīng)的標(biāo)志物蛋白或所述蛋白的片段(例如，通過(guò)使用特異性結(jié)合所述蛋白或蛋白片段的試劑，例如抗體、抗體衍生物、抗體片段或單鏈抗體)、相應(yīng)的標(biāo)志物核酸(例如，核苷酸轉(zhuǎn)錄物或其互補(bǔ)序列)或所述核酸的片段(例如，通過(guò)將從樣品獲得的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸與在其上附著有一個(gè)或多個(gè)具有完整的所述核酸的序列或其區(qū)段或其互補(bǔ)序列的核酸的基質(zhì)接觸)、由相應(yīng)的標(biāo)志物蛋白直接(即，催化)或間接產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。
[0305]可使用至少一個(gè)或多個(gè)(例如，2、3、5或10或更多個(gè))癌癥相關(guān)疾病標(biāo)志物進(jìn)行任何上述方法。在此類(lèi)方法中，將多個(gè)標(biāo)志物(其中至少一個(gè)是標(biāo)志物)中的每一個(gè)在樣品中的表達(dá)水平與多個(gè)標(biāo)志物中的每一個(gè)在從未患有癌癥相關(guān)疾病的對(duì)照人獲得的相同類(lèi)型的樣品中的正常表達(dá)水平相比較。相對(duì)于該標(biāo)志物的相應(yīng)的正常或?qū)φ账?，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物或其一些組合在樣品中顯著改變的(即，如在上述使用單個(gè)標(biāo)志物的方法中所詳細(xì)說(shuō)明的增加或減少)表達(dá)水平表示患者患有癌癥相關(guān)疾病。對(duì)于所有上述方法，選擇標(biāo)志物以使方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是至少大約10%。
[0306]候選試劑的實(shí)例
[0307]候選試劑可以是本領(lǐng)域已知的藥理學(xué)試劑(pharmacologic agent)或可以是之前未知的具有任何藥理活性的試劑。試劑可以是天然產(chǎn)生的或?qū)嶒?yàn)室中設(shè)計(jì)的。它們可從微生物、動(dòng)物或植物分離，或可重組產(chǎn)生或通過(guò)任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法合成。它們可以是小分子、核酸、蛋白質(zhì)、肽或模擬肽(peptidomimetics)。在某些實(shí)施方案中,候選試劑是具有大于50且小于大約2，500道爾頓的分子量的小有機(jī)化合物。候選試劑包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性相互作用所必需的官能團(tuán)。還在生物分子中發(fā)現(xiàn)候選試劑，包括但不限于:肽、糖、脂肪酸、類(lèi)固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或組合。
[0308]可從多種來(lái)源(包括合成的或天然化合物的文庫(kù))獲得候選試劑。存在例如許多可獲得用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子的方法，包括隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽的表達(dá)。備選地，以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物的形式存在的天然化合物的文庫(kù)是可獲得的或可容易地產(chǎn)生。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫(kù)和化合物可容易地通過(guò)常規(guī)化學(xué)、物理和生物學(xué)方法進(jìn)行修飾，并且可用于產(chǎn)生組合文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，候選試劑可使用組合文庫(kù)方法領(lǐng)域中的許多方法中的任一方法來(lái)獲得，所述方法包括非限定性實(shí)例:生物文庫(kù)法；空間可定位平行固相或溶液相文庫(kù)法(spatially addressable parallel solidphase or solution phase libraries);需要解卷積(deconvolution)的合成文庫(kù)法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文庫(kù)法；和使用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。
[0309]在某些其他實(shí)施方案中，可將某些藥理學(xué)藥劑經(jīng)歷定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如?；?、燒化、酯化、酰胺化(amidification)等以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。
[0310]用于鑒定治療癌癥相關(guān)疾病的治療劑的相同方法還可用于驗(yàn)證體外研究產(chǎn)生的前導(dǎo)化合物(lead compound) /試劑。
[0311]候選試劑可以是上調(diào)或下調(diào)一個(gè)或多個(gè)癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答途徑的試劑。在某些實(shí)施方案中，候選試劑可以是影響這樣的途徑的拮抗劑。
[0312]用于治療癌癥相關(guān)疾病的方法[0313]本文提供了用于治療、抑制、減輕或逆轉(zhuǎn)癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的方法。在本文所述的方法中，對(duì)有此需要的個(gè)體施用干擾信號(hào)級(jí)聯(lián)的試劑，所述個(gè)體例如但不限于其中這樣的并發(fā)癥還不明顯的癌癥相關(guān)疾病患者和已具有至少一種癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的患者。
[0314]在前一種情況下，這樣的治療用于預(yù)防此類(lèi)癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的發(fā)生和/或減輕它們發(fā)生的程度。在后一種情況下，這樣的治療用于減輕此類(lèi)癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答發(fā)生的程度，阻止它們進(jìn)一步發(fā)展或逆轉(zhuǎn)癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答。
[0315]在某些實(shí)施方案中，干擾癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑可以是對(duì)此類(lèi)應(yīng)答特異的抗體。
[0316]標(biāo)志物的表達(dá)
[0317]可以以許多方式抑制標(biāo)志物的表達(dá)，所述方式包括非限定性實(shí)例:可對(duì)癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞提供反義寡核苷酸以抑制標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者。備選地，可對(duì)細(xì)胞提供編碼特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段并且與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子/調(diào)節(jié)子區(qū)域有效連接的多核苷酸，以產(chǎn)生抑制所述蛋白的功能或活性的細(xì)胞內(nèi)抗體。標(biāo)志物的表達(dá)和/或功能還可通過(guò)用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞來(lái)抑制。通過(guò)使用本文中描述的方法，可篩選多種分子，特別地包括足夠小以使它們能夠穿過(guò)細(xì)胞膜的分子，以鑒定抑制標(biāo)志物的表達(dá)或抑制標(biāo)志物蛋白的功能的分子?？蓪?duì)患者提供如此鑒定的化合物以抑制患者的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞。
[0318]任何標(biāo)志物或標(biāo)志物的組合，以及與所述標(biāo)志物組合的任何特定標(biāo)志物可用于本文中描述的組合物、試劑盒和方法中。一般地，期望使用這樣的標(biāo)志物，對(duì)于所述標(biāo)志物，癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞中該標(biāo)志物的表達(dá)水平與正常細(xì)胞中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平之間的差異盡可能大。雖然該差異可以小至用于估量標(biāo)志物的表達(dá)的方法的檢測(cè)極限，但期望差異至少大于估量方法的標(biāo)準(zhǔn)誤，在一些實(shí)施方案中，與正常組織中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平相比，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差異。
[0319]已公認(rèn)，某些標(biāo)志物蛋白被分泌至圍繞細(xì)胞的細(xì)胞外空間。由于此類(lèi)標(biāo)志物蛋白可在癌癥相關(guān)體液樣品中檢測(cè)，因此將這些標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法的某些實(shí)施方案，所述體液樣品可以比組織活檢樣品更容易地從人患者收集。此外，用于檢測(cè)標(biāo)志物蛋白的體內(nèi)技術(shù)包括將抗所述蛋白的標(biāo)記抗體引入受試者。例如，抗體可用其在受試者中的存在和定位可利用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)來(lái)檢測(cè)的放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。
[0320]為了確定任何特定的標(biāo)志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如人細(xì)胞系中表達(dá)標(biāo)志物蛋白，收集細(xì)胞外液體，估量蛋白質(zhì)在細(xì)胞外液體中的存在或不存在(例如，使用特異性結(jié)合所述蛋白的標(biāo)記抗體)。
[0321]應(yīng)理解，含有組織和/或體液細(xì)胞的患者樣品可用于本文中所述的方法。在這些實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)水平可通過(guò)估量樣品中標(biāo)志物的量(例如，絕對(duì)量或濃度)來(lái)估量。當(dāng)然，可在估量樣品中標(biāo)志物的量之前將細(xì)胞樣品經(jīng)歷多種收集后制備和貯藏技術(shù)(例如，核酸和/或蛋白質(zhì)提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心等)。
[0322]還應(yīng)理解，可使標(biāo)志物流出細(xì)胞進(jìn)入消化系統(tǒng)、血流和/或間質(zhì)間隙?？梢岳缤ㄟ^(guò)檢查血清或血漿來(lái)檢測(cè)流出的標(biāo)志物。
[0323]組合物、試劑盒和方法可用于檢測(cè)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，所述標(biāo)志物蛋白具有至少一個(gè)展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。例如，可將免疫學(xué)方法用于檢測(cè)完整細(xì)胞上的此類(lèi)蛋白，或可將基于計(jì)算機(jī)的序列分析法用于預(yù)測(cè)至少一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(即，包括分泌蛋白和具有至少一個(gè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))的存在?？蓹z測(cè)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)而無(wú)需裂解細(xì)胞(例如，使用特異性結(jié)合蛋白的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記抗體)，所述標(biāo)志物蛋白具有至少一個(gè)展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。
[0324]標(biāo)志物的表達(dá)可通過(guò)用多種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法中的任一種來(lái)估量。此類(lèi)方法的非限定性實(shí)例包括用于檢測(cè)分泌蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白或核蛋白的免疫學(xué)方法、蛋白質(zhì)純化法、蛋白質(zhì)功能或活性測(cè)定法、核酸雜交法、核酸逆轉(zhuǎn)錄法以及核酸擴(kuò)增法。
[0325]在特定的實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)可使用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段(包括已經(jīng)歷所有或部分其正常翻譯后修飾的標(biāo)志物蛋白)的抗體(例如，放射性標(biāo)記的、發(fā)色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗體)、抗體衍生物(例如，綴合有底物或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-配體對(duì)的配體的抗體)或抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變結(jié)構(gòu)域等)來(lái)估量。
[0326]在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)下述來(lái)估量:從患者樣品的細(xì)胞制備mRNA/cDNA (即，轉(zhuǎn)錄的多核苷酸)，然后將mRNA/cDNA與為標(biāo)志物核酸的互補(bǔ)序列的參照多核苷酸或其片段雜交。任選地，可在與參照多核苷酸雜交前使用多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法中的任一種來(lái)擴(kuò)增cDNA ;優(yōu)選，其不進(jìn)行擴(kuò)增。同樣可使用定量PCR檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)以估量標(biāo)志物的表達(dá)水平。備選地,可使用檢測(cè)標(biāo)志物的突變或變體(例如，單核苷酸多態(tài)性、缺失等)的許多方法中的任一種來(lái)檢測(cè)患者中標(biāo)志物的存在。
[0327]在相關(guān)實(shí)施方案中，將獲自樣品的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的混合物與在其上固定有多核苷酸(其與標(biāo)志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多個(gè)核苷酸殘基)互補(bǔ)或同 源)的基質(zhì)接觸。如果可在基質(zhì)上差異地檢測(cè)到互補(bǔ)或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)檢測(cè)或固定至不同的選擇的位置)，那么可使用單個(gè)基質(zhì)(例如，固定在所選擇的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微陣列)同時(shí)估量多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平。當(dāng)使用包括將一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸雜交的估量標(biāo)志物表達(dá)的方法時(shí)，期望在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行雜交。[0328]生物標(biāo)志物的測(cè)定
[0329]在某些實(shí)施方案中，可使用質(zhì)譜法或表面等離子共振術(shù)進(jìn)行生物標(biāo)志物測(cè)定(biomarker assay)。在不同的實(shí)施方案中，鑒定活性抗癌癥相關(guān)疾病的試劑的方法可包括a)提供含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物或其衍生物的細(xì)胞的樣品；b)從所述細(xì)胞制備提取物；c)將所述提取物與含有標(biāo)志物結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記核酸探針混合；和，d)在測(cè)試試劑存在或不存在的情況下測(cè)定標(biāo)志物與核酸探針之間的復(fù)合物的形成。測(cè)定步驟可包括將所述提取物/核酸探針混合物經(jīng)歷電泳遷移率試驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay)。
[0330]在某些實(shí)施方案中，測(cè)定步驟包括選自酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、基于熒光的測(cè)定和超高通量測(cè)定，例如，表面等離子共振術(shù)(SPR)或熒光相關(guān)光譜(FCS)測(cè)定的測(cè)定。在此類(lèi)實(shí)施方案中，SPR傳感器用于指導(dǎo)生物分子相互作用的實(shí)時(shí)觀(guān)察，因?yàn)镾PR對(duì)金屬-電介質(zhì)表面上的微小折射率改變非常敏感。SPR是對(duì)大約200nm的SPR傳感器/樣品介面內(nèi)的IO5至10_6折射率(RI)單位的改變敏感的表面技術(shù)。因此，SPR光譜法用于監(jiān)控沉積在傳感層上的薄有機(jī)薄膜的生長(zhǎng)。
[0331]因?yàn)榻M合物、試劑盒和方法依賴(lài)于一種或多種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異的檢測(cè)，因此期望標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著大于用于估量至少一種正常細(xì)胞和受癌癥影響的細(xì)胞中的表達(dá)的方法的最小檢測(cè)極限。 [0332]應(yīng)理解，通過(guò)使用一種或多種標(biāo)志物對(duì)另外的患者樣品進(jìn)行常規(guī)篩選，將了解某些標(biāo)志物在不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括特定的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。
[0333]此外，通過(guò)就標(biāo)志物的表達(dá)評(píng)估更大數(shù)量的患者樣品，并且使從其獲得樣品的個(gè)體患者的結(jié)果相互關(guān)聯(lián)，還將確認(rèn)某些標(biāo)志物的改變的表達(dá)與癌癥相關(guān)疾病強(qiáng)相關(guān)以及其他標(biāo)志物的改變的表達(dá)與其他疾病強(qiáng)相關(guān)。從而組合物、試劑盒和方法可用于表征患者的癌癥相關(guān)疾病的分期、分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型和性質(zhì)中的一種或多種。
[0334]當(dāng)組合物、試劑盒和方法用于表征患者的癌癥相關(guān)疾病的分期、分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型和性質(zhì)中的一種或多種時(shí)，期望選擇標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使在至少大約20%，在某些實(shí)施方案中，至少大約40%、60%或80%和基本上所有患者(其患有相應(yīng)分期、分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型或性質(zhì)的癌癥相關(guān)疾病)中獲得陽(yáng)性結(jié)果。可選擇本發(fā)明的標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使對(duì)于一般群體可獲得大于大約10%的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(在非限定性的實(shí)例中，外加大于80%的測(cè)定特異性)。
[0335]當(dāng)多個(gè)標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法時(shí)，可在單個(gè)反應(yīng)混合物(即，使用針對(duì)各個(gè)標(biāo)記物的試劑，例如不同的突光探針)或在相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的單獨(dú)的反應(yīng)混合物中，將患者樣品中各標(biāo)志物的表達(dá)水平與相同類(lèi)型的非癌癥樣品中多個(gè)標(biāo)志物中的每一個(gè)的正常表達(dá)水平相比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的正常水平，樣品中一個(gè)以上的標(biāo)志物的顯著增加的表達(dá)水平表示患者患有癌癥相關(guān)疾病。當(dāng)使用多個(gè)標(biāo)志物時(shí)，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多個(gè)單獨(dú)的標(biāo)志物；在某些實(shí)施方案中，可能期望使用更少的標(biāo)志物。
[0336]為了使組合物、試劑盒和方法的靈敏性最大化(即在干擾可歸因于患者樣品中非組織和/或體液來(lái)源的細(xì)胞的情況下)，期望本文中所使用的標(biāo)志物是具有受限制的組織分布(例如通常不在非組織細(xì)胞中表達(dá))的標(biāo)志物。
[0337]應(yīng)認(rèn)識(shí)到，組合物、試劑盒和方法對(duì)于具有增加的發(fā)生癌癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患者和他們的醫(yī)學(xué)顧問(wèn)將是特別有用的。被認(rèn)為具有增加的發(fā)生癌癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患者包括例如具有癌癥相關(guān)疾病家族史的患者。
[0338]可以以多種方法估量正常人細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該正常表達(dá)水平通過(guò)下述來(lái)估量:估量一部分表現(xiàn)正常的細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)水平且將該正常表達(dá)水平與一部分懷疑為異常的細(xì)胞中的表達(dá)水平相比較。備選地，特別是當(dāng)由于常規(guī)進(jìn)行本文中所述的方法而可獲得進(jìn)一步的信息時(shí)，可使用標(biāo)志物的正常表達(dá)的群體平均值。在其他實(shí)施方案中，標(biāo)志物的“正?！北磉_(dá)水平可通過(guò)估量標(biāo)志物在從未患有癌癥的患者獲得的患者樣品、在懷疑癌癥相關(guān)疾病在患者中發(fā)作之前從患者獲得的患者樣品、編檔保存的患者樣品等中的表達(dá)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
[0339]本文中還提供了用于估量癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞在樣品(例如編檔保存的組織樣品或從患者獲得的樣品)中的存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方法基本上與上述的相同，除了必要時(shí)，使組合物、試劑盒和方法適用于除了患者樣品外的樣品。例如，當(dāng)待使用的樣品是石蠟包埋的(parafinized)編檔保存的人組織樣品時(shí)，可能必需在用于估量樣品中標(biāo)志物表達(dá)水平的組合物、試劑盒或方法中調(diào)整化合物的比例。
[0340]產(chǎn)生抗體的方法
[0341]本文中還提供了制備產(chǎn)生用于估量患者是否患有癌癥相關(guān)疾病的抗體的分離的雜交瘤的方法。在該方法中，合成或分離(例如通過(guò)從其中表達(dá)其的細(xì)胞純化或通過(guò)體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸)含有完整標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽。使用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、兔或綿羊。任選地(和優(yōu)選地)可用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動(dòng)物至少另外一次，從而使脊椎動(dòng)物呈現(xiàn)強(qiáng)烈的針對(duì)蛋白質(zhì)或肽的免疫應(yīng)答。從免疫的脊椎動(dòng)物分離脾細(xì)胞，使用多種方法中的任一種將其與永生化的細(xì)胞系融合從而形成雜交瘤。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選以該方式形成的雜交瘤，從而鑒定一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的雜交瘤。本文還提供了通過(guò)該方法制備的雜交瘤和使用這樣的雜交瘤制備的抗體。
[0342]估量功效的方法`
[0343]本文還提供了估量測(cè)試化合物抑制癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞的功效的方法。如本文中述，標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異與細(xì)胞的異常狀態(tài)相關(guān)。雖然公認(rèn)，某些標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化可能由細(xì)胞的異常狀態(tài)引起，但同樣公認(rèn)，其他標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化誘導(dǎo)、維持和促進(jìn)此類(lèi)細(xì)胞的異常狀態(tài)。因此，抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的化合物將使一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平改變至更接近該標(biāo)志物的正常表達(dá)水平(即，所述標(biāo)志物在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平)的水平。
[0344]因此本方法包括將在測(cè)試化合物存在的情況下維持的第一細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物的表達(dá)與在測(cè)試化合物不存在的情況下維持的第二細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物的表達(dá)相比較。在測(cè)試化合物存在的情況下標(biāo)志物的顯著減少的表達(dá)表示該測(cè)試化合物抑制癌癥相關(guān)疾病。細(xì)胞樣品可以例如是獲自患者的正常細(xì)胞的單個(gè)樣品的等分、獲自患者的正常細(xì)胞的混合樣品、正常細(xì)胞系的細(xì)胞、獲自患者的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞的單個(gè)樣品的等分、獲自患者的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞的混合樣品、癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞系的細(xì)胞等。
[0345]在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是獲自患者的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞，并且檢測(cè)多種據(jù)認(rèn)為對(duì)于抑制各種癌癥相關(guān)疾病是有效的化合物，以鑒定可能最佳地抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的化合物。[0346]同樣可將該方法用于估量療法抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的功效。在該方法中，估量一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物在樣品對(duì)(一個(gè)樣品經(jīng)歷療法，另一個(gè)不經(jīng)歷療法)中的表達(dá)水平。與估量測(cè)試化合物的功效的方法一樣，如果療法誘導(dǎo)顯著更低的標(biāo)志物表達(dá)水平，則療法對(duì)于抑制癌癥相關(guān)疾病是有效的。如上，如果來(lái)自選擇的患者的樣品用于本方法，那么可在體外估量備選療法以選擇對(duì)于抑制患者的癌癥相關(guān)疾病最可能有效的療法。
[0347]用于評(píng)估有害潛能的方法
[0348]如本文中所描述的，人細(xì)胞的異常狀態(tài)與標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化相關(guān)。還提供了用于評(píng)估測(cè)試化合物的有害潛能的方法。該方法包括在測(cè)試化合物存在和不存的情況下維持分開(kāi)的人細(xì)胞等分。比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)。在測(cè)試化合物存在的情況下維持的等分中標(biāo)志物的顯著更高的表達(dá)水平(相對(duì)于在測(cè)試化合物不存在的情況下維持的等分)表示測(cè)試化合物具有有害的潛能。各種測(cè)試化合物的相對(duì)有害潛能可通過(guò)比較相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平的增強(qiáng)或抑制的程度，通過(guò)比較其表達(dá)水平被增強(qiáng)或抑制的的標(biāo)志物的數(shù)目，或通過(guò)比較兩者來(lái)估量。
[0349]分離的蛋白質(zhì)和抗體
[0350]一個(gè)方面涉及分離的標(biāo)志物蛋白和其生物活性部分，以及適合用作免疫原以引發(fā)抗標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然標(biāo)志物蛋白可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓桨笍募?xì)胞或組織來(lái)源分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有完整的標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。除重組表達(dá)外，可使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成此類(lèi)蛋白質(zhì)或肽。
[0351 ] “分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含細(xì)胞材料或來(lái)自細(xì)胞或組織來(lái)源(所述蛋白質(zhì)源自于其)的其他污染性蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品。術(shù)語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中將蛋白質(zhì)與從其分離或重組產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞組分分離的蛋白質(zhì)制劑。因此，基本上不含細(xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括具有低于大約30%、20%、10%或5%(按干重計(jì)算)的異種蛋白質(zhì)(在本文中也稱(chēng)為“污染性蛋白”)的蛋白質(zhì)制劑。
`[0352]當(dāng)重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其生物`活性部分時(shí)，其也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占據(jù)低于大約20%、10%或5%的蛋白質(zhì)制劑的體積。當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，其優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品，即，其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品分離。因此，此類(lèi)蛋白質(zhì)制劑具有低于大約30%、20%、10%、5%(按干重計(jì)算)的化學(xué)前體或除了目的多肽外的化合物。
[0353]標(biāo)志物蛋白的生物活性部分包括含有與標(biāo)志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全長(zhǎng)蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并且展示相應(yīng)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應(yīng)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。標(biāo)志物蛋白的生物活性部分可以是其長(zhǎng)度為例如10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多肽。此外，其中標(biāo)志物蛋白的其他區(qū)域被缺失的其他生物活性部分可通過(guò)重組技術(shù)來(lái)制備，并且可就標(biāo)志物蛋白的天然形式的一種或多種功能活性對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。在某些實(shí)施方案中，有用的蛋白質(zhì)與此類(lèi)序列之一基本上同一(例如，至少大約40%，在某些實(shí)施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相應(yīng)的天然發(fā)生的標(biāo)志物蛋白的功能活性但因天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上不同。[0354]此外，標(biāo)志物蛋白的區(qū)段文庫(kù)可用于產(chǎn)生用于篩選和隨后選擇變異標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的多肽的多樣化(variegated)群體。
[0355]預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)
[0356]本文中還提供了動(dòng)物模型和標(biāo)志物在預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途，其中診斷測(cè)定、預(yù)后測(cè)定、藥物基因組學(xué)和監(jiān)控臨床試驗(yàn)用于預(yù)后(預(yù)測(cè))目的，從而預(yù)防性治療個(gè)體。因此，本文中還提供了用于測(cè)定一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物蛋白或核酸的表達(dá)水平以確定個(gè)體是否處于發(fā)生癌癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的診斷測(cè)定。此類(lèi)測(cè)定可用于預(yù)后或預(yù)測(cè)目的，從而在癌癥相關(guān)疾病發(fā)作之前預(yù)防性治療個(gè)體。
[0357]在另一個(gè)方面，方法可用于相同個(gè)體的至少周期性篩查以觀(guān)察該個(gè)體是否已暴露于改變他/她的表達(dá)模式的化學(xué)藥品或毒素。
[0358]另一方面涉及監(jiān)控試劑(例如，被施用以抑制癌癥相關(guān)疾病或治療或預(yù)防任何其他障礙的藥物或其他化合物(例如，以了解這樣的治療可能具有的任何系統(tǒng)性作用))在臨床試驗(yàn)中對(duì)標(biāo)志物的表達(dá)或活性的影響。
[0359]藥物基因組學(xué)
[0360]標(biāo)志物還可用作藥物基因組學(xué)標(biāo)志物。如本文中所用的，“藥物基因組學(xué)標(biāo)志物”是其表達(dá)水平與患者中特定臨床藥物應(yīng)答或易感性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥物基因組學(xué)標(biāo)志物表達(dá)的存在或量與預(yù)測(cè)的患者應(yīng)答和更特別地患者的腫瘤對(duì)用特定藥物或藥物種類(lèi)的療法的應(yīng)答相關(guān)。通過(guò)估量患者中一個(gè)或多個(gè)藥物基因組學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)的存在或量，可選擇最適合于患者的或預(yù)測(cè)具有更大的成功程度的藥物療法。
[0361]監(jiān)控臨床試驗(yàn)
[0362]監(jiān)控試劑(例 如，藥物化合物)對(duì)標(biāo)志物的表達(dá)水平的影響不僅可用于基礎(chǔ)藥物篩選，而且還可用于臨床試驗(yàn)。例如，可在接受癌癥相關(guān)疾病治療的受試者的臨床試驗(yàn)中監(jiān)控試劑影響標(biāo)志物表達(dá)的有效性。
[0363]在一個(gè)非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)控利用試劑(例如，激動(dòng)劑、拮抗劑、模擬肽、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有效性的方法，該方法包括步驟(i)在施用試劑之前從受試者獲得施用前的樣品；(ii)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)選擇的標(biāo)志物在施用前的樣品中的表達(dá)水平；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)施用后樣品；(iv)檢測(cè)標(biāo)志物在施用后樣品中的表達(dá)水平；(V)將施用前樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平與施用后樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平相比較；以及(Vi)相應(yīng)地改變?cè)噭┲潦茉囌叩氖┯谩?br> [0364]例如，在治療過(guò)程中增加的標(biāo)志物基因的表達(dá)可表明無(wú)效劑量，從而需要增加劑量。相反地，減少的標(biāo)志基因的表達(dá)可表明有效治療，從而不需要改變劑量。
[0365]電子設(shè)備可讀介質(zhì)、系統(tǒng)、陣列和使用其的方法
[0366]如本文中所使用的，“電子設(shè)備可讀介質(zhì)”是指用于存儲(chǔ)、保存或包含可用電子設(shè)備直接閱讀和存取的數(shù)據(jù)或信息的任何適當(dāng)介質(zhì)。此類(lèi)介質(zhì)可包括但不限于:磁性存儲(chǔ)介質(zhì)，例如軟盤(pán)、硬盤(pán)存儲(chǔ)介質(zhì)以及磁帶；光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)例如光盤(pán)；電子存儲(chǔ)介質(zhì)例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盤(pán)和這些類(lèi)別的混合體例如磁性/光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)。可對(duì)介質(zhì)進(jìn)行改造或設(shè)定以用于在其上記錄本文中所述的標(biāo)志物。
[0367]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“電子設(shè)備”旨在包括任何適當(dāng)?shù)挠?jì)算或處理設(shè)備或其他經(jīng)改造或設(shè)定用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)或信息的裝置。適合用于本發(fā)明的電子設(shè)備的實(shí)例包括獨(dú)立的計(jì)算設(shè)備；網(wǎng)絡(luò)，包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)絡(luò)(WAN)因特網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和外聯(lián)網(wǎng)；電子器具例如個(gè)人數(shù)字助理(PDA)、手機(jī)、尋呼機(jī)(pager)等；以及局域和分布式處理系統(tǒng)。
[0368]如本文中所使用的，“記錄”是指在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲(chǔ)或編碼信息的過(guò)程。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用任何用于在介質(zhì)上記錄信息的方法來(lái)產(chǎn)生包含本文中所述的標(biāo)志物的材料。
[0369]許多軟件程序和格式可用于在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲(chǔ)本發(fā)明的標(biāo)志物信息。為了獲得或產(chǎn)生在其上記錄了標(biāo)志物的介質(zhì)，可使用許多數(shù)據(jù)處理程序構(gòu)建格式(dataprocessor structuring format)(例如,文本文件或數(shù)據(jù)庫(kù))。通過(guò)以可讀形式提供標(biāo)志物，可常規(guī)存取用于多種目的的標(biāo)志物序列信息。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用可讀形式的核苷酸或氨基酸序列來(lái)將靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序與存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)工具中的序列相比較。搜索工具用于鑒定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或區(qū)域。
[0370]因此，本文中還提供了用于保存進(jìn)行確定受試者是否具有癌癥相關(guān)疾病或?qū)Π┌Y相關(guān)疾病的易感性的方法的說(shuō)明書(shū)的介質(zhì)，其中所述方法包括步驟:確定標(biāo)志物的存在或不存在并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來(lái)確定受試者是否具有癌癥相關(guān)疾病或?qū)Π┌Y相關(guān)疾病的易感性和/或推薦用于癌癥相關(guān)疾病或癌癥相關(guān)疾病前狀況(pre-cancer-related disease condition)的特定治療。
[0371]本文中還提供了電子系統(tǒng)和/或在網(wǎng)絡(luò)中提供了用于確定受試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)與標(biāo)志物相關(guān)的癌癥相關(guān)疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步驟:確定標(biāo)志物的存在或不存在，并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來(lái)確定受試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)癌癥相關(guān)疾病的易感性和/或推薦用于癌癥相關(guān)疾病或癌癥相關(guān)疾病前狀況的特定治療。方法還可包括接收與受試者相關(guān)的表型信息和/或從網(wǎng)絡(luò)獲取與受試者相關(guān)的表型信息的步驟。
[0372]本文中還提供了網(wǎng)絡(luò)，用于確定受試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)與標(biāo)志物相關(guān)的癌癥相關(guān)疾病的易感性的方法，所述方法包括步驟:接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或癌癥相關(guān)疾病的信息，并且基于表型信息、標(biāo)志物和獲取的信息中的一個(gè)或多個(gè)，確定受試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)癌癥相關(guān)疾病的易感性。方法還包括推薦用于癌癥相關(guān)疾病或癌癥相關(guān)疾病前狀況的特定治療的步驟。
[0373]本文中還提供了用于確定受:試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)癌癥相關(guān)疾病的易感性的商業(yè)方法，所述方法包括步驟:接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或癌癥相關(guān)疾病的信息，并且基于表型信息、標(biāo)志物和獲得的信息中的一個(gè)或多個(gè)，確定受試者是否患有癌癥相關(guān)疾病或具有對(duì)癌癥相關(guān)疾病的易感性。方法還包括推薦用于癌癥相關(guān)疾病或癌癥相關(guān)疾病前狀況的特定治療的步驟。
[0374]陣列
[0375]本文中還提供了可用于測(cè)定陣列中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可用于測(cè)定組織中基因的表達(dá)，從而確定陣列中基因的組織特異性。這樣，可就表達(dá)同時(shí)測(cè)定直至大約7000或更多個(gè)基因。這使得能夠產(chǎn)生顯示在一個(gè)或多個(gè)組織中特異性表達(dá)的一組基因的特征譜。[0376]除了此類(lèi)定性測(cè)定外，本文中還提供了基因表達(dá)的定量。因此，不僅組織特異性而且一組基因在組織中的表達(dá)水平也是可確定的。因此，可基于基因本身的組織表達(dá)和在該組織中的表達(dá)水平來(lái)對(duì)基因進(jìn)行分類(lèi)。這可用于例如確定組織間基因表達(dá)的關(guān)系。因此，可干擾一個(gè)組織，然后可測(cè)定對(duì)第二組織中的基因表達(dá)的影響。在本說(shuō)明書(shū)中，可測(cè)定一種細(xì)胞類(lèi)型對(duì)另一種細(xì)胞類(lèi)型(響應(yīng)生物刺激)的影響。
[0377]此類(lèi)測(cè)定可用于例如在基因表達(dá)的水平上了解細(xì)胞間相互作用的效果。如果試劑被治療性施用以治療一種細(xì)胞類(lèi)型但其對(duì)另一種細(xì)胞類(lèi)型具有不期望的作用，則所述方法提供了確定不期望的作用的分子基礎(chǔ)的測(cè)定，從而提供共施用中和劑(counteractingagent)或另外治療不期望的作用的機(jī)會(huì)。類(lèi)似地，即使在單個(gè)細(xì)胞類(lèi)型中，可在分子水平上測(cè)定不期望的生物學(xué)效應(yīng)。因此，可確定和中和試劑對(duì)非靶基因的表達(dá)的作用。
[0378]在另一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可用于監(jiān)控陣列中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的時(shí)程。如本文中所公開(kāi)的，這可發(fā)生在各種生物學(xué)背景(例如癌癥相關(guān)疾病的發(fā)生，癌癥相關(guān)疾病的進(jìn)展)和過(guò)程(例如與癌癥相關(guān)疾病相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化)中。
[0379]陣列還可用于確定基因的表達(dá)或其他基因的表達(dá)在相同細(xì)胞或不同細(xì)胞中的作用。如果不能調(diào)控最終或下游靶，那么這提供了例如用于治療性干預(yù)的備選分子靶的選擇。
[0380]陣列還可用于確定一個(gè)或多個(gè)基因在正常和異常細(xì)胞中的差異表達(dá)模式。這提供了可用作診斷或治療性干預(yù)的分子靶的一組基因。
[0381 ]替代標(biāo)志物(Surrogate Marker )
[0382]標(biāo)志物可用作一種或多種障礙或疾病狀態(tài)或?qū)е掳┌Y相關(guān)疾病狀態(tài)的狀況的替代標(biāo)志物。如本文中所使用的，“替代標(biāo)志物”是與疾病或障礙的不存在或存在，或與疾病或障礙的進(jìn)展相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。此類(lèi)標(biāo)志物的存在或量不依賴(lài)于疾病。因此，此類(lèi)標(biāo)志物可用于指示特定的療程在減輕疾病狀態(tài)或障礙中是否有效。當(dāng)疾病狀態(tài)或障礙的存在或程度難以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法`來(lái)評(píng)估，或當(dāng)在達(dá)到潛在危險(xiǎn)的臨床終點(diǎn)之前期望評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)，替代標(biāo)志物是特別有用的。
[0383]標(biāo)志物還可用作藥效標(biāo)志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的藥效標(biāo)志物”是與藥物作用特異性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥效標(biāo)志物的存在或量與將對(duì)其施用藥物的疾病狀態(tài)或障礙無(wú)關(guān)；因此，標(biāo)志物的存在或量表示藥物在受試者中的存在或活性。例如，藥效標(biāo)志物可表示藥物在生物組織中的濃度，因?yàn)闃?biāo)志物在該組織中表達(dá)或轉(zhuǎn)錄，或者不表達(dá)或轉(zhuǎn)錄與藥物的水平相關(guān)。這樣，藥物的分布或吸收可通過(guò)藥效標(biāo)志物來(lái)監(jiān)控。類(lèi)似地，藥效標(biāo)志物的存在或量可與藥物的代謝產(chǎn)物的存在或量相關(guān)，這樣標(biāo)志物的存在或量表示藥物在體內(nèi)的相對(duì)分解速率。
[0384]藥效標(biāo)志物在增加藥物作用的檢測(cè)的靈敏性中特別有用，特別是當(dāng)以低劑量施用藥物時(shí)。由于即使少量的藥物也可足以激活多輪的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，因此擴(kuò)增的標(biāo)志物可以以比藥物本身更容易檢測(cè)的量存在。同樣，標(biāo)志物由于其本身的性質(zhì)而可以更容易地進(jìn)行檢測(cè)；例如，通過(guò)使用本文中描述的方法，可將抗體用于針對(duì)蛋白標(biāo)志物的基于免疫的檢測(cè)系統(tǒng)，或可使用標(biāo)志物特異性放射性標(biāo)記探針來(lái)檢測(cè)mRNA標(biāo)志物。此外，藥效標(biāo)志物的使用可提供由于藥物治療而產(chǎn)生的超出可直接觀(guān)察的范圍的風(fēng)險(xiǎn)的基于機(jī)制的預(yù)測(cè)。
[0385]用于檢測(cè)的方案
[0386]檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的方法包括例如在一段時(shí)間內(nèi)測(cè)量各標(biāo)志物基因在來(lái)自受試者的生物樣品中的表達(dá)水平和將該水平與對(duì)照生物樣品中標(biāo)志物基因的水平相比較。
[0387]當(dāng)標(biāo)志物基因是本文中描述的基因之一并且表達(dá)水平差異表達(dá)(例如，比對(duì)照中的表達(dá)水平更高或更低)時(shí)，受試者被判斷為患有癌癥相關(guān)疾病。當(dāng)標(biāo)志物基因的表達(dá)水平落在容許的范圍內(nèi)時(shí)，受試者不可能患有癌癥相關(guān)疾病。
[0388]可通過(guò)測(cè)量對(duì)照中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平來(lái)預(yù)先測(cè)定對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)值，以比較表達(dá)水平。例如，可基于上述標(biāo)志物基因在對(duì)照中的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)值。例如，在某些實(shí)施方案中，容許的范圍基于標(biāo)準(zhǔn)值采用±2S.D.。在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)值后，可通過(guò)只測(cè)量來(lái)自受試者的生物樣品中的表達(dá)水平并將該值與測(cè)定的對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)值相比較來(lái)進(jìn)行檢測(cè)方法。
[0389]標(biāo)志物基因的表達(dá)水平包括標(biāo)志物基因至mRNA的轉(zhuǎn)錄和至蛋白質(zhì)的翻譯。因此，基于相應(yīng)于標(biāo)志物基因的mRNA的表達(dá)強(qiáng)度或由標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的比較，進(jìn)行檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的一個(gè)方法。
[0390]探針
[0391]可根據(jù)各種基因分析方法在癌癥相關(guān)疾病的檢測(cè)中測(cè)量標(biāo)志物基因的表達(dá)水平。具體地，可使用例如利用與此類(lèi)基因雜交的核酸作為探針的雜交技術(shù)，或利用與標(biāo)志物基因雜交的DNA作為引物的基因擴(kuò)增技術(shù)。
[0392]可基于標(biāo)志物基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于檢測(cè)的探針或引物。本文中描述了各標(biāo)志物基因的核苷酸序列的標(biāo)識(shí)號(hào)。
[0393]此外，應(yīng)理解，高等動(dòng)物的基因通常伴有高頻率的多態(tài)性。也存在許多在剪接過(guò)程中產(chǎn)生含有相互不同的氨 基酸序列的同種型的分子。與癌癥相關(guān)疾病相關(guān)的具有與標(biāo)志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在標(biāo)志物基因中，即使其由于多態(tài)性或?yàn)橥N型而具有核苷酸序列差異。
[0394]也應(yīng)理解，標(biāo)志物基因可包括除了人外的其他物種的同源物。因此，除非明確指出，否則表述“標(biāo)志物基因”是指對(duì)于物種獨(dú)特的標(biāo)志物基因的同源物或已被導(dǎo)入個(gè)體的外源標(biāo)志物基因。
[0395]同樣，應(yīng)理解，“標(biāo)志物基因的同源物”是指來(lái)源于除了人以外的物種的基因，其在嚴(yán)格條件下可作為探針與人標(biāo)志物基因雜交。這樣的嚴(yán)格條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員(其可通過(guò)實(shí)驗(yàn)或憑經(jīng)驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)臈l件來(lái)產(chǎn)生相同嚴(yán)格性)來(lái)說(shuō)是已知的。
[0396]含有標(biāo)志物基因的核苷酸序列或與標(biāo)志物基因的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)并且具有至少15個(gè)核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探針。因此，“互補(bǔ)鏈”是指由A:T (對(duì)于RNA為U)和G:C堿基對(duì)組成的雙鏈DNA中相對(duì)于另一條鏈的一條鏈。
[0397]此外，“互補(bǔ)”不僅意指與至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域完全互補(bǔ)的序列，而且還指具有在某些情況下至少40%，在某些情況下50%，在某些情況下60%，在某些情況下70%，至少80%,90%和95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之間的同源性的程度可利用算法BLAST等來(lái)測(cè)定。
[0398]此類(lèi)多核苷酸可用作檢測(cè)標(biāo)志物基因的探針，或用作擴(kuò)增標(biāo)志物基因的引物。當(dāng)用作引物時(shí)，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些實(shí)施方案中15bp至35bp的核苷酸。當(dāng)用作探針時(shí)，DNA包含標(biāo)志物基因的整個(gè)核苷酸序列(或其互補(bǔ)鏈)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。當(dāng)用作引物時(shí)，3'區(qū)域必須與標(biāo)志物基因互補(bǔ)，而5'區(qū)域可連接至限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列或標(biāo)簽(tag)。[0399]“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此類(lèi)多核苷酸可以是合成的或天然發(fā)生的。同樣，通常也標(biāo)記用作雜交探針的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解此類(lèi)標(biāo)記方法。在本文中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”意指具有相對(duì)低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸內(nèi)。
[0400]用于癌癥相關(guān)疾病的檢測(cè)
[0401]可使用例如Northern雜交、斑點(diǎn)印跡雜交或DNA微陣列技術(shù)進(jìn)行利用雜交技術(shù)的癌癥相關(guān)疾病的檢測(cè)。此外，可使用基因擴(kuò)增技術(shù)例如RT-PCR法。通過(guò)在RT-PCR的基因擴(kuò)增步驟中使用PCR擴(kuò)增監(jiān)控法，可更加定量地分析標(biāo)志物基因的表達(dá)。
[0402]在PCR基因擴(kuò)增監(jiān)控法中，將檢測(cè)靶(DNA或RNA的反轉(zhuǎn)錄物)與用熒光染料和吸收熒光的猝滅劑標(biāo)記的探針雜交。當(dāng)PCR進(jìn)行并且Taq聚合酶以其5' -3'外切核酸酶活性降解探針時(shí)，熒光染料與猝滅劑彼此分離，從而檢測(cè)到熒光。實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光。通過(guò)同時(shí)測(cè)量其中靶的拷貝數(shù)是已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，可利用循環(huán)數(shù)(其中PCR擴(kuò)增是線(xiàn)性的)測(cè)定受試者樣品中靶的拷貝數(shù)。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)PCR擴(kuò)增監(jiān)控法可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)進(jìn)行。
[0403]還可通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的方法。在下文中，標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)被描述為“標(biāo)志物蛋白”。對(duì)于此類(lèi)檢測(cè)方法，可通過(guò)使用結(jié)合各標(biāo)志物蛋白的抗體來(lái)應(yīng)用例如，Western印跡法、免疫沉淀法和ELISA法。
[0404]用于檢測(cè)的結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來(lái)產(chǎn)生。同樣，為了檢測(cè)標(biāo)志物蛋白，可適當(dāng)?shù)貥?biāo)記這樣的抗體。備選地，可不標(biāo)記抗體，而是標(biāo)記特異性結(jié)合抗體的物質(zhì)例如蛋白A或蛋白G以間接檢測(cè)標(biāo)志物蛋白。更特別地，此類(lèi)檢測(cè)方法可包括ELISA 法。
[0405]可以例如通過(guò)將標(biāo)志物基因或其部分插入表達(dá)載體，將構(gòu)建體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化株以表達(dá)重組蛋白，然后從培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清液純化表達(dá)的重組蛋白來(lái)獲得用作抗原的蛋白質(zhì)或其部分肽。備選地，可化學(xué)合成由基因編碼的氨基酸序列或含有由全長(zhǎng)cDNA編碼的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
[0406]此外，可通過(guò)使用指數(shù)(不僅生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平而且標(biāo)志物蛋白的活性)來(lái)進(jìn)行癌癥相關(guān)疾病的檢測(cè)。標(biāo)志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物活性。可使用各種方法測(cè)量每一種蛋白的活性。
[0407]即使在常規(guī)檢 測(cè)中患者未被診斷為患有癌癥相關(guān)疾病(盡管癥狀暗示此類(lèi)疾病)，這樣的患者是否患有癌癥相關(guān)疾病也可通過(guò)按照本文中所述的方法進(jìn)行檢測(cè)來(lái)容易地確定。
[0408]更特別地，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，其癥狀至少暗示對(duì)癌癥相關(guān)疾病的易感性的患者中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少表明癥狀主要由癌癥相關(guān)疾病引起。
[0409]此外，檢測(cè)可用于確定癌癥相關(guān)疾病是否在患者中得到改善。換句話(huà)說(shuō)，本文中描述的方法可用于判斷癌癥相關(guān)疾病治療的治療效果。此外，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，已被診斷為患有癌癥相關(guān)疾病的患者中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少意味著疾病已向前發(fā)展。
[0410]還可基于表達(dá)水平的差異測(cè)定癌癥相關(guān)疾病的嚴(yán)重性和/或易感性。例如，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加程度與癌癥相關(guān)疾病的存在和/或嚴(yán)重性相關(guān)。
[0411]標(biāo)志物的表達(dá)的控制
[0412]此外，標(biāo)志物基因本身的表達(dá)可通過(guò)向基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)導(dǎo)入突變來(lái)控制。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解此類(lèi)氨基酸置換。同樣，被突變的氨基酸的數(shù)目不受特別限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)，在某些非限定性實(shí)施方案中，在30個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)，在10個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)，或在3個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)。突變的位點(diǎn)可以是任何位點(diǎn)，只要活性得到保持即可。
[0413]篩選方法
[0414]在另一個(gè)方面，本文中提供了治療癌癥相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的篩選方法。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因選自本文中描述的基因。可通過(guò)選擇能夠增加或減少標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的化合物來(lái)獲得癌癥相關(guān)疾病的治療劑。
[0415]應(yīng)理解，表述“增加基因的表達(dá)水平的化合物”是指促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、基因翻譯或蛋白質(zhì)活性的表達(dá)的步驟中的任一步驟的化合物。另一方面，表述“減少基因的表達(dá)水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制這些步驟中的任一步驟的化合物。
[0416]在特定的方面，可在體內(nèi)或體外進(jìn)行篩選癌癥相關(guān)疾病的治療劑的方法。該篩選方法可以例如通過(guò)下列步驟來(lái)進(jìn)行:(I)對(duì)動(dòng)物受試者施用候選化合物；(2)測(cè)量動(dòng)物受試者的生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平；或(3)選擇與對(duì)照(其未與候選化合物接觸)中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平相比較增加或減少標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的化合物。
[0417]在另一個(gè)方面，本文中提供了這樣的方法，其通過(guò)將動(dòng)物受試者與候選化合物接觸，然后監(jiān)控化合物對(duì)來(lái)源于動(dòng)物受試者的生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的作用來(lái)評(píng)估藥劑的候選化合物對(duì)標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的功效。來(lái)源于動(dòng)物受試者的生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的變化可使用與上述檢測(cè)方法中所用的相同的技術(shù)來(lái)監(jiān)控。此外，基于評(píng)估，可通過(guò)篩選來(lái)選擇藥劑的候選化合物。
`[0418]試劑盒
[0419]在另一個(gè)方面，提供了各種診斷和檢測(cè)試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可用于估量患者是否患有癌癥相關(guān)疾病。試劑盒包含用于估量標(biāo)志物的表達(dá)的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可用于估量化學(xué)或生物試劑用于抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的適合性。此類(lèi)試劑盒包含用于估量標(biāo)志物的表達(dá)的試劑,并且可包含一種或多種此類(lèi)試劑。
[0420]在另外的實(shí)施方案中，試劑盒可用于估量癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞的存在或治療癌癥相關(guān)疾病。此類(lèi)試劑盒包含特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或所述蛋白的片段的抗體、抗體衍生物或抗體片段。此類(lèi)試劑盒還可包含多種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中多種此類(lèi)抗體試劑特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或所述蛋白的片段。
[0421]在另外的實(shí)施方案中，試劑盒可用于估量癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞的存在，其中試劑盒包含特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或所述核酸的片段的核酸探針。試劑盒還可包含多種探針，其中每一種探針特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或所述核酸的片段。
[0422]本文中所述的組合物、試劑盒和方法尤其可具有下列用途:1)估量患者是否患有癌癥相關(guān)疾?。?)估量人患者中癌癥相關(guān)疾病的分期；3)估量患者中癌癥相關(guān)疾病的分級(jí)；4)估量患者中癌癥相關(guān)疾病的性質(zhì)；5)估量患者中發(fā)生癌癥相關(guān)疾病的可能性；6)估量患者中與癌癥相關(guān)疾病相關(guān)的細(xì)胞的組織學(xué)類(lèi)型；7)制備用于治療癌癥相關(guān)疾病和/或評(píng)估患者是否患有癌癥相關(guān)疾病的抗體、抗體片段或抗體衍生物；8)估量癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞的存在；9)估量一種或多種測(cè)試化合物抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的功效；10)估量療法抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的功效；11)監(jiān)控患者的癌癥相關(guān)疾病的進(jìn)展；12)選擇抑制患者的癌癥相關(guān)疾病的組合物或療法；13)治療患有癌癥相關(guān)疾病的患者；14)抑制患者的癌癥相關(guān)疾??；15)評(píng)估測(cè)試化合物的有害潛能；和16)在處于發(fā)生癌癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的患者中預(yù)防癌癥相關(guān)疾病的發(fā)生。
[0423]試劑盒可用于評(píng)估癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞(例如在樣品例如患者樣品中)的存在。試劑盒包含多種試劑，每一種所述試劑能夠特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或蛋白。適合于結(jié)合標(biāo)志物蛋白的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。適合于結(jié)合標(biāo)志物核酸(例如基因組DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)的試劑包括互補(bǔ)核酸。例如，核酸試劑可包括固定至基質(zhì)的寡核苷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記的)、未與基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記的寡核苷酸、PCR引物對(duì)、分子信標(biāo)探針等。
[0424]試劑盒可任選地包含用于進(jìn)行本文中所述的方法的另外的成分。例如，試劑盒可包含適合于使互補(bǔ)核酸退火或適合于使抗體與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合的液體(例如SSC緩沖液)、一個(gè)或多個(gè)樣品隔室、描述方法的進(jìn)行的說(shuō)明書(shū)、正常細(xì)胞樣品、癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞樣品等。
[0425]動(dòng)物模型
[0426]可產(chǎn)生用于評(píng)估至少一種癌癥相關(guān)疾病的非人動(dòng)物模型。該方法包括將動(dòng)物暴露于重復(fù)劑量的至少一種據(jù)認(rèn)為引起目的癌癥的化學(xué)藥品。在某些方面，該方法還包括收集一種或多種選擇的動(dòng)物樣品；和將收集的樣品與一種或多種潛在的癌癥起始或發(fā)生的指示物(indicia)相比較。
[0427]產(chǎn)生動(dòng)物模型的方法包括:在無(wú)特定化學(xué)藥品的環(huán)境中維持動(dòng)物并且用至少一種據(jù)認(rèn)為引起癌癥的化學(xué)藥品敏化動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)多次連續(xù)暴露敏化動(dòng)物的至少一部分。
[0428]篩選有效地抗至少一種癌癥相關(guān)疾病的試劑的方法通常包括:對(duì)受試動(dòng)物施用至少一種試劑，確定試劑是否減輕或加重癌癥相關(guān)疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀；使一個(gè)或多個(gè)癥狀的減輕與試劑抗癌癥相關(guān)疾病的有效性相互關(guān)聯(lián)；或使一個(gè)或多個(gè)癥狀的減輕的不存在與試劑的無(wú)效性相互關(guān)聯(lián)。動(dòng)物模型用于評(píng)估一個(gè)或多個(gè)代謝途徑，所述代謝途徑促成了至少一種癌癥相關(guān)疾病的起始、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病狀、攻擊性、分級(jí)、活性、失能(disability)、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類(lèi)或其他潛在的致病或病理特征中的至少一種?？衫?層次聚類(lèi)(hierarchical clustering)、特征網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(signature networkconstruction)、質(zhì)譜蛋白組學(xué)分析、表面等離子共振術(shù)、線(xiàn)性統(tǒng)計(jì)建模、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis)和多次線(xiàn)性回歸分析中的一種或多種來(lái)進(jìn)行分析。
[0429]可通過(guò)檢查一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物或其功能等同物的表達(dá)水平來(lái)就至少一種癌癥相關(guān)疾病評(píng)估動(dòng)物模型。
[0430]動(dòng)物模型可用于篩選可用于治療或預(yù)防癌癥相關(guān)疾病的治療劑。因此，方法可用于鑒定用于治療或預(yù)防癌癥相關(guān)疾病的治療劑。方法包括對(duì)由本文中所述方法產(chǎn)生的動(dòng)物模型施用候選試劑，評(píng)估與未施用候選試劑的對(duì)照動(dòng)物模型相比動(dòng)物模型中至少一種癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答。如果至少一種癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答在癥狀上減輕或在發(fā)生上延遲，則候選試劑是用于治療或預(yù)防癌癥相關(guān)疾病的試劑。
[0431]癌癥相關(guān)疾病的動(dòng)物模型可包括動(dòng)物，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因或功能上與標(biāo)志物基因等同的基因的表達(dá)水平在所述動(dòng)物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是編碼具有與由標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的已知活性相似的活性的蛋白質(zhì)的基因。功能上等同的基因的代表性實(shí)例包括受試動(dòng)物的標(biāo)志物基因?qū)?yīng)物，其是動(dòng)物本身固有的。
[0432]癌癥相關(guān)疾病動(dòng)物模型可用于檢測(cè)由于癌癥相關(guān)疾病而引起的生理學(xué)變化。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物模型可用于揭示標(biāo)志物基因的另外的功能和評(píng)估其靶為標(biāo)志物基因的藥物。
[0433]在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥相關(guān)疾病動(dòng)物模型可通過(guò)控制對(duì)應(yīng)物基因的表達(dá)水平或施用對(duì)應(yīng)物基因來(lái)產(chǎn)生。方法可包括通過(guò)控制選自本文中所述的基因的基因的表達(dá)水平來(lái)產(chǎn)生癌癥相關(guān)疾病動(dòng)物模型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法可包括通過(guò)施用由本文中所描述的基因編碼的蛋白質(zhì)或施用抗所述蛋白的抗體來(lái)產(chǎn)生癌癥相關(guān)疾病動(dòng)物模型。還應(yīng)理解，在某些其他實(shí)施方案中，可過(guò)表達(dá)標(biāo)志物，以便可使用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量標(biāo)志物。
[0434]在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥相關(guān)疾病動(dòng)物模型可通過(guò)導(dǎo)入選自此類(lèi)基因的基因，或通過(guò)施用由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)來(lái)產(chǎn)生。
[0435]在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥相關(guān)疾病可通過(guò)抑制選自此類(lèi)基因的基因的表達(dá)或由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來(lái)誘導(dǎo)。反義核酸、核酶或RNAi可用于抑制表達(dá)。蛋白質(zhì)的活性可通過(guò)施用抑制所述活性的物質(zhì)例如抗體來(lái)有效地控制。
[0436]動(dòng)物模型可用于闡明癌癥相關(guān)疾病背后的機(jī)制，還可用于檢測(cè)通過(guò)篩選獲得的化合物的安全性。例如，當(dāng)動(dòng)物模型產(chǎn)生癌癥相關(guān)疾病的癥狀時(shí)，或當(dāng)牽涉某種癌癥相關(guān)疾病的測(cè)量值在動(dòng)物中改變時(shí)，可構(gòu)建篩選系統(tǒng)以探測(cè)具有減輕疾病的活性的化合物。
[0437]如本文中所使用的`，表述“表達(dá)水平的增加”是指下列情況的任一種:在人工表達(dá)作為外源基因?qū)氲臉?biāo)志物基因的情況下；在受試動(dòng)物本身固有的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其至蛋白質(zhì)的翻譯得到增強(qiáng)的情況下；或在作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被抑制的情況下。如本文中所用的，表述“表達(dá)水平的減少”是指其中受試動(dòng)物的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其至蛋白質(zhì)的翻譯被抑制的狀態(tài)，或其中作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被增強(qiáng)的狀態(tài)?；虻谋磉_(dá)水平可以例如通過(guò)DNA芯片上信號(hào)強(qiáng)度的差異來(lái)測(cè)定。此外，翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的活性可通過(guò)與正常狀態(tài)中的活性相比較來(lái)測(cè)定。
[0438]也在預(yù)期的范圍內(nèi)的是:動(dòng)物模型可包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括例如其中已人工導(dǎo)入并且表達(dá)標(biāo)志物基因的動(dòng)物；標(biāo)志物基因敲除動(dòng)物；和其中已用另一個(gè)基因置換標(biāo)志物基因的基因敲入動(dòng)物。已向其中導(dǎo)入了標(biāo)志物基因的反義核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作誘餌核酸的DNA等的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還包括例如這樣的動(dòng)物，在所述動(dòng)物中標(biāo)志物蛋白的活性已通過(guò)將突變導(dǎo)入基因的編碼區(qū)而被增強(qiáng)或被抑制，或氨基酸序列已被修飾而變得抗水解或?qū)λ饷舾?。氨基酸序列中的突變包括置換、缺失、插入和添加。
[0439]治療性應(yīng)用
[0440]本發(fā)明可廣泛用于多種情況，其中期望能夠以快速、有效和受控的方式調(diào)芐基因表達(dá)的水平(例如通過(guò)“打開(kāi)”和“關(guān)閉”基因表達(dá))而不引起多效性或細(xì)胞毒性。本發(fā)明可特別用于人中的基因治療，用于治療遺傳或獲得性疾病?；蛑委煹囊话惴椒ò▽⒁粋€(gè)或多個(gè)核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞以使一個(gè)或多個(gè)由導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)編碼的基因產(chǎn)物在細(xì)胞中產(chǎn)生，從而恢復(fù)或增強(qiáng)功能活性。關(guān)于基因治療方法的綜述，參見(jiàn)Anderson,等(1992) ;Miller等(1992) ;Friedmann等(1989) ; and Cournoyer等(1990)。然而，目前的基因治療載體通常利用對(duì)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子作出應(yīng)答的組成型調(diào)控元件。此類(lèi)載體系統(tǒng)沒(méi)有提供在受試者中調(diào)控基因表達(dá)的水平的能力。相比之下，本發(fā)明的調(diào)控系統(tǒng)提供了該能力。
[0441]為了將本發(fā)明的系統(tǒng)用于基因治療目的，將至少一種DNA分子導(dǎo)入需要基因治療的受試者(例如，患有遺傳或獲得性疾病的人受試者)的細(xì)胞以修飾細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾以使其包含:1)以適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)子的形式存在的編碼本發(fā)明的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)子的核酸；和2)與組織特異性啟動(dòng)子例如s-shipl啟動(dòng)子有效連接的siRNA (例如，用于治療目的)?？墒褂镁幋a本發(fā)明的調(diào)控系統(tǒng)的組件的單個(gè)DNA分子，或備選地，可使用編碼各組件的分開(kāi)的DNA分子。可對(duì)受試者的細(xì)胞進(jìn)行離體修飾，然后將其導(dǎo)入受試者或可通過(guò)用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)直接在體內(nèi)修飾細(xì)胞。因此，本發(fā)明的調(diào)控系統(tǒng)提供了優(yōu)于組成型調(diào)控系統(tǒng)的有利方面，其允許根據(jù)治療狀況的需要而調(diào)控基因表達(dá)的水平。
[0442]在受試者的細(xì)胞中待抑制或敲除以治療遺傳或獲得性疾病的特別吸引人的基因包括編碼有害基因產(chǎn)物例如異常蛋白質(zhì)的基因。非限定性疾病的實(shí)例包括貧血癥、血液相關(guān)癌癥、帕金森病和糖尿病。
[0443]本發(fā)明可用于開(kāi)發(fā)用于治療目的的自體或同種異體細(xì)胞系。例如，在細(xì)胞和/或器官移植中特別吸引人的基因治療應(yīng)用可利用本發(fā)明。在示例性實(shí)施方案中，移植抗原的下調(diào)(例如，通過(guò)siRNA下調(diào)β2-微球蛋白的表達(dá))允許同種異體細(xì)胞的移植同時(shí)使患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生排異反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。本發(fā)明將允許在不利作用(例如移植的細(xì)胞的不可控制的復(fù)制)的情況下關(guān)閉RNAi。
[0444]可使其經(jīng)歷本發(fā)明的細(xì)胞類(lèi)型包括造血干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、角質(zhì)細(xì)胞等。關(guān)于用于基因治療的細(xì)胞類(lèi)型、基因和方法的進(jìn)一步描述，參見(jiàn)例如，Armentano等(1990) ;Wolff等(1990);Chowdhury 等(1991);Ferry 等(1991);Quantin 等(1992);Dai 等(1992);vanBeusechem 等(1992);Rosenfeld 等(1992);Kay 等(1992);Cristiano 等(1993);Hwu 等(1993);以及 Herz 和 Gerard (1993)。
[0445]在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，存在治療順從于使用s-ship啟動(dòng)子的治療的任何疾病狀況的方法。在特定的實(shí)施方案中，方法包括制備具有編碼與啟動(dòng)子有效連接的治療性或診斷性(標(biāo)志物)基因的區(qū)域的多核苷酸構(gòu)建體，其中由構(gòu)建體編碼的基因用于治療所述疾病狀況。
[0446]A.藥物制劑、遞送和治療方案
[0447]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，設(shè)想了治療方法。藥物組合物的有效量通常定義為足以可檢測(cè)地和重復(fù)地改善、減輕、最小化或限制疾病或其癥狀的程度的量。可使用更嚴(yán)格的定義，包括疾病的消除、根除或治愈。
[0448]施用途徑當(dāng)然可隨損傷的位置和性質(zhì)而變化，并且包括，例如，皮內(nèi)、經(jīng)皮、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、透皮、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、瘤內(nèi)、灌注、灌洗、直接注射和口服施用和制劑。
[0449]可在與表面活性劑例如羥丙纖維素適當(dāng)?shù)鼗旌系乃兄苽湟杂坞x堿或藥理學(xué)上可接受的鹽形式存在的活性化合物的溶液。還可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物中和油中制備分散體。在普通貯存和使用條件下，此類(lèi)制劑含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。適合于注射用途的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散體以及用于無(wú)菌注射液或分散體的臨時(shí)制備的無(wú)菌粉劑(美國(guó)專(zhuān)利5，466，468，明確地以其全文通過(guò)引用合并入本文)。在所有情況下，所述形式必須是無(wú)菌的且必須具有達(dá)到容易注射的程度的流動(dòng)性。其在制造和貯存的條件下必須是穩(wěn)定的并且必須進(jìn)行保護(hù)以防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，其適當(dāng)?shù)幕旌衔锖?或植物油的溶劑或分散介質(zhì)。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以例如通過(guò)使用包衣例如卵磷脂，通過(guò)維持所需的顆粒大小(在分散體的情況下)和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。預(yù)防微生物的作用可利用各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來(lái)實(shí)現(xiàn)。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑例如糖或氯化鈉。可注射組合物的延長(zhǎng)的吸收可通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0450]對(duì)于水溶液中的胃腸外施用，例如，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)緩沖溶液(必要時(shí))并且首先用充足的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。此類(lèi)特定的水溶液特別適合用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)和腹膜內(nèi)施用。就此而論，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，可使用的無(wú)菌水性介質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。例如，可將一個(gè)劑量溶解在Iml等滲NaCl溶液中，然后加入至1000ml皮下輸液液體(hypodermoclysis fluid)或在打算輸注的位點(diǎn)進(jìn)行注射，(參見(jiàn),例如，"Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 15 版，第 1035-1038 頁(yè)和 1570-1580頁(yè))。取決于待治療的受試者的狀況，劑量必需發(fā)生一些變化。負(fù)責(zé)施用的人將，在任何情況下，確定用于個(gè)體受試者的適當(dāng)劑量。此外，對(duì)于人施用，制劑應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足FDA Office ofBiologies standards要求的無(wú)菌、致熱原性、一般安全性和純度的標(biāo)準(zhǔn)。
[0451]通過(guò)將活性化合物以所需的量與各種上面列舉的其他成分(需要時(shí))一起摻入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌來(lái)制備無(wú)菌注射液。通常，通過(guò)將不同的已滅菌的活性成分摻入無(wú)菌媒介物(其含有基本分散介質(zhì)和所需的來(lái)自上面例舉的那些的其他成分)來(lái)制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌`粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)(所述技術(shù)從其之前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加任何額外的期望的成分的粉劑)。
[0452]可以以中性或鹽形式制備本文中公開(kāi)的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成的)，其由無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸，或這樣的有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。與游離羧基形成的鹽還可來(lái)源于無(wú)機(jī)堿例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，和這樣的有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。在配制后，以與劑量配方(dosage formulation)相容的方式和以這樣的量如治療有效量施用溶液。制劑可以以多種劑型例如注射液、藥物釋放膠囊等容易地施用。
[0453]如本文中所用的，“載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、媒介物、包衣、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。此類(lèi)介質(zhì)和試劑用于藥物活性成分的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與所述活性成分不相容，否則預(yù)期其在治療性組合物中的用途。還可將補(bǔ)充活性成份摻入組合物中。[0454]短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”或“藥理學(xué)上可接受的”是指當(dāng)施用給人時(shí)不產(chǎn)生變應(yīng)性反應(yīng)或類(lèi)似的不利反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。含有蛋白質(zhì)作為活性成分的水性組合物的制備在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。通常，此類(lèi)組合物可制備為可注射的液體溶液或懸浮液；還可制備適合用于在注射前配制于液體形式的溶液或懸浮液中的固體劑型。
[0455]B.聯(lián)合治療
[0456]可在常規(guī)療法的背景中使用本發(fā)明的化合物和方法。為了增加使用本發(fā)明的組合物的治療的功效，可能期望將此類(lèi)組合物與有效治療此類(lèi)疾病和狀況的其他試劑組合。例如，可用本發(fā)明的治療性化合物和其他抗癌療法例如抗癌劑或手術(shù)進(jìn)行癌癥的治療。同樣，血管疾病或狀況的治療可包括本發(fā)明和常規(guī)血管藥物或療法。
[0457]可應(yīng)用不同的組合；例如，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是“A”并且第二抗癌劑/療法是“B”:TABLE-US-00005A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。
[0458]考慮到治療的毒性(如果有的話(huà))，本發(fā)明的治療性表達(dá)構(gòu)建體至患者的施用將遵從用于施用該特定的第二療法的一般方案。預(yù)期必要時(shí)重復(fù)治療周期。還設(shè)想可將各種標(biāo)準(zhǔn)療法以及手術(shù)介入(surgical intervention)與所述療法組合使用。[0459]本文中所引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)以其全文通過(guò)引用合并入本文。雖然對(duì)于制備和使用其的本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已十分詳盡地描述和例示了本發(fā)明，但各種改變、修飾和改進(jìn)是顯然的，且不背離本發(fā)明的精神和范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，本發(fā)明可進(jìn)行適當(dāng)?shù)馗淖円赃m合實(shí)現(xiàn)目的和獲得提及的目標(biāo)和有利方面以及其中固有的那些。
[0460]本文中所描述的方法和試劑代表優(yōu)選實(shí)施方案，是示例性的，并且不意欲限制本發(fā)明的范圍。其中的改進(jìn)和其他用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然的。這些改進(jìn)包括在本發(fā)明的精神內(nèi)并且由權(quán)利要求的范圍界定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，同樣極顯然的是可對(duì)本文中公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行各種替代和改進(jìn)而不背離本發(fā)明的范圍和精神。
[0461]應(yīng)理解，雖然本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征明確地公開(kāi)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本文中公開(kāi)的概念的改進(jìn)和變化，并且此類(lèi)改進(jìn)和變化被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求界定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0462]雖然通過(guò)參考各種和優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可進(jìn)行各種變化并且可用等同物替代其元素而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改進(jìn)以使特定的情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離本發(fā)明的基本范圍。
[0463]因此，本發(fā)明不意欲限定于本文中公開(kāi)的預(yù)期用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案，而是意欲包括落在權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
[0464]根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，可制備和執(zhí)行本文中公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法和/或設(shè)備。雖然已根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是，可對(duì)本文中描述的組合物和/或方法和/或設(shè)備以及方法的步驟或步驟的順序進(jìn)行變動(dòng)而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更特別地，很明顯的是，可用在化學(xué)和生理學(xué)上都相關(guān)的某些試劑替代本文中描述的試劑同時(shí)獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很顯然的所有此類(lèi)類(lèi)似的替代和修改視為在由所附權(quán)利要求界定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
[0465]在整個(gè)本公開(kāi)內(nèi)容中，通過(guò)標(biāo)識(shí)引用來(lái)引用各種公開(kāi)物、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)。這些公開(kāi)物、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文以更全面地描述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)。
[0466]除非另外定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域(例如，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)領(lǐng)域)技術(shù)人員通常所理解的意義相同的意義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的分子、遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法。此類(lèi)技術(shù)在文獻(xiàn)中得到詳盡的解釋。參見(jiàn)，例如，Molecular CloningA Laboratory Manual,第 2 版，由 Sambrook, Fritsch 和 Maniatis 編著(Cold SpringHarbor Laboratory Press:1989) ；DNA Cloning,第 I 和 II 卷(Glover ed.,1985)；Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984) ；Mullis 等，美國(guó)專(zhuān)利:4, 683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(Hames&Higgins eds.,1984) !Transcription AndTranslation(Hames&Higgins eds., 1984) ；Culture Of Animal Cells(R.1.Freshney, AlanR.Liss, Inc.,1987) !Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning (1984) ；the treatise,Methods InEnzymology(Academic Press, Inc., N.Y.) ；Gene Transfer Vectors For MammalianCells(Miller 和 Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ；Methods InEnzymology,第 154 和 155 卷(ffu 等 eds.), Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer 和 Walker, eds.，Academic Press, London, 1987) ；Handbook OfExperimental Immunology,第 1-1V 卷(Weir 和 Blackwell, eds.，1986) ；The LaboratoryRat,主編:Mark A.Suckow ;作者:Sharp 和 LaRegina.CRC Press, Boston, 1988,所述文獻(xiàn)通過(guò)引用合并入本文)和化學(xué)方法。
[0467]本發(fā)明的示例性實(shí)施方案包括但不限于下列項(xiàng)目:
[0468]1.區(qū)分人癌癥的方法，其包括使用一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄的超保守區(qū)域(T-UCR)的表達(dá)特征譜，其中UCR的 基因組定位與分析的癌癥相關(guān)基因組元件之間的相關(guān)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是高度顯著的并且與對(duì)于miRNA所報(bào)導(dǎo)的相關(guān)性相當(dāng)。
[0469]2.項(xiàng)目I的方法，其中一個(gè)或多個(gè)在人癌癥中差異表達(dá)的T-UCR位于與該類(lèi)型的癌癥特異性相關(guān)的癌癥相關(guān)基因組區(qū)域(CAGR)。
[0470]3.項(xiàng)目I的方法，其中7個(gè)UCR(uc.347至uc.353)的簇位于CAGR內(nèi)。
[0471]4.項(xiàng)目3的方法，其中兩個(gè)UCR:uc.349A(P)和uc.352 (N)在正常與惡性B-CLL⑶5陽(yáng)性細(xì)胞之間差異表達(dá)的T-UCR之中。
[0472]5.項(xiàng)目4的方法，其中一個(gè)或多個(gè)UCR位于在惡變過(guò)程中改變的基因組區(qū)域中。
[0473]6.項(xiàng)目I的方法，其中一個(gè)或多個(gè)T-UCR是癌癥易感性的候選基因。
[0474]7.項(xiàng)目 I 的方法，其中 5 個(gè) UCR，uc.269A(N)、uc.160(N)、uc.215(N)、uc.346A(P)和uc.348 (N)的特征用于區(qū)分兩個(gè)CLL預(yù)后組群。
[0475]8.項(xiàng)目I的方法，其中5個(gè)UCR中的3個(gè)與來(lái)自所述特征的13個(gè)miRNA中的5個(gè)具有顯著的反義互補(bǔ)性，從而產(chǎn)生6個(gè)可能的相互作用對(duì):uc.160::miR-24、uc.160::miR_155、uc.160::miR-223> uc.160::miR_146a、uc.346A::miR-155 和uc.-348::miR_29b。[0476]9.項(xiàng)目8的方法，其中所述UCR位于在惡變過(guò)程中被靶向的基因組區(qū)域中并且預(yù)示著可能參與人腫瘤發(fā)生。
[0477]10.相應(yīng)于 uc.246 (E)的 cDNA。
[0478]11.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法克隆和表達(dá)的項(xiàng)目10的cDNA。
[0479]12.相應(yīng)于 uc.269A (N)的 cDNA。
[0480]13.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法克隆和表達(dá)的項(xiàng)目12的cDNA。
[0481]14.項(xiàng)目I的方法，其中所述T-UCR在結(jié)腸癌中具有uc.73⑵的致癌功能，其中其過(guò)表達(dá)的減少誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且在異常表達(dá)所述T-UCR的結(jié)腸癌細(xì)胞中具有抗增殖作用。
[0482]15.用于評(píng)估其中兩個(gè)或多個(gè)類(lèi)型的ncRNA相互作用且影響表型的功能調(diào)控途徑的方法，其包括確定癌癥患者中UCR與miRNA的表達(dá)之間的相關(guān)性。
[0483]16.項(xiàng)目15的方法，其中所述癌癥是CLL。
[0484]17.項(xiàng)目16的方法，其中所述相關(guān)性包括miRNA:: T-UCR相互作用的存在。
[0485]18.項(xiàng)目15的方法，其中一個(gè)或多個(gè)nc-UCG在癌癥患者中在基因組水平上發(fā)生改變。
[0486]19.項(xiàng)目18的方 法，其中所述癌癥患者患有白血病。
[0487]20.其中編碼和非編碼基因都參與人腫瘤發(fā)生且在其中協(xié)同作用的模型，其包括一個(gè)或多個(gè)UCR。
[0488]21.診斷受試者是否患有與癌癥相關(guān)染色體特征相關(guān)的癌癥或處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括通過(guò)下述方法評(píng)估受試者中至少一個(gè)緊鄰癌癥相關(guān)染色體特征的UCR基因的狀態(tài):
[0489](i)測(cè)量來(lái)自所述受試者的受試樣品中至少一個(gè)來(lái)自受試樣品中UCR基因的UCR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的UCR基因產(chǎn)物的水平，受試樣品中UCR基因產(chǎn)物的水平的改變表示受試者患有所述癌癥或正處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中；
[0490](ii)就缺失、突變或擴(kuò)增分析受試樣品中所述至少一個(gè)UCR基因，其中與對(duì)照樣品中相應(yīng)的UCR基因相比，UCR基因中缺失、突變和/或擴(kuò)增的檢測(cè)表示受試者患有所述癌癥或正處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中；和/或
[0491](iii)測(cè)量受試樣品中所述至少一個(gè)UCR基因的拷貝數(shù)，其中對(duì)于常染色體或雌性性染色體上的UCR基因，除兩個(gè)拷貝外的拷貝數(shù)，或?qū)τ谛坌孕匀旧w上的UCR基因，除一個(gè)拷貝外的拷貝數(shù)表示受試者患有所述癌癥或正處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0492]22.項(xiàng)目21的方法，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征選自:癌癥相關(guān)基因組區(qū)域；染色體脆性位點(diǎn)；人乳頭狀瘤病毒整合位點(diǎn)；和同源異型框基因或基因簇。
[0493]23.項(xiàng)目I的方法，其中所述癌癥選自:膀胱癌、食管癌、肺癌、胃癌癥、腎癌癥、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、尤文肉瘤、血液腫瘤、實(shí)體瘤、胃癌、結(jié)腸直腸癌、腦癌、上皮癌、鼻咽癌、子宮癌、肝癌、頭頸癌、腎癌、雄性生殖細(xì)胞腫瘤、惡性間皮瘤、骨髓增生異常綜合征、胰腺或膽管癌、前列腺癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌、腎癌、Wilm' s腫瘤、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、皮膚癌、骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、白血病(急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、淋巴漿細(xì)胞樣淋巴瘤和橫紋肌肉瘤。
[0494]24.項(xiàng)目I的方法，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征是染色體脆性位點(diǎn)。[0495]25.項(xiàng)目10的方法，其中所述UCR基因選自:7個(gè)UCR(uc.347至uc.353)的簇；和
其組合。
[0496]26.項(xiàng)目17的方法，其中所述癌癥是白血病。
[0497]27.診斷受試者是否患有癌癥或處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括:(I)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自從受試者獲得的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)將靶寡脫氧核苷酸與含有一個(gè)或多個(gè)UCR特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交特征譜；和(3)將受試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較，其中信號(hào)的改變表示受試者患有癌癥或正處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0498]28.項(xiàng)目27的方法，其中所述癌癥是與癌癥相關(guān)染色體特征相關(guān)的癌癥。
[0499]29.項(xiàng)目27的方法，其中所述癌癥是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病。
[0500]30.診斷受試者是否患有與受試者中一個(gè)或多個(gè)不利預(yù)后標(biāo)志物相關(guān)的癌癥或處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括:(I)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自從受試者獲得的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)將靶寡脫氧核苷酸與含有一個(gè)或多個(gè)UCR特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供所述受試樣品的雜交特征譜；和(3)將受試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較，其中信號(hào)的改變表示受試者患有所述癌癥或正處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0501]31.項(xiàng)目30的方法，其中所述癌癥是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病。
[0502]32.診斷受試者是否患有癌癥或處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括分析來(lái)自所述受試者的受試樣品中至少一個(gè)與癌癥相關(guān)的UCR基因或基因產(chǎn)物，其中與對(duì)照樣品中相應(yīng)的UCR基因或基因產(chǎn)物相比較，UCR基因或基因產(chǎn)物中突變的檢測(cè)表示受試者患有癌癥或正處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0503]33.項(xiàng)目46的方法，其中至少一個(gè)miR基因或基因產(chǎn)物選自其中所述UCR基因選自:7個(gè)UCR(uc.347至uc.353)的簇；和其組合。
[0504]34.項(xiàng)目33的方法，其中所述癌癥是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病。
[0505]35.包含UCR基因產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中分離的UCR基因產(chǎn)物來(lái)自緊鄰癌癥相關(guān)染色體特征的UCR基因。
[0506]36.項(xiàng)目35的藥物組合物，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征選自癌癥相關(guān)基因組區(qū)域和染色體脆性位點(diǎn)。
[0507]37.包含核酸和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，所述核酸編碼分離的來(lái)自緊鄰癌癥相關(guān)染色體特征的UC基因的UCR基因產(chǎn)物。
[0508]38.項(xiàng)目37的藥物組合物，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征選自癌癥相關(guān)基因組區(qū)域、染色體脆性位點(diǎn)、人乳頭狀瘤病毒整合位點(diǎn)和同源異型框基因或基因簇。
[0509]39.治療受試者的癌癥的方法，其包括:
[0510](1)提供患有與癌癥相關(guān)染色體特征相關(guān)的癌癥的受試者，其中與對(duì)照細(xì)胞相比較，至少一個(gè)分離的來(lái)自緊鄰癌癥相關(guān)染色體特征的UCR基因的UCR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中被下調(diào)或上調(diào)；和
[0511](2) (a)當(dāng)所述至少一個(gè)分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，對(duì)受試者施用有效量的至少一種分離的來(lái)自所述至少一個(gè)UCR基因的miR基因產(chǎn)物，以使受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制；或(b)當(dāng)所述至少一個(gè)分離的UCR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被上調(diào)時(shí)，對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制所述至少一個(gè)UCR基因的表達(dá)的化合物，以使受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制。
[0512]40.項(xiàng)目39的方法，其中癌癥相關(guān)染色體特征選自癌癥相關(guān)基因組區(qū)域和染色體脆性位點(diǎn)。
[0513]41.治療與癌癥相關(guān)染色體特征相關(guān)的癌癥的方法，其包括:
[0514](I)確定相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，來(lái)自受試者的癌細(xì)胞中從至少一個(gè)緊鄰癌癥相關(guān)染色體特征的UCR基因表達(dá)的UC基因產(chǎn)物的量；和
[0515](2)通過(guò)下列方法改變癌細(xì)胞中表達(dá)的UC基因產(chǎn)物的量:
[0516]⑴如果癌細(xì)胞中表達(dá)的UCR基因產(chǎn)物的量低于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，則對(duì)受試者施用有效量的至少一種分離的來(lái)自所述UCR基因的miR基因產(chǎn)物；或
[0517](ii)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的UCR基因產(chǎn)物的量高于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的UCR基因產(chǎn)物的量，則對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制所述至少一個(gè)UCR基因的表達(dá)的化合物，以使受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制。
[0518]42.項(xiàng)目41的方法，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征選自癌癥相關(guān)基因組區(qū)域和染色體脆性位點(diǎn)。
[0519]43.項(xiàng)目42的方法，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征是染色體脆性位點(diǎn)。
[0520]44.項(xiàng)目43的方法，其中所述癌癥相關(guān)染色體特征是癌癥相關(guān)基因組區(qū)域。
[0521]45.前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥選自:白血病、肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、腦癌 、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、上皮癌、鼻咽癌、淋巴瘤、子宮癌、肝癌、頭頸癌、腎癌、雄性生殖細(xì)胞腫瘤、惡性間皮瘤、骨髓增生異常綜合征、卵巢癌、胰腺或膽管癌、前列腺癌、甲狀腺癌和尿路上皮癌。
[0522]46.用于評(píng)估一個(gè)或多個(gè)代謝途徑的標(biāo)志物，所述代謝途徑促成至少一種肺癌相關(guān)疾病的起始、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病狀、攻擊性、分級(jí)、活性、失能、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類(lèi)或其他潛在的致病或病理特征中的至少一個(gè)，
[0523]其中所述標(biāo)志物包括一個(gè)或多個(gè)UCR基因產(chǎn)物。
[0524]47.包含一種或多種前述項(xiàng)目的標(biāo)志物的組合物。
[0525]48.鑒定受試者中至少一種癌癥相關(guān)疾病的起始或發(fā)生的可能性的方法，所述方法測(cè)量一種或多種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物。
[0526]49.項(xiàng)目48的方法，其中一種或多種標(biāo)志物存在于分離的樣品中并且在體外進(jìn)行所有方法步驟。
[0527]50.用于檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含含有至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物的核苷酸序列或與所述標(biāo)志物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的多核苷酸。
[0528]51.用于檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含識(shí)別由至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物編碼的蛋白質(zhì)的抗體。
[0529]52.用于檢測(cè)癌癥相關(guān)疾病的DNA芯片，在所述芯片上已固定探針以測(cè)定至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物。
[0530]53.評(píng)估療法預(yù)防、診斷和/或治療至少一種肺癌相關(guān)疾病的有效性的方法，其包括:[0531](I)將動(dòng)物經(jīng)歷其有效性待評(píng)估的療法，和
[0532](2)通過(guò)評(píng)估至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物來(lái)測(cè)定被測(cè)試的療法在治療或預(yù)防肺癌相關(guān)疾病中的有效性水平。
[0533]54.項(xiàng)目53的方法，其中所述候選治療劑包含藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)食品組合物和順勢(shì)療法組合物中的一種或多種。
[0534]55.項(xiàng)目54的方法，其中所述待評(píng)估的療法用于人受試者。
[0535]56.項(xiàng)目55的方法，其中所述方法不是通過(guò)手術(shù)或療法治療人或動(dòng)物體的方法。
[0536]57.在動(dòng)物模型中就起始癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的能力估量至少一種材料的潛能的方法，所述方法包括:
[0537](I)在將所述動(dòng)物暴露于一種或多種在量上足以在所述動(dòng)物中起始癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的材料后，測(cè)量一種或多種被上調(diào)或下調(diào)的前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物；和
[0538](2)確定至少一種被上調(diào)或下調(diào)的標(biāo)志物是否具有起始癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的能力。
[0539]58.用于治療癌癥相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含:
[0540]至少一種選自7個(gè)UCR (uc.347至uc.353)的簇和其組合的UCR基因產(chǎn)物；和
[0541]藥學(xué)上可接受的載體。
[0542]59.項(xiàng)目59的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物相應(yīng)于與適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中被上調(diào)或下調(diào)的UCR基因產(chǎn)物。
`[0543]60.項(xiàng)目59的藥物組合物，其中所述肺癌相關(guān)疾病是腺癌。
[0544]61.用于治療肺癌的藥物組合物，其包含
[0545]至少一種UCR表達(dá)抑制化合物，和
[0546]藥學(xué)上可接受的載體，
[0547]其中所述至少一種UCR表達(dá)抑制化合物對(duì)于選自7個(gè)UCR (uc.347至uc.353)的簇和其組合的miR基因產(chǎn)物是特異性的。
[0548]62.項(xiàng)目61的藥物組合物，其中所述至少一種UCR表達(dá)抑制化合物對(duì)于與適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中被上調(diào)或下調(diào)的UCR基因產(chǎn)物是特異性的。
[0549]63.一種制品，其包含:至少一種結(jié)合癌癥相關(guān)疾病的標(biāo)志物的捕獲試劑，所述標(biāo)志物選自至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物。
[0550]64.用于篩選治療癌癥相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包含:
[0551]至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物的一種或多種試劑，和
[0552]表達(dá)至少一種標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0553]65.項(xiàng)目64的試劑盒，其中使用含有特異性結(jié)合至少一種標(biāo)志物的抗體或抗體片段的試劑檢測(cè)所述標(biāo)志物的存在。
[0554]66.項(xiàng)目65的試劑盒，其中所述試劑是標(biāo)記的、放射性標(biāo)記的或生物素標(biāo)記的，和/或其中所述抗體或抗體片段是放射性標(biāo)記的、發(fā)色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的。
[0555]67.項(xiàng)目66的試劑盒，其還包括裝有至少一種標(biāo)志物的容器。
[0556]68.項(xiàng)目67的試劑盒，其中所述試劑包含:抗體、所述試劑連接或可連接至其的探針和固定化的金屬螯合物中的一種或多種。[0557]69.肺癌相關(guān)疾病的篩選試驗(yàn),其包括:
[0558]將一種或多種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物與此類(lèi)標(biāo)志物的底物以及與測(cè)試試劑接觸，和
[0559]確定所述測(cè)試試劑是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)志物的活性。
[0560]70.項(xiàng)目69的篩選試驗(yàn)，其中在體外進(jìn)行所有方法步驟。
[0561]71.用于預(yù)測(cè)受試者中癌癥相關(guān)疾病的存在的微陣列，其包含抗至少一種前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的標(biāo)志物的抗體。
[0562]72.項(xiàng)目71的方法，其中通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分的存在來(lái)估量所述標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中所述轉(zhuǎn)錄的多核苷酸包含所述標(biāo)志物的編碼區(qū)。
[0563]73.項(xiàng)目72的方法，其中所述樣品是癌癥相關(guān)體液或組織。
[0564]74.項(xiàng)目73的方法，其中所述樣品包含獲自所述患者的細(xì)胞。
[0565]75.用于在有此需要的個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制癌癥相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括:
[0566]對(duì)所述個(gè)體施用干擾至少一種癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑，以足以干擾此類(lèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的量，
[0567]其中所述試劑包含至少一種UCR基因產(chǎn)物。
[0568]76.干擾至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑用于制造藥物的用途，所述藥物用于在個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制癌癥相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，
[0569]其中所述試劑包含至少一種UCR基因產(chǎn)物。
[0570]77.用于在有此需要的個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制癌癥相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括:
[0571]對(duì)所述個(gè)體施用干擾至少一種癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的級(jí)聯(lián)的試劑，
[0572]其中所述試劑包含至少一種UCR基因產(chǎn)物。
[0573]78.干擾至少一種癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的級(jí)聯(lián)的試劑用于制造藥物的用途，所述藥物用于在個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制癌癥相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，
[0574]其中所述試劑包含至少一種UCR基因產(chǎn)物。
[0575]79.包含具有多個(gè)數(shù)字編碼的參照特征譜的數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中至少第一參照特征譜代表了來(lái)自一個(gè)或多個(gè)展示癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的指標(biāo)的受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第一標(biāo)志物的水平，
[0576]其中所述標(biāo)志物包括一種或多種UCR基因產(chǎn)物。
[0577]80.項(xiàng)目79的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包含至少第二參照特征譜，所述第二參照特征譜代表了來(lái)自一個(gè)或多個(gè)展示癌癥相關(guān)疾病應(yīng)答的指標(biāo)的受試者或患有癌癥相關(guān)疾病的受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第二標(biāo)志物的水平。
[0578]81.用于確定受:試者是否患有癌癥相關(guān)疾病、是否易于患有所述疾病或是否具有對(duì)于所述疾病的不良存活預(yù)后的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包括
[0579]前述項(xiàng)目的任一項(xiàng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，和
[0580]包含計(jì)算機(jī)可執(zhí)行編碼的服務(wù)器，所述編碼使計(jì)算機(jī)接收受試者的特征譜，從數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定在診斷上與受試者特征譜相關(guān)的匹配的參照特征譜，并且產(chǎn)生受試者是否患有或易于患有癌癥相關(guān)疾病的指不。[0581]82.用于評(píng)估受試者中癌癥相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度的計(jì)算機(jī)輔助方法，包括:
[0582](I)提供包含用于對(duì)來(lái)自從所述受試者獲得的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)的模型或算法的計(jì)算機(jī)，
[0583]其中所述分類(lèi)包括分析關(guān)于至少一種標(biāo)志物的存在、不存在或量的數(shù)據(jù)，和
[0584]其中所述標(biāo)志物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物；
[0585](2)輸入來(lái)自從所述受試者獲得的生物樣品的數(shù)據(jù)；和
[0586](3)對(duì)所述生物樣品進(jìn)行分類(lèi)以表明癌癥相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度。
[0587]83.項(xiàng)目82的方法，其中所述至少一種UCR基因產(chǎn)物和其組合包括其分離的變體或生物活性片段或功能等同物，或與其結(jié)合的抗體。
[0588]84.項(xiàng)目83的方法，其中所述UCR基因產(chǎn)物選自7個(gè)UCR(uc.347至uc.353)的
簇；和其組合。
[0589]85.癌癥的動(dòng)物模型，其中存在一種或多種UCR基因產(chǎn)物的至少一種改變的表達(dá)。
[0590]86.項(xiàng)目85的動(dòng)物模型，其中所述動(dòng)物模型是非人脊椎動(dòng)物。
[0591]87.項(xiàng)目86的動(dòng)物模型，其中所述動(dòng)物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。
[0592]參考文獻(xiàn)
[0593]本文中用于舉例說(shuō)明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施的另外的詳細(xì)內(nèi)容的公開(kāi)案和其他材料通過(guò)引用合并入本文，并且為方便起見(jiàn)提供于下列參考書(shū)目中。
[0594]本文中引用的任何文獻(xiàn)的引用不意欲作為任何前述內(nèi)容是相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。關(guān)于日期的所有聲明和關(guān)于這些文獻(xiàn)的內(nèi)容的所有陳述基于 申請(qǐng)人:可獲得的信息，并且不構(gòu)成關(guān)于這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
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【權(quán)利要求】
1.用于測(cè)量至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄的超保守區(qū)域(T-UCR)的水平的試劑在制備試劑盒中的用途，其中所述試劑盒用于診斷受試者是否患有結(jié)腸直腸癌或處于發(fā)生結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中，其中所述診斷包括: 測(cè)量來(lái)自所述受試者的受試樣品中至少一個(gè)T-UCR的水平，其中相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的T-UCR的水平，受試樣品中所述至少一個(gè)T-UCR的水平的改變表示受試者患有結(jié)腸直腸癌或處于發(fā)生結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述至少一個(gè)T-UCR包括uc.73A(P)。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述改變是增加。
4.包含一個(gè)或多個(gè)T-UCR特異性探針寡核苷酸的微陣列在制備試劑盒中的用途，其中所述試劑盒用于診斷受試者是否患有結(jié)腸直腸癌或處于發(fā)生結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中，其中所述診斷包括: (1)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自于從受試者獲得的測(cè)試樣品的RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸； (2)使所述靶寡脫氧核苷酸與所述微陣列雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交特征譜；和 (3)將測(cè)試樣品的雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜進(jìn)行比較， 其中所述一個(gè)或多個(gè)T-UCR的信號(hào)的改變表示所述受試者患有結(jié)腸直腸癌或處于發(fā)生結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)T-UCR包括uc.73A(P)。
6.權(quán)利要求4的用途，其中所述改變是增加。
7.包含用于抑制T-UCR表達(dá)的試`劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述T-UCR 是 uc.73A(P)。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述試劑包括靶向所述T-UCR的siRNA。
9.用于抑制T-UCR表達(dá)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于增強(qiáng)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡或治療結(jié)腸直腸癌，其中所述T-UCR是uc.73A(P)。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述試劑包括靶向所述T-UCR的siRNA。
11.權(quán)利要求7或8的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于增強(qiáng)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡或治療結(jié)腸直腸癌。
12.用于檢測(cè)結(jié)腸直腸癌的試劑，其中所述試劑包含UCR基因產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求12的試劑，其中所述UCR基因產(chǎn)物是uc.73A(P)。
14.用于檢測(cè)結(jié)腸直腸癌的DNA芯片，在所述芯片上已固定探針以測(cè)定UCR基因產(chǎn)物，其中所述UCR基因產(chǎn)物是uc.73A (P)。
15.用于篩選治療結(jié)腸直腸癌的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包括針對(duì)UCR基因產(chǎn)物的一種或多種試劑，其中所述UCR基因產(chǎn)物是uc.73A(P)。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述試劑是抗體或抗體片段。
17.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述試劑是放射性標(biāo)記的或生物素標(biāo)記的。
18.與uc.73A (P)互補(bǔ)的 cDNAo
19.T-UCR特異性探針在制備用于鑒定人中相對(duì)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的用途，其中所述試劑盒用于鑒定測(cè)試脊椎動(dòng)物的測(cè)試組織樣品是否包含與至少一種癌癥具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性的至少一個(gè)T-UCR表達(dá)特征譜，其中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性指示特定癌癥的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，其中所述T-UCR包括uc.73A (P)，所述癌癥是結(jié)腸直腸癌。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103866008SQ201410065368
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2008年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2007年8月3日
【發(fā)明者】C·M·克羅斯 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)