高效液相色譜?串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖 ...的制作方法
【專利摘要】一種高效液相色譜?串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，包括：用超純水對(duì)氣溶膠樣品中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn)行超聲萃取，用高效液相色譜?串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)：采用氨水作為流動(dòng)相；質(zhì)譜部分的離子源采用適宜極性分子分析的電噴霧電離方式，質(zhì)譜方法采用多次優(yōu)化后的離子源參數(shù)和化合物參數(shù)，在負(fù)離子和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行定性和定量分析。通過(guò)外標(biāo)曲線法，L、M、G在0.01?1μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)超過(guò)0.99，其中L的檢出限小于0.005μg/ml，M和G均小于0.01μg/ml，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性很好，L、M、G的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.31％，4.48％和1.31％，其加標(biāo)回收率均達(dá)到97％以上。
【專利說(shuō)明】
高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋葡聚 糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物質(zhì)燃燒例如森林大火、秸桿燃燒等會(huì)排放多環(huán)芳烴、鹵代有機(jī)污染物等有毒 物質(zhì)影響人體健康，同時(shí)也會(huì)排放溫室氣體和大氣顆粒物等影響大氣環(huán)境和氣候變化，其 排放的污染物成分及其復(fù)雜，因此用分子示蹤物來(lái)研究生物質(zhì)燃燒對(duì)區(qū)域或局部地區(qū)大氣 環(huán)境的影響十分重要。
[0003]左旋葡聚糖（1，6-anhydr〇-0-d_glucose，或稱 Levoglucosan、L)學(xué)名 1,6-脫水-β-D-葡萄糖，是纖維素在高于300°C下熱解的產(chǎn)物，沒(méi)有其他來(lái)源。由于它的釋放量較大，且在 大氣環(huán)境中有足夠的穩(wěn)定性，被廣泛用作生物質(zhì)燃燒的示蹤物。左旋葡聚糖的同分異構(gòu)體 甘露聚糖（1，6-anhydr〇-0-d_mannopyranose，或稱 Mannosan、M)學(xué)名 1，6-脫水-β-D-吡喃型 甘露糖以及半乳聚糖（1，6_anhydr〇-0-d-galactopyranose，或稱 Galactosan、G)學(xué)名 1，6_ 脫水-β-D-吡喃型半乳糖是半纖維素高溫裂解的產(chǎn)物，它們?cè)诖髿猸h(huán)境中同樣性質(zhì)穩(wěn)定且 具有源特殊性，因而與左旋葡聚糖一并被公認(rèn)為理想的生物質(zhì)燃燒示蹤物。左旋葡聚糖、甘 露聚糖和半乳聚糖互為同分異構(gòu)體，分子量均為162.0,其對(duì)應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0005]對(duì)于大氣氣溶膠中生物質(zhì)燃燒示蹤物左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖這三種單 糖類的測(cè)定，早前廣泛采用的是先用有機(jī)溶劑萃取氣溶膠中的目標(biāo)物質(zhì)，接著經(jīng)衍生化后 用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法需用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，溶劑消耗量大，檢 測(cè)成本較高，而且樣品準(zhǔn)備耗時(shí)較長(zhǎng)，衍生化還會(huì)造成待分析物的損失。近年來(lái)，新出現(xiàn)的 無(wú)需進(jìn)行衍生化的檢測(cè)方法包括離子色譜-脈沖安培檢測(cè)，其左旋葡聚糖檢測(cè)限僅為60yg/ 1(200ng/m 3)(SchkoInik,G. ,Rudich,Y.,Detection and quantification of levoglucosan in atmospheric aerosols:A review.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，385: 26-33);用高效液相色譜-脈沖安培檢測(cè)方法，其三種單糖類的檢測(cè) 限在2〇-50iig/l(Caseiro，A.，Marr，I ·L.，Claeys，M.，Kasper-Giebl，A.，Puxbaum，H.，Pio， C.A.determination of saccharides in atmospheric aerosol using anion-exchange high-performance liquid chromatography and pulsed-amperometric detection. Journal of Chromatography A，2007,1171:37-45);同樣用高效液相色譜-串 聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn)行檢測(cè)，Piot et al采用 NaOH溶液作為流動(dòng)相可能會(huì)對(duì)質(zhì)譜造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，例如會(huì)使流動(dòng)相NaOH溶液經(jīng)過(guò)離 子源時(shí)于高溫下析出晶體，堵塞離子源接口等，且該方法對(duì)三種目標(biāo)物的檢測(cè)限為30yg/l， 定量限為lOOug/KPiot，?！?，Jaffrezo，J.L.，Cozic，J.，Pissot，N.，E1 Haddad，I.， Marchand,N.,Besombes,J.L.Quantification of levoglucosan and its isomers by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry and its applications to atmospheric and soil samples.Atmospheric Measurement Techniques ,2012,5:141-148)。以上檢測(cè)限對(duì)于檢測(cè)受氣溶膠污染較少的地 區(qū)或氣溶膠濃度較低天氣的氣溶膠樣品具有局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種檢出限低，檢測(cè)效果好，無(wú)需使用有機(jī) 溶劑，無(wú)需衍生化，檢測(cè)成本低、安全的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定氣溶膠中 左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí) 桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定氣溶膠中左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，步驟包括：
[0008] (1)用超純水對(duì)氣溶膠樣品中的三種單糖左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn)行 超聲萃取，所得萃取液過(guò)濾后完成樣品的前處理；
[0009] (2)用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定樣品中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和 半乳聚糖:色譜柱選擇適合單糖類分離的陰離子交換柱，流動(dòng)相選擇為氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω: 約0.001 % )-超純水，采用恒流速洗脫，流速范圍設(shè)定為0.2-0.5ml mirT1;
[0010] (3)將步驟（1)所得的經(jīng)過(guò)萃取的樣品經(jīng)由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣后，通過(guò)步驟(2)中流 動(dòng)相的帶動(dòng)下進(jìn)入柱溫箱中的色譜柱中，柱溫箱溫度設(shè)定不超過(guò)柱子最高耐溫度(最高耐 溫度為50°C);三種單糖在流動(dòng)相的帶動(dòng)下于色譜柱內(nèi)洗脫分離后，各組分通過(guò)接口進(jìn)入質(zhì) 譜檢測(cè)；質(zhì)譜的離子源采用適宜極性分子分析的電噴霧電離(ESI)方式(在負(fù)離子條件下， 各組分在噴霧電壓和霧化氣的共同作用下霧化形成噴霧狀的帶電液滴后，接著在 TurboHeater提供的霧化溫度和輔助加熱氣的共同作用下，溶劑蒸發(fā)，小液滴碎裂，離子從 液滴中脫落，產(chǎn)生氣相離子，在接口處聚焦，在氣簾氣的帶動(dòng)下，進(jìn)入質(zhì)量分析器)獲得的氣 相離子進(jìn)入質(zhì)量分析器；
[0011] (4)進(jìn)入質(zhì)量分析器(QqQ)后，采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)分析方法，采用質(zhì)譜多反 應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)分析方法可以選擇多個(gè)母、子離子對(duì)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)定只有質(zhì)荷比為160.9 的母離子能通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜(MS1/Q1)進(jìn)入碰撞室(q2)，設(shè)定在碰撞室被打碎的碎片子離子中 101.0,113.0和129.0能通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜(MS2/Q3)并被最后的檢測(cè)器檢測(cè)(設(shè)定好之后儀器將 自動(dòng)選擇該類離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜或檢測(cè)器）；相同的母、子離子對(duì)的化合物參數(shù)相同，每個(gè) 離子對(duì)的化合物參數(shù)經(jīng)多次優(yōu)化后取最佳值以使其靈敏度最高，各母、子離子對(duì)的化合物 參數(shù)如表1:
[0012] 表1左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的特征母、子離子及對(duì)應(yīng)化合物參數(shù)
[0014] (MRM方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，適合已知分析物反應(yīng)離子 的檢測(cè)。通過(guò)單標(biāo)測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，互為同分異構(gòu)體的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖經(jīng)離子 化后具有相同的母離子即160.9，母離子經(jīng)碰撞室碰撞擊碎后，左旋葡聚糖豐度最高的兩個(gè) 子離子為101.0和113.0,甘露聚糖擁有同樣的子離子即101.0和113.0,半乳聚糖豐度最高 的兩個(gè)子離子為101 .〇和129.0)
[0015] (5)結(jié)合目標(biāo)物的保留時(shí)間和特征子離子對(duì)左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn) 行定性，用豐度最高的160.9-101.0離子對(duì)對(duì)三種目標(biāo)物進(jìn)行定量，定量方法采用外標(biāo)曲線 法。
[0016] 本發(fā)明上述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定氣溶膠中左旋葡聚糖、甘 露聚糖和半乳聚糖的方法，為了保證柱效和避免待測(cè)物在柱內(nèi)的殘留，還需要采用如下步 驟:每?jī)芍苡?00mM的NaOH溶液沖洗柱子24小時(shí)，沖洗流速設(shè)定為0.4ml min-1，沖洗液不進(jìn) 入質(zhì)譜，沖洗完后接著用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001 %的氨水以0.4ml mirT1的流速?zèng)_洗2小時(shí)以去除 柱內(nèi)殘留的NaOH溶液，沖洗液不進(jìn)入質(zhì)譜；
[0017] 上述步驟（1)中，用超純水對(duì)樣品中的三種單糖（左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚 糖)分別進(jìn)行了 5、15、30、45、60、75、90分鐘的超聲萃取，最后確定最佳的萃取時(shí)間為45分鐘 (時(shí)間為45分鐘時(shí)，萃取出來(lái)的三種單糖濃度最高，超過(guò)45分鐘后，三種單糖濃度變化不大 且有所減低），溫度為室溫。
[0018] 上述步驟(1)中，超聲儀的功率為150W，使用頻率為40kHz。
[0019] 上述步驟（2)中的色譜柱選擇為Dionex(戴安）4mm(內(nèi)徑）X 250mm(長(zhǎng)度）的 CarboPac MA1分析柱以及4mm(內(nèi)徑）X50mm(長(zhǎng)度）的CarboPac MA1保護(hù)柱。流動(dòng)相選擇為 適合該色譜柱的堿性溶液，易揮發(fā)，不會(huì)對(duì)質(zhì)譜造成影響的氨水。氨水選擇為高效液相 (HPLC)級(jí)別，購(gòu)自西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司，原質(zhì)量分?jǐn)?shù)為彡25%，上述質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為〇. 001 % (約〇. 528mM)的氨水配制步驟為:取800ml超純水，經(jīng)超聲脫氣后，加入160μ1 的5%的氨水（由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的原氨水稀釋5倍得到），搖勻、靜置。
[0020]本發(fā)明涉及的所有流動(dòng)相都需經(jīng)超聲脫氣處理，超聲儀的功率為150W，使用頻率 為40kHz，時(shí)間為5-10分鐘，以排除02和他等保證流量準(zhǔn)確，提高色譜圖重現(xiàn)性，同時(shí)避免流 動(dòng)相與空氣中C0 2的接觸形成碳酸鹽，吸附在柱子上而影響柱效。
[0021 ]經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明流速的改變對(duì)目標(biāo)物靈敏度及分離度影響較小，優(yōu)化結(jié)果設(shè)定為 0.4ml min-、
[0022] 氨水的濃度可以影響目標(biāo)物的靈敏度，可通過(guò)該變流動(dòng)相比例實(shí)現(xiàn)其濃度的改 變，當(dāng)流動(dòng)相氨水（ω :約0.001 % )-超純水比例為10:90(v/v)時(shí)，目標(biāo)物的靈敏度最高，因 此，方法中設(shè)定流動(dòng)相比例為氨水（ω :約0.001 % )-超純水（10 :90，v/v)，即流動(dòng)相中氨水 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0001 %。
[0023] 本發(fā)明步驟(3)中離子源各參數(shù)經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)定如下:離子噴霧電壓設(shè)定為_(kāi) 3800V，霧化氣設(shè)定為38psi，霧化溫度設(shè)定為650°C，輔助加熱氣設(shè)定為80psi，氣簾氣設(shè)定 為46psi;
[0024] 上述步驟（3)中柱溫箱溫度經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)后證明與樣品的分離度和靈敏度呈正相 關(guān)，柱溫箱溫度越高，樣品分離度越好，靈敏度越高，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度<35°C時(shí)，分離效果 偏差，柱溫箱內(nèi)使用的上述色譜柱的溫度限值為50°C，長(zhǎng)時(shí)間使用該柱子以不超過(guò)其最高 溫度的90%為宜，因此最佳溫度設(shè)定為45°C。負(fù)離子模式適合酸性及中性樣品，或含有多個(gè) 羥基時(shí)。三種單糖偏中性且含數(shù)個(gè)羥基，因而選擇負(fù)離子模式。
[0025]上述步驟(4)采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)分析方法，其分析檢測(cè)時(shí)間為70分鐘，同 步化模式為"LC sync"即液相同步模式。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：
[0027] 1.采用本發(fā)明的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定樣品中的左旋葡聚糖、 甘露聚糖和半乳聚糖的方法，由于三種單糖既溶于水也溶于有機(jī)溶劑，此處使用的液相色 譜雙重質(zhì)譜聯(lián)用儀中選擇了"適合單糖類分離的陰離子交換柱"，該類柱子只能使用堿性的 水相流動(dòng)相，故而也只能使用水對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行萃取，因此無(wú)需使用有機(jī)溶劑，樣品也無(wú)需進(jìn) 行衍生化，能減少有機(jī)溶劑的使用，節(jié)約科研成本且有益于環(huán)保;而且能準(zhǔn)確地定性、定量 不同氣溶膠樣品中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖，檢出限低(L的檢出限小于5ng/ml (0.47ng/m3)，定量限（信噪比為10:1)小于10ng/ml，M和G的檢出限小于10ng/ml(0.93ng/ m3)，定量限在20-50ng/ml之間），檢測(cè)效果好。
[0028] 2.本發(fā)明通過(guò)選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相，優(yōu)化流動(dòng)相濃度、流速、柱溫箱溫度以 及質(zhì)譜中的離子源參數(shù)和目標(biāo)物的化合物等參數(shù)，能使目標(biāo)物得到很好的分離，在質(zhì)譜離 子源發(fā)生裂解，并使其對(duì)應(yīng)的母、子離子在質(zhì)譜得到最優(yōu)化的分析檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)液中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的色 譜圖，該色譜圖中的縱坐標(biāo)代表峰的強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表保留時(shí)間，單位為分鐘。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2所檢測(cè)的氣溶膠樣品萃取液中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半 乳聚糖的色譜圖，該色譜圖中的縱坐標(biāo)代表峰的強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表保留時(shí)間，單位為分鐘。 [0031 ]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)液中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的標(biāo) 準(zhǔn)曲線圖，該曲線圖中的縱坐標(biāo)代表液相色譜峰面積的響應(yīng)值，橫坐標(biāo)代表左旋葡聚糖、甘 露聚糖和半乳聚糖的濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。 [0033]實(shí)驗(yàn)條件:應(yīng)用島津公司的高效液相色譜(Shimadzu 30A)和愛(ài)博才思公司的串聯(lián) 四級(jí)桿質(zhì)譜(ABsciex 3200Qtrap)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，所用試劑均為高效色譜純，色譜柱選用 戴安公司生產(chǎn)的4mm(內(nèi)徑）X 250mm(長(zhǎng)度）的CarboPac MA1分析柱以及4mm(內(nèi)徑）X 50mm (長(zhǎng)度）的CarboPac MA1保護(hù)柱。流動(dòng)相選擇為氨水和超純水，流速經(jīng)優(yōu)化設(shè)定為0.4ml mirT1。柱溫箱溫度設(shè)定為45°C。最佳離子噴霧電壓設(shè)定為一3800V，霧化氣設(shè)定為38psi，霧 化溫度設(shè)定為650°C，輔助加熱氣設(shè)定為80psi，氣簾氣設(shè)定為46psi。選擇的各個(gè)單糖的代 表性母、子離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的化合物參數(shù)如表1所示。進(jìn)樣量為10微升。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)記錄色譜 和質(zhì)譜圖形，以離子對(duì)對(duì)應(yīng)的峰面積作為目標(biāo)物的響應(yīng)值，結(jié)合左旋葡聚糖、甘露聚糖和半 乳聚糖各自的保留時(shí)間和特征子離子對(duì)三種目標(biāo)物進(jìn)行定性，用豐度最高的160.9-101.0 對(duì)三種目標(biāo)物進(jìn)行定量，定量方法采用外標(biāo)曲線法。應(yīng)用上述試驗(yàn)條件所作的具體實(shí)施例 如下：
[0034] 實(shí)施例1
[0035]精密稱取左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖各l.Omg，用適量超純水溶解后，轉(zhuǎn)移至 100ml的容量瓶中，并用超純水定容至刻度。搖勻，靜置得10μg/ml的L、M、G混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。L、 M、G的測(cè)試工作曲線所用溶液由以上lOμg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，分別配制成0.005， 0.01，0.02,0.05,0.1，0.2,0.5, lμg/ml的系列溶液，接著按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行高效液相色 譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀HPLC-MSMS分析檢測(cè)，流動(dòng)相選擇為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001 %的氨水和超純 水（10:90，v/v)，恒流速設(shè)定為0.4ml min-1，柱溫箱溫度為45°C。最佳離子噴霧電壓設(shè)定為-3800V，霧化氣設(shè)定為38psi，霧化溫度設(shè)定為650°C，輔助加熱氣設(shè)定為80psi，氣簾氣設(shè)定 為46psi。選擇的各個(gè)單糖的代表性母、子離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的化合物參數(shù)如表1所示。進(jìn)樣量為 10微升。
[0036] 實(shí)施例2
[0037]剪取大流量空氣顆粒物采樣濾膜3cm X 3cm，剪碎后加入3ml超純水，進(jìn)行45分鐘超 聲萃取。萃取液經(jīng)〇.45μπι的疏水性PTFE針式濾器過(guò)濾后，將過(guò)濾后的提取液用高效液相-串 聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)試分析，高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的測(cè)試分析實(shí)驗(yàn)條 件同實(shí)施例1，外標(biāo)法定量。對(duì)空氣氣溶膠樣品作了3個(gè)平行樣品，試驗(yàn)編號(hào)為A、B、C，分析結(jié) 果見(jiàn)表2,并對(duì)第一個(gè)平行樣品(試驗(yàn)編號(hào)A)重復(fù)測(cè)定5次，分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表2可知，平行 樣中L的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8.98 %，Μ的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.43 %，G的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6.98% ;由表3可知，重復(fù)性測(cè)試中，L的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1 .31%，Μ的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.48 %，G的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.31 %。
[0038]表2該氣溶膠樣品中左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的測(cè)試含量
[0041] 表3該氣溶膠樣品中測(cè)試重復(fù)性
[0042]
[0043] 實(shí)施例3
[0044] 將實(shí)施例1中的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到準(zhǔn)備好的已知陰性結(jié)果(經(jīng)測(cè)試不含有目標(biāo)化合 物）的測(cè)試液中，按照實(shí)施例1中儀器分析檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)該樣品做10次平行測(cè)量取 平均值，根據(jù)實(shí)際加入量和實(shí)測(cè)結(jié)果，計(jì)算該樣品的加標(biāo)回收率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,由表4可 知，樣品中左旋葡聚糖的加標(biāo)回收率達(dá)到9 7 -101 %之間，平行測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.95 % ;樣品中甘露聚糖的加標(biāo)回收率達(dá)到99-101 %之間，平行測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.61 % ;樣品中半乳聚糖的加標(biāo)回收率達(dá)到9 9 -10 0 %之間，平行測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.47% ；
[0045] 表4該樣品的加標(biāo)回收率
[0048]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所檢測(cè)的L、M、G的色譜圖，該色譜圖中的縱坐標(biāo)代表峰的強(qiáng) 度，橫坐標(biāo)代表保留時(shí)間，單位為分鐘；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2所檢測(cè)的氣溶膠樣品中的L、M、 G的色譜圖，該色譜圖中的縱坐標(biāo)代表峰的強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表保留時(shí)間，單位為分鐘;根據(jù)L、 M、G的單標(biāo)所得色譜圖的保留時(shí)間及特征離子進(jìn)行定性，以峰度最強(qiáng)離子對(duì)160.9-101.0進(jìn) 行定量，以對(duì)應(yīng)保留時(shí)間出現(xiàn)的160.9-101.0的峰面積作為目標(biāo)物的響應(yīng)值，對(duì)樣品進(jìn)行定 性和定量分析。因?qū)嶋H氣溶膠樣品中Μ和G的含量很少，在色譜圖中峰形不明顯，因此，圖2中 Μ和G的峰形放大了 10倍，L的峰形不變。圖3為實(shí)施例1中對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)所得的L、M、G 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，該曲線圖中的縱坐標(biāo)代表液相色譜峰面積的響應(yīng)值，橫坐標(biāo)代表L、M、G的濃 度；由圖3可知，L所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系為y = 2E+06x+3364.8,其線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9997; 11所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系為y = 3E+06X+104354，其線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9976; G所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系為y = 2E+06x+8626.5，其線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9996;其中y代 表對(duì)應(yīng)的L、M、G的濃度，X代表液相色譜峰面積的響應(yīng)值，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的線性 相關(guān)性。對(duì)于利用高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)的儀器檢出限(信噪比為3:1)，L的 檢出限小于5即/1111(0.471^/111 3)，定量限（信噪比為10:1)小于1〇1^/1111，]\1和6的檢出限小于 10ng/ml(0.93ng/m 3)，定量限在20_50ng/ml之間。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋葡聚糖、甘露聚糖 和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟包括： (1) 用超純水對(duì)氣溶膠樣品中的Ξ種單糖左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn)行超聲 萃取，所得萃取液過(guò)濾后完成樣品的前處理； (2) 用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定樣品中的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳 聚糖:色譜柱為陰離子交換柱，流動(dòng)相為氨水-超純水，采用恒流速洗脫，流速為0.2-0.5ml/ mi打； (3) 將步驟（1)所得的經(jīng)過(guò)萃取的樣品進(jìn)樣后，在步驟(2)中流動(dòng)相的帶動(dòng)下進(jìn)入柱溫 箱中的色譜柱中，柱溫箱溫度設(shè)定不超過(guò)柱子最高耐溫度;Ξ種單糖在流動(dòng)相的帶動(dòng)下于 色譜柱內(nèi)洗脫分離后，各組分通過(guò)接口進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)；質(zhì)譜的離子源采用電噴霧電離方式 獲得的氣相離子進(jìn)入質(zhì)量分析器； (4) 進(jìn)入質(zhì)量分析器后，采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)分析方法，即選擇多個(gè)母、子離子對(duì)同時(shí) 進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)定只有質(zhì)荷比為160.9的母離子能通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)入碰撞室，設(shè)定在碰撞室被 打碎的碎片子離子中101.0,113.0和129.0能通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜并被最后的檢測(cè)器檢測(cè);相同的 母、子離子對(duì)的化合物參數(shù)相同； (5) 結(jié)合目標(biāo)物的保留時(shí)間和特征子離子對(duì)左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn)行定 性，用豐度最高的160.9-101.0離子對(duì)對(duì)Ξ種目標(biāo)物進(jìn)行定量，定量方法采用外標(biāo)曲線法。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟還包括:每?jī)芍苡?00mM的化0田容液 沖洗柱子24小時(shí)，沖洗流速設(shè)定為0.4ml mirfi，沖洗液不進(jìn)入質(zhì)譜，沖洗完后接著用質(zhì)量分 數(shù)為0.001 %的氨水W0.4ml min-i的流速?zèng)_洗2小時(shí)W去除柱內(nèi)殘留的NaO田容液，沖洗液不 進(jìn)入質(zhì)譜。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟（1)中用超純水對(duì)樣品中的左旋葡 聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖進(jìn)行超聲萃取的時(shí)間為45分鐘，溫度為室溫。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟(2)中的色譜柱選擇為Dionex4mmX 250mm的化rboPac MA1分析柱?及4mmX 50mm的化rboPac MA1保護(hù)柱；流動(dòng)相為雙流動(dòng)相， 即質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001 %的氨水W及超純水，氨水與超純水的體積比為10:90。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟(2)中質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%的氨水配制 步驟為:取800ml超純水，經(jīng)超聲脫氣后，加入16化1的5%的氨水，搖勻、靜置。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟(2)中的流速為0.4ml/min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:所述的流動(dòng)相均經(jīng)超聲脫氣處理后的流 動(dòng)相，超聲儀的功率為150W，使用頻率為40曲Z，超聲脫氣處理時(shí)間為5-10分鐘。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟(3)中離子源的離子噴霧電壓設(shè)定 為-3800V，霧化氣設(shè)定為38psi，霧化溫度設(shè)定為650°C，輔助加熱氣設(shè)定為80psi，氣簾氣設(shè) 定為46psi ;柱溫箱溫度為45°C。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè) 分析方法，其分析檢測(cè)時(shí)間為70分鐘，同步化模式為"LC sync"即液相同步模式。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定氣溶膠中左旋 葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的方法，其特征在于：步驟(4)各母、子離子對(duì)的化合物參數(shù) 為：
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106093248SQ201610712702
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月23日
【發(fā)明人】何俊, 徐婧莎, 徐宏輝, 姜瑜君
【申請(qǐng)人】何俊