一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接elisa檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體、HRP標(biāo)記的IgG酶標(biāo)二抗、標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液和終止液；所述方法采用所述試劑盒進(jìn)行檢測，將待檢測血清樣品與固相載體上包被的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230接觸和保溫孵育，用HRP標(biāo)記的IgG酶標(biāo)二抗特異地捕捉結(jié)合于0230蛋白抗原上的特異抗體，并用顯色劑顯色，從而測定得到待檢測血清樣品中針對(duì)0230蛋白的抗體水平。本發(fā)明檢測試劑盒及檢測方法具有特異性好、敏感性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
【專利說明】
一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接EL ISA檢測試劑盒及其 檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品領(lǐng)域，更具體的說是涉及基于特異蛋白的一種牛源多殺 性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛多殺性巴氏桿菌(Bovine Pastet/i-eDa皿/_/tocic/a，Pm)是一種引起牛發(fā)生出血 性敗血癥或呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原菌。多殺性巴氏桿菌根據(jù)其菌體莢膜抗原的不同，可 分為A、B、D、E和F 5種莢膜血清型，其中對(duì)牛致病的莢膜血清型有A、B、E及F型;A和F型主要 導(dǎo)致牛呼吸系統(tǒng)疾病，B和E型主要導(dǎo)致牛出血性敗血癥。以往我國流行的牛多殺性巴氏桿 菌病主要由莢膜血清B型引起，自2008年以來，A型多殺性巴氏桿菌病在我國許多省市相繼 流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)外針對(duì)疾病診斷和疫苗效力的檢測方法主 要有病原分離鑒定、PCR檢測技術(shù)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)以及ELISA試驗(yàn)等。PCR檢測 技術(shù)主要用于實(shí)驗(yàn)室研究，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)敏感性較低，ELISA檢測方法具 有靈敏性高和易批量檢測等優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 對(duì)于疫病診斷與疫苗效力檢測，其ELISA抗體檢測試劑盒具有一定差異，用于疫病 診斷的ELI SA抗體檢測試劑盒要求祀標(biāo)抗原特異(最好能區(qū)分感染抗體與免疫抗體，如不能 區(qū)分則只能用于未免疫動(dòng)物疫病診斷）;而用于疫苗效力檢驗(yàn)的ELISA抗體檢測試劑盒則要 求所用靶標(biāo)抗原為特異性保護(hù)性抗原，所檢測抗體水平要與其免疫保護(hù)性呈現(xiàn)正相關(guān)性， 傳統(tǒng)疫苗中不是所有的抗原成分免疫產(chǎn)生的抗體水平都會(huì)與該疫苗的保護(hù)性呈現(xiàn)正相關(guān)， 因此用于疫苗效力檢測的ELISA抗體檢測試劑盒的抗原選擇就尤為重要。
[0004] 目前我國尚無用于牛多殺性巴氏桿菌病血清流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評(píng)價(jià) 的ELISA抗體檢測試劑盒。因此，尋找特異性抗原靶標(biāo)，研制一種快速、敏感、特異的ELISA抗 體檢測試劑盒，以用于疫苗免疫效果評(píng)價(jià)和疫病血清流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)于有效防控牛多殺 性巴氏桿菌病具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，針對(duì)目前國內(nèi)沒有商品化針對(duì)牛源 多殺性巴氏桿菌抗體水平進(jìn)行檢測的檢測試劑盒的技術(shù)問題，提供一種能有效評(píng)價(jià)牛源多 殺性巴氏桿菌疫苗免疫效果及未免疫牛群多殺性巴氏桿菌感染血清流行病學(xué)調(diào)查的牛源 多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒具有快速、特異、敏 感、穩(wěn)定等特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接 ELISA檢測試劑盒，包括用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體、HRP標(biāo)記 的I gG酶標(biāo)二抗、標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液 和終止液；其中，所述牛源多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述陽性對(duì)照血清為犢牛感染牛源多殺性巴氏桿菌后 的血清，陰性對(duì)照血清為未免疫和未感染多殺性巴氏桿菌的犢牛血清。
[0007] 一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測方法，采用上述牛源多殺性巴氏 桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，將待檢測血清樣品與固相載體上包被的牛源 多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230接觸和保溫孵育，用HRP標(biāo)記的IgG酶標(biāo)二抗特異地捕捉結(jié) 合于0230蛋白抗原上的特異抗體，并用顯色劑顯色，從而測定得到待檢測血清樣品中針對(duì) 0230蛋白的抗體水平。
[0008] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、為了能夠使本發(fā)明試劑盒能夠全面對(duì)牛源A、B和F型多殺性巴氏桿菌的抗體進(jìn)行檢 測，本發(fā)明從A型、B型及F型共有的200多個(gè)基因中篩選出32個(gè)候選基因，以這些基因翻譯成 蛋白的氨基酸序列調(diào)入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析及抗原表位分析，根據(jù)其比對(duì)結(jié)果，綜合 分析其總得分值、覆蓋率、同源性及抗原表位結(jié)果，篩選出0230基因，對(duì)篩選出的牛源多殺 性巴氏桿菌0230的基因序列經(jīng)克隆測序分析，顯示其在牛源多殺性巴氏桿菌常見的不同血 清型菌株中同源性高，保守性好，對(duì)其蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其在牛多殺性巴 氏桿菌菌株基因組中具有高度同源性、保守性和通用性，能夠?qū)εＴ碅、B和F型多殺性巴氏 桿菌具有優(yōu)異的特異性和保守性，能夠用于牛源A、B和F型多殺性巴氏桿菌抗體的檢測抗 原。
[0009] 2、本發(fā)明所用的包被抗原牛多殺性巴氏桿菌0230蛋白可通過基因工程克隆表達(dá) 獲得，生物安全性高;本發(fā)明所用抗原牛多殺性巴氏桿菌0230蛋白本身具有免疫保護(hù)作用， 該蛋白產(chǎn)生的抗體持續(xù)時(shí)間較長，用該蛋白建立的ELISA試劑盒所檢出的抗體水平與牛源 多殺性巴氏桿菌疫苗免疫保護(hù)力及該蛋白免疫保護(hù)力呈現(xiàn)線性正相關(guān)，可用于牛源多殺性 巴氏桿菌疫苗免疫抗體水平監(jiān)測、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)及未免疫牛群多殺性巴氏桿菌感染血 清流行病學(xué)調(diào)查，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0010] 3、本發(fā)明采用篩選出的0230特異性蛋白包被固相載體，制備間接ELI SA檢測試劑 盒，采用制得的檢測試劑盒對(duì)牛源多殺性巴士桿菌抗體進(jìn)行檢測，該方法的檢測原理為：向 包被了0230蛋白的固相載體中加入待檢測的牛血清樣品，如果血清中含有牛源多殺性巴士 桿菌特異性抗體時(shí)，抗體會(huì)與固相載體上的0230特異性蛋白抗原結(jié)合，然后加入能與特異 性抗體鍵合的HRP標(biāo)記兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗，再加入TMB顯色液，在HRP的催化作用下TMB顯 色，顏色反應(yīng)的強(qiáng)度與血清樣品中牛多殺性巴氏桿菌抗體含量呈正相關(guān)，可以通過酶標(biāo)儀 讀數(shù)顯示，判斷待檢測樣品中抗體含量水平，來判斷抗體的保護(hù)效果。
[0011] 4、采用本發(fā)明方法對(duì)牛源多殺性巴士桿菌抗體進(jìn)行檢測，檢測步驟方便操作，檢 測時(shí)間短，本發(fā)明方法檢出限低、檢測靈敏度高，對(duì)A型、B型、F型牛源多殺性巴氏桿菌均具 有良好的特異性，且穩(wěn)定性能好，方法重復(fù)性良好，檢測結(jié)果真實(shí)可靠，誤判率低。
【附圖說明】
[0012] 圖1為0230基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測圖，其中：M:蛋白Marker;a:誘導(dǎo)產(chǎn)物(方 框標(biāo)記處為目的基因表達(dá)的融合蛋白）。
[0013] 圖2為純化的重組蛋白0230 SDS-PAGE檢測圖；其中：M:蛋白Marker;a:純化的融合 蛋白。
[0014] 圖3為純化的重組蛋白0230 Western-blot檢測圖；其中：M:蛋白Marker;a:純化的 融合蛋白。
[0015] 圖4為免疫攻毒后小鼠存活情況圖。
[0016] 圖5為抗體水平與A型巴氏桿菌攻毒保護(hù)關(guān)系圖。
[0017]圖6為抗體水平與B型巴氏桿菌攻毒保護(hù)關(guān)系圖。
[0018]圖7為抗體水平與F型巴氏桿菌攻毒保護(hù)關(guān)系圖。
[0019] 圖8為滅活疫苗免疫不同時(shí)間試驗(yàn)兔攻毒生存曲線圖。
[0020] 圖9為滅活疫苗免疫不同時(shí)間試驗(yàn)兔抗體ELISA檢測結(jié)果圖。
[0021]圖10為抗體水平與攻毒保護(hù)關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例和說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本實(shí)施案例在以 本發(fā)明技術(shù)為前提下進(jìn)行實(shí)施，現(xiàn)給出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程來說明本發(fā)明具 有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實(shí)施例。
[0023]下述實(shí)施例中牛源多殺性巴氏桿菌A型CQ2菌株及F型菌株：由西南大學(xué)動(dòng)物科技 學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從患有呼吸道綜合征的病死牛肺中分離鑒定保藏。牛源多殺性巴氏 桿菌B型菌株(CVCC450):購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。其他試劑如無特殊說明，即為普通市售 產(chǎn)品。
[0024]實(shí)施例1牛源多殺性巴氏桿菌特異性抗原蛋白的篩選： 對(duì)牛源多殺性巴氏桿菌A型、B型及F型菌株的全基因組序列進(jìn)行測序，通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室 測定的牛源多殺性巴氏桿菌A型、B型及F型菌株全基因組序列比較分析，根據(jù)預(yù)測具有信號(hào) 肽的得分值，從A型、B型及F型共有的200多個(gè)基因中篩選出32個(gè)候選基因，以這些基因翻譯 成蛋白的氨基酸序列調(diào)入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析(http: //blast.ncbi .nlm.nih. gov)及 抗原表位分析(http: //www ? cbs ? dtu ? dk/services/BepiPred/)，根據(jù)其比對(duì)結(jié)果，綜合分 析其總得分值、覆蓋率、同源性及抗原表位結(jié)果，篩選出0230基因；進(jìn)一步對(duì)0230基因及其 編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)和PCR分析，證明該基因及其編碼蛋白具有多殺性巴氏桿菌屬特 異性，在牛源A、B和F型多殺性巴氏桿菌中均存在，具有較好的特異性和保守性，可以作為對(duì) 牛源多殺性巴士桿菌抗體進(jìn)行檢測的間接ELISA試劑盒中的抗原。
[0025]實(shí)施例2多殺性巴氏桿菌0230基因的克隆表達(dá)及表達(dá)蛋白免疫保護(hù)性測定： 根據(jù)牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血清A型菌株CQ2基因組序列，設(shè)計(jì)0230基因的擴(kuò)增引 物：上游引物5'_gagtca g a a 11 c gatgtgattgcagataattt ;下游弓| 物5 ' -gagtcactcgaggaacataagaagatgcccat。上游引物中劃線段為RI酶切位點(diǎn)，下游引物中 劃線段為〇1酶切位點(diǎn)。
[0026]提取牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血清A型菌株CQ2的基因組DNA，并以此為模板，采用 上述設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增0230基因，擴(kuò)增條件為94°C 3min; 94 °C 30s，60°C 30s，72 °C 1 min，35個(gè)循環(huán);72 °C延伸10 min，4°C保存;將PCR產(chǎn)物經(jīng)及?o RI酶和處ol酶酶切回收，將 酶切回收產(chǎn)物與原核重組表達(dá)載體pET30a連接，獲得0230基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Pm0230,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌f . coi2BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，當(dāng)重組菌液 0D600~0.5時(shí)，加入IPTG(500 mmol/L)至在重組菌液中的終濃度為0.1 mmol/L，于37°C、 220 r/min的條件下誘導(dǎo)3 h，獲得表達(dá)產(chǎn)物，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)，檢測結(jié)果 如圖1所示，得到了與預(yù)期大小相當(dāng)?shù)闹亟M蛋白（圖1)。
[0027] 采用與上述相同的方法對(duì)該重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大量的重組蛋白，通 過Ni-NTA Superflow Cartridges His親和層析柱（簡稱Ni柱）純化并使用透析除鹽后，采 用SDS-PAGE檢測純化產(chǎn)物，檢測結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出得到了與該蛋白大小相符 的純化產(chǎn)物。
[0028]采用感染牛源多殺性巴氏桿菌A型菌株CQ2的牛血清作為一抗，以Western blot方 法檢測上述方法得到的純化蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該純化蛋白能夠與牛血清發(fā)生免疫印跡反應(yīng) (圖3 )，表明感染多殺性巴氏桿菌A型菌株CQ2的牛血清中含有0230蛋白的抗體。
[0029]以純化的重組蛋白0230制備抗原免疫昆明小鼠，2免后分別攻毒牛源多殺性巴氏 桿菌A型、B型及F型菌株的各自的4倍半數(shù)致死劑量，觀察1周，記錄各自的小鼠存活率，繪制 生存曲線（圖4)，從圖4可以看出該蛋白對(duì)牛源多殺性巴氏桿菌A型、B型和F型菌株的保護(hù)率 分別為80%、70%和60%，該結(jié)果同時(shí)提示B型及F型菌株也表達(dá)了該蛋白。
[0030] 實(shí)施例3牛源多殺性巴氏桿菌間接ELISA試劑盒 試劑盒的組分包括用純化的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體，標(biāo) 準(zhǔn)陽性對(duì)照血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清，HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗，顯色液，終止液，濃縮 洗滌液、樣品稀釋液和血清稀釋板。所述牛源多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0031] 其中，固相載體為96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板;所述牛源多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230 為采用上述實(shí)施例的方法大腸桿菌重組表達(dá)后純化的產(chǎn)物;用純化的牛源多殺性巴氏桿菌 特異性蛋白0230包被固相載體是指采用濃度為10 yg/mL的純化重組抗原蛋白0230于4°C包 被固相載體過夜，而后用1 wt.%卵清蛋白37°C封閉1.5h;陽性對(duì)照血清為犢牛感染牛源多 殺性巴氏桿菌后的血清，陰性對(duì)照血清為未免疫和未感染多殺性巴氏桿菌的犢牛血清；顯 色液為TMB，反應(yīng)終止液為2 mol/U^H2S〇4，濃縮洗滌液為25倍TOST洗滌液，樣品稀釋液是 含0.5%85厶、0.05%了￥661120、5臟〇1/1￡0了厶、0.35 111〇1/1恥(：1、？117.2的？85液。
[0032] 具體地，本實(shí)施例設(shè)計(jì)了如下規(guī)格的試劑盒商品： 1、用純化的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被板:96孔/板X 1。
[0033] 2、標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血清:30 yL/支XI支。
[0034] 3、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清:30 yL /支XI支。
[0035] 4、樣品稀釋液:50 mL/瓶X 1。
[0036] 5、HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗:50此/支XI支。臨用前以樣品稀釋液稀釋按 照1:500的體積比稀釋。
[0037] 6、25\?831'濃縮洗滌液：3〇11117瓶\1瓶。
[0038] 7、終止液：10mL/瓶XI瓶（2 mol/L H2S04)。
[0039] 8、TMB顯色液：20 mL/瓶 XI瓶。
[0040] 9、血清稀釋板:96孔/板XI塊 實(shí)施例4檢測方法 采用上述檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測時(shí)需要使用1)酶標(biāo)儀(建議參考儀器使用說明提 前預(yù)熱）;2)微量加液器及吸頭，EP管;3)蒸餾水或去離子水。
[0041] 采用該試劑盒進(jìn)行檢測的原理為:酶標(biāo)板上包被了牛源多殺性巴氏桿菌特異性抗 原0230蛋白，加入待測血清樣品；如果血清中含有特異性抗體，將與酶標(biāo)板上的特異性抗原 結(jié)合;然后加入能與抗體結(jié)合的用HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗，再加入TMB顯色液顯色， 顏色反應(yīng)的強(qiáng)度與血清樣品中牛多殺性巴氏桿菌抗體含量呈正相關(guān)，可以通過酶標(biāo)儀讀數(shù) 顯不〇
[0042] 具體檢測操作步驟如下： 1)實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫;對(duì)待檢測的血清樣品用樣品稀釋液按照1:100 的體積比進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品檢測的吸光度值符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再 乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)；陽性標(biāo)準(zhǔn)血清和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清也用樣品稀釋液按照1:100的體積比 進(jìn)行稀釋。
[0043] 2)加樣:在96孔板固相載體中分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加100 y L樣品稀釋液，陽性標(biāo)準(zhǔn)孔加100此稀釋后的陽性對(duì)照血清，陰性標(biāo)準(zhǔn)孔加100此稀釋后的 陰性對(duì)照血清，待檢測樣品孔加100此稀釋后的待測樣品，加樣時(shí)注意不要使孔中有氣泡， 將各溶液加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，于37 °(：孵育反應(yīng)90分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0044] 3)洗滌：步驟2)孵育結(jié)束后，棄去并甩干孔內(nèi)液體，向甩干后的每孔中加洗滌液 350 iiL浸泡4-5分鐘，甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)后再進(jìn)行第二次洗滌，總共洗滌5次。 [0045] 4)HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗：向步驟3)洗滌后的每孔中加稀釋過的酶標(biāo)二抗 (酶標(biāo)二抗與樣品稀釋液按照1:500的體積比稀釋，在使用前十分鐘內(nèi)稀釋）100yL，37°C孵 育30分鐘。
[0046] 5)洗滌:步驟4)孵育后棄去并甩干孔內(nèi)液體，同步驟3)方法洗滌孔5次。
[0047] 6)顯色:依序向每孔中加入顯色液100 yL，37°C避光反應(yīng)10分鐘。
[0048] 7)終止反應(yīng):依序每孔加終止液100 yL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的 加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到 后應(yīng)盡快加入終止液。
[0049] 8)測定:加終止液后立即進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度 (0D值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0050] 9)結(jié)果判定：陽性對(duì)照血清45Qnm值大于1.0，陰性對(duì)照血清P 45Qnm值小于0.30時(shí)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為合格；反之，為不合格，需重新檢測；陰陽性臨界值為0.388,待測樣品的 P 值大于0.388時(shí)為陽性，小于或等于0.388時(shí)為陰性。
[0051]實(shí)施例5蛋白0230免疫抗體水平與攻毒保護(hù)之間的相關(guān)性測定： 以上述重組蛋白0230制備的抗原免疫小鼠，每組10只，免疫12組，對(duì)照3組，共15組，分 別在免疫5(1、10(1、15(1、21(1尾靜脈采血分離血清。
[0052]采用本發(fā)明檢測試劑盒和方法對(duì)分離得到的血清中免疫抗體水平進(jìn)行測定。結(jié)果 表明（表1)，該蛋白免疫抗體水平隨著免疫時(shí)間的延長而升高。每次采血后分別以牛源多殺 性巴氏桿菌A型、B型及F型菌株進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，攻毒后觀察7天，記錄小鼠存活率，構(gòu) 建了免疫抗體水平與不同血清型牛源多殺性巴氏桿菌攻毒保護(hù)率相關(guān)曲線圖（圖5、6、7)， 結(jié)果表明，基于0230蛋白構(gòu)建的ELISA試劑盒所測定的該蛋白免疫抗體水平高低與其免疫 保護(hù)呈正相關(guān)。
[0053] 表1小鼠血清0230蛋白抗體ELISA槍測結(jié)果（0D450nm倌）
實(shí)施例6滅活疫苗免疫抗體水平與攻毒保護(hù)之間的相關(guān)性測定： 按照滅活菌苗制定標(biāo)準(zhǔn)，制備多殺性巴氏桿菌PmCQ2菌株滅活疫苗。選擇30只健康家 兔，隨機(jī)分為6組，每組5只（1.5kg/只）。其中1組試驗(yàn)兔注射lmL生理鹽水作為陰性對(duì)照，其 余5組按疫苗最佳免疫劑量(5.6 X 109CFU)依次免疫，第一次免疫第1組，一周之后免疫第2 組，以此類推，第5周時(shí)免疫第5組，第6周分別對(duì)每組試驗(yàn)兔進(jìn)行耳緣靜脈采血，并肌肉接種 最小致死量（1.5 X 109CFU)的PmCQ2，至此使得每組試驗(yàn)兔分別在免疫后的第35d、第28d、第 21d、第14d和第7d受到攻毒感染。攻毒后，飼養(yǎng)觀察20d，記錄試驗(yàn)兔存活情況。耳緣靜脈采 血后，分離血清，采用基于重組蛋白0230所建立的ELISA方法測定血清抗體效價(jià)，研究免疫 抗體水平與攻毒保護(hù)之間的相關(guān)性。
[0054] 結(jié)果表明，以最佳免疫劑量免疫7(1、14(1、21(1、28(1、35(1后攻毒，對(duì)照組家兔3天內(nèi)全 部死亡，免疫7d組在第3d死亡2只，在第4、lld各死亡一只，存活率為20%;免疫14d組，在第3、 5d各死亡一只，存活率為60%;免疫21d組僅在第4d死亡一只，存活率為80%;免疫28d、35d組 試驗(yàn)兔全部健活，存活率均為100%(圖8)。
[0055] 免疫7d、14d、21d、28d、35d組試驗(yàn)兔抗體水平平均值分別為0.762、1.092、 1.290、1.484、1.530，且各試驗(yàn)組抗體水平隨免疫時(shí)間的延長而逐漸增加（圖9);其攻毒保 護(hù)率依次為 20%、60%、80%、100%、100%(圖10)。
[0056]從以上結(jié)果可以看出，測定多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230抗體水平，能夠反映多 殺性巴氏桿菌所制備菌苗免疫動(dòng)物后其抗體產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)抗體水平與其保護(hù)率呈 現(xiàn)正相關(guān)性。
[0057]實(shí)施例7特異性、穩(wěn)定性和靈敏度檢測 對(duì)本發(fā)明試劑盒和檢測方法的特異性、穩(wěn)定性和靈敏度進(jìn)行檢測驗(yàn)證： 特異性試驗(yàn)表明，包被重組抗原0230與牛支原體、牛病毒性腹瀉、牛/羊口蹄疫陽性血 清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，而與A型、B型、F型牛源多殺性巴氏桿菌陽性血清均呈陽性反應(yīng)。結(jié)果 顯示，以0230重組蛋白構(gòu)建的間接ELISA方法有較好的特異性(表2)。
[0058] 表2特異性檢測結(jié)果
穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，同批次包被板檢測10份血清0D450nm值變異系數(shù)介于2.15%~5.18%之 間，不同批次包被板檢測10份血清0D450nm值變異系數(shù)介于5.18%~9.76%之間，說明該方法 重復(fù)性良好。
[0059] 隨機(jī)選取陽性樣本，對(duì)陽性樣本進(jìn)行倍比稀釋后，用建立的ELISA方法檢測，結(jié)果 顯示，當(dāng)血清以1:1280倍的體積比稀釋后，仍可以檢測到陽性，說明此該方法具有良好的靈 敏性(表3)。
[0060] 表3靈敏性試驗(yàn)
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包括用牛源多 殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體、HRP標(biāo)記的IgG酶標(biāo)二抗、標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血 清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液和終止液;其中，所述牛源多殺性 巴氏桿菌特異蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 示;所述標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血清為犢牛感染牛源多殺性巴氏桿菌后的血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清 為未免疫和未感染多殺性巴氏桿菌的犢牛血清。2. 根據(jù)權(quán)利要求1牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELI SA檢測試劑盒，其特征在于，所 述牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230采用如下方法獲得：以牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血 清A型CQ2菌株的DNA作為模板，利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增后的 目的基因片段，將所述目的基因片段與原核表達(dá)載體pET30a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET30a-Pm0230,將重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Pm0230轉(zhuǎn)化入大腸桿菌i coii BL2UDE3)感受 態(tài)細(xì)胞，并采用異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，將獲得的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過His標(biāo)簽純化柱純化 和透析除鹽處理，獲得所述牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230;所述特異性引物的上游 引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在 于，所述樣品稀釋液為含0.5 wt·% BSA、0.05 wt·% 吐溫20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L NaCl的PBS緩沖液，所述樣品稀釋液的pH為7.2。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接E LIS A檢測試劑盒，其特征在 于，所述濃縮洗滌液為25 XPBST洗滌液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在 于，所述顯色液為TMB，反應(yīng)終止液為2 mol/L的硫酸溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在 于，所述用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體采用如下方法制得：向固 相載體中加入濃度為10 yg/mL的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230溶液，于4 °C包被過 夜后，棄去所述牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230溶液，向固相載體中加入質(zhì)量濃度為1 %的卵清蛋白溶液，于37 °C下封閉1.5 h。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，其特征在 于，所述固相載體為96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接E LIS A檢測試劑盒，其特征在 于，所述HRP標(biāo)記的IgG酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗。9. 一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1~ 8任一所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，將待檢測血清樣品 與固相載體上包被的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230接觸和保溫孵育，用HRP標(biāo)記的 IgG酶標(biāo)二抗特異地捕捉結(jié)合于0230蛋白抗原上的特異抗體，并用顯色劑顯色，從而測定得 到待檢測血清樣品中針對(duì)0230蛋白的抗體水平。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于， 具體包括如下步驟： 1)將待檢測血清樣品、標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清分別與樣品稀釋液按照 1:100的體積比進(jìn)行稀釋，獲得待檢測血清樣品稀釋液、陽性對(duì)照血清稀釋液和陰性對(duì)照血 清稀釋液； 2) 分別設(shè)置空白組、陽性標(biāo)準(zhǔn)組、陰性標(biāo)準(zhǔn)組和待檢測血清樣品組，所述空白組向用牛 源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體中加入100 yL樣品稀釋液，陽性標(biāo)準(zhǔn)組 向用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體中加入100 yL所述陽性對(duì)照血 清稀釋液，陰性標(biāo)準(zhǔn)組向用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體中加入 100此所述陰性對(duì)照血清稀釋液，待檢測血清樣品組向用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白 0230包被的固相載體中加入100 yL所述待檢測血清樣品稀釋液，將加樣后的空白組、陽性 標(biāo)準(zhǔn)組、陰性標(biāo)準(zhǔn)組和待檢測血清樣品組于37 °C孵育反應(yīng)90分鐘； 3) 步驟2)孵育結(jié)束后，棄去空白組、陽性標(biāo)準(zhǔn)組、陰性標(biāo)準(zhǔn)組和待檢測血清樣品組固相 載體中的液體，用濃縮洗滌液分別洗滌各組固相載體若干次； 4) 將HRP標(biāo)記的IgG酶標(biāo)二抗與樣品稀釋液按照1:500的體積比進(jìn)行稀釋，獲得酶標(biāo)二 抗稀釋液，分別向步驟3)洗滌后的空白組、陽性標(biāo)準(zhǔn)組、陰性標(biāo)準(zhǔn)組和待檢測血清樣品組固 相載體中加入所述酶標(biāo)二抗稀釋液100 yL，于37°C孵育30分鐘； 5) 步驟4)孵育后，棄去各組固相載體中的液體，用濃縮洗滌液分別洗滌各組固相載體 若干次； 6) 分別向步驟5)洗滌后的各組固相載體中加入100 yL顯色液，于37 °C下避光顯色反 應(yīng)10~15分鐘； 7) 步驟6)顯色反應(yīng)結(jié)束后，分別向各組固相載體中加入終止液100 yL終止反應(yīng)，并測 定空白組、陽性標(biāo)準(zhǔn)組、陰性標(biāo)準(zhǔn)組和待檢測血清樣品組中液體在Ρ450Γ?處的吸光度值， 當(dāng)陽性標(biāo)準(zhǔn)組P4 5Qnm值大于1.0,陰性標(biāo)準(zhǔn)組P45Qnm值小于0.30時(shí)，待檢測血清樣品組數(shù) 據(jù)有效，待檢測血清樣品組P4 5Qnm值大于0.388時(shí)判斷為陽性，即待檢測血清樣品中含有 牛源多殺性巴氏桿菌抗體，待檢測血清樣品組P4 5Qnm值小于或等于0.388時(shí)判斷為陰性， 即待檢測血清樣品中不含有牛源多殺性巴氏桿菌抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK106053807SQ201610596739
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月26日 公開號(hào)201610596739.2, CN 106053807 A, CN 106053807A, CN 201610596739, CN-A-106053807, CN106053807 A, CN106053807A, CN201610596739, CN201610596739.2
【發(fā)明人】彭遠(yuǎn)義, 李能章, 程蓉, 李杜, 趙益萍, 劉舒萍
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)