一種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法先將乙肝表面抗原與包被的多克隆抗體結(jié)合，接著連接生物素化的單克隆抗體，再連接鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶C100，通過(guò)觸酶催化雙氧水分解，降低對(duì)巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)的熒光淬滅，根據(jù)熒光強(qiáng)度的高低來(lái)判斷樣品中乙肝表面抗原的濃度。該方法基于雙抗夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)，并采用了生物素?親合素系統(tǒng)用于反應(yīng)的放大。更為重要的是，由于本發(fā)明采用了新的抗體標(biāo)記酶(觸酶C100)和更為靈敏的熒光底物(碲化鎘量子點(diǎn))，并匹配了有效的反應(yīng)條件，使得檢測(cè)靈敏性得到顯著提升，同時(shí)降低成本、提升檢測(cè)效率，因此具有良好的推廣前景。
【專利說(shuō)明】
一種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及基于ELISA的抗原檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎是世界最常見(jiàn)的一種傳染病，嚴(yán)重危害人類健康，是由乙型肝炎病毒引起，并且常伴隨乙肝和肝硬化導(dǎo)致死亡，其主要通過(guò)血液、醫(yī)療器械、母嬰傳播和生殖細(xì)胞等傳播方式。主要臨床表現(xiàn)有疲乏無(wú)力、食欲不振、腹脹、黃疽、肝臟和脾臟腫大、肝功能異常和肝組織有程度不等的炎癥、壞死和纖維化病變?？杀憩F(xiàn)多種臨床類型:慢性HBV攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、淤膽型肝炎和肝炎肝硬化、肝細(xì)胞癌等。乙型肝炎在各國(guó)的感染率也不相同，有高流行區(qū)，中流行區(qū)，低流行區(qū)；發(fā)達(dá)國(guó)家，如歐美其感染率較小，一般在I %以下，且感染年齡偏大；日本、地中海和南美地區(qū)其乙肝感染率為2%_7%，兒童和新生兒感染較多;在亞洲和非洲為高流行區(qū)，其感染率非常高。
[0003]乙肝表面抗原為乙型肝炎的標(biāo)志物，通常在感染1-6周之類出現(xiàn)乙肝表現(xiàn)抗原標(biāo)志物?，F(xiàn)今，檢測(cè)乙肝表面抗原的常用方法包括膠體金免疫層析法(go Id-1mmunochromatography a s s ay，G I CA )、酉每耳關(guān)免疫吸附法(e n z yme linkedimmunosorbentaasay ,ELISA)、微粒子酶免疫分析法( micro-chemiluminescenceimmunoassay，MEIA)和時(shí)間分辨焚光免疫法(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)等各種方法。膠體金免疫層析法在試劑形式和操作步驟上較為簡(jiǎn)化，只需用一個(gè)試劑，只有一步操作。但該方法簡(jiǎn)便、快速、單份測(cè)定、結(jié)果可立等可取、除試劑外無(wú)需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但這類試驗(yàn)不能準(zhǔn)確定量，限制其應(yīng)用。時(shí)間分辨熒光免疫法具有靈敏度高等特點(diǎn)，但需依賴于昂貴的儀器設(shè)備和熟練的操作人員，且樣品處理復(fù)雜，因此無(wú)法滿足基層及現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地監(jiān)控的需要。然而，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、可定量、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需貴重儀器設(shè)備，且對(duì)樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為乙肝表面抗原快速篩查檢測(cè)的主要方法?，F(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)乙肝表面抗原的ELISA檢測(cè)方法普遍基于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體或抗原催化雙氧水生成羥自由基，進(jìn)而氧化無(wú)色的化學(xué)顯色底物四甲基聯(lián)苯二胺(TMB)形成藍(lán)色產(chǎn)物，然后使用終止液(2M H2S04)終止反應(yīng)形成黃色溶液于450nm處記錄吸光度值。該類方法因其顯色強(qiáng)度較低，因此檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，當(dāng)待測(cè)樣品中目標(biāo)物含量較低時(shí)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而無(wú)法滿足實(shí)際應(yīng)用的要求。
[0004]近年，一些新型的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制被報(bào)道用于替代傳統(tǒng)ELISA的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制用于提高傳統(tǒng)ELI SA的靈敏度，如放射免疫分析底物、化學(xué)發(fā)光底物、熒光底物以及共振膠體金溶液等。其中，基于熒光底物的ELISA因其具有較高的靈敏度而受到了廣泛的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，用熒光底物替代顯色底物至少可以提高檢測(cè)靈敏約1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的乙肝表面抗原ELISA檢測(cè)方法精度較低。
[0006]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)用于乙肝表面抗原檢測(cè)的ELISA方法中，標(biāo)記抗體的酶靈敏性較低。
[0007]本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)用于乙肝表面抗原檢測(cè)的ELISA方法中，顯色系統(tǒng)靈敏性較低。
[0008]本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)采用觸酶ClOO作為抗體標(biāo)記酶對(duì)乙肝表面抗原執(zhí)行ELISA檢測(cè)時(shí)，具體工藝方法并不明確。
[0009]本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)采用觸酶ClOO作為抗體標(biāo)記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)作為底物對(duì)乙肝表面抗原執(zhí)行ELISA檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與抗原濃度的線性關(guān)系不佳。
[0010]本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)采用觸酶ClOO作為抗體標(biāo)記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)作為底物對(duì)乙肝表面抗原執(zhí)行ELISA檢測(cè)時(shí)，過(guò)程中洗滌效果不佳。
[0011 ]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]—種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100。
[0013]作為優(yōu)選，該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。其中雙氧水作為碲化鎘量子點(diǎn)熒光淬滅劑，反應(yīng)過(guò)程中，雙氧水在觸酶作用下分解，從而降低熒光淬滅作用，實(shí)現(xiàn)發(fā)光。
[0014]作為優(yōu)選，該方法包括以下步驟:
[0015]I)包被乙肝表面抗體；
[0016]2)取步驟I)包被后的抗體，與待測(cè)樣品混合后于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40?80min，洗滌；
[0017]3)而后加入生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體混合，于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40?80m in，洗滌；
[0018]4)而后加入鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO混合，于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40?80min，洗滌；
[0019]5)而后加入濃度為8?12ymol/L的雙氧水溶液混合，于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)20?40min;
[0020]6)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)混合，于室溫避光環(huán)境中反應(yīng)10?20min；
[0021]7)檢測(cè)步驟6)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。
[0022]該熒光強(qiáng)度即用于反應(yīng)待測(cè)樣品中乙肝表面抗原含量，實(shí)際操作中可利用已知濃度且呈梯度分布的多組乙肝表面抗原標(biāo)準(zhǔn)液通過(guò)以上方法繪制熒光強(qiáng)度-菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，再利用待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算待測(cè)樣品的乙肝表面抗原含量。具體操作方法可以依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)常識(shí)任一選擇。上述梯度分布的多組乙肝表面抗原標(biāo)準(zhǔn)液，可以分別選擇 10—14g/mL 10—13g/mL、10—12g/mL、10—ng/mL、10—1()g/mL、10—9g/mL、10—
8g/mLo
[0023]該優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟2)用于獲得固相的抗原抗體復(fù)合物;步驟3)實(shí)現(xiàn)生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體與固相的抗原抗體復(fù)合物之間的連接;步驟4)利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)與觸酶ClOO的連接;步驟5)酶催化雙氧水分解;步驟6)實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)。在該優(yōu)選技術(shù)方案中:各試劑在使用前可以先可以先于室溫平衡30min以上再使用；步驟2)中待測(cè)樣品的加入量?jī)?yōu)選為80?120μ!7孔，更優(yōu)的是lOOyL/孔;步驟3)中生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體的加入量?jī)?yōu)選為80?120yL/孔，更優(yōu)的是10yL/孔;步驟4)中鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO的加入量?jī)?yōu)選為80?120yL/孔，更優(yōu)的是10yL/孔;步驟5)中雙氧水溶液的加入量?jī)?yōu)選為80?120μ!7孔，更優(yōu)的是lOOyL/孔;步驟6)中巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)的加入量?jī)?yōu)選為30?70yL/孔，更優(yōu)的是50yL/孔。
[0024]作為優(yōu)選，步驟I)具體包括以下操作:
[0025]Α)在酶標(biāo)板上以0.04?0.06mol/L、pH9.4?9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋乙肝表面抗原多克隆抗體至9?llyg/mL;
[0026]B)去除酶標(biāo)板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標(biāo)板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35?39°C封閉I?3h，而后棄去封閉液。
[0027]進(jìn)一步可以執(zhí)行以下優(yōu)選:所述牛血清白蛋白的濃度為0.3?0.7%，更優(yōu)的是0.5%；封閉液的加入量為320?360yL/孔，更優(yōu)的的是340yL/孔;棄去封閉液后的酶標(biāo)板于室溫下干燥，而后于2?6°C保存。
[0028]作為優(yōu)選，步驟A)中包被液的加入量為80?120yg/孔，稀釋后靜置8?12h再執(zhí)行步驟B)。
[0029]作為優(yōu)選，步驟3)所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體是通過(guò)以下方法制備的:配制含有I?3mg/mL乙肝表面抗原單克隆抗體、0.07?0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光條件下反應(yīng)30?60min，所述I3BS溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體。進(jìn)一步可以執(zhí)行以下優(yōu)選:所述生物素是活潑酯化生物素;所述透析的時(shí)間為66?78h，更優(yōu)的是72h。
[0030]作為優(yōu)選，步驟4)所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶C100是通過(guò)以下方法制備的:配制含有0.5?2mg/mL鏈霉親和素的PBS溶液，所述PBS溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，而后加入SM(PEG)24反應(yīng)30?60min，而后凝膠柱純化，收集濾液向其中加入觸酶C100至終濃度I?3mg/mL，即得到所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶C100。在該優(yōu)選技術(shù)方案中:凝膠柱純化環(huán)節(jié)用于去除多余的交聯(lián)劑;收集得到的濾液可以先檢測(cè)其中蛋白含量、并將含有蛋白的溶液混合后再加入觸酶C100。
[0031]作為優(yōu)選，步驟6)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)是通過(guò)以下方法制備的:配制含有8?12mmol/L硝酸鎘、20?28mmol/L巰基丙酸、3?7mmol/L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的PH為11?11.5，將所述前體溶液水浴加熱至93?97°C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0032]作為優(yōu)選，步驟7)中熒光強(qiáng)度的檢測(cè)是利用酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)的，激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nmo
[0033]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3?0.7% (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，所述 PBST 溶液的 pH 為 7.0?7.5。
[0034]在以上技術(shù)方案中，觸酶(Catalase)又稱為過(guò)氧化氫酶，本發(fā)明中所使用的觸酶ClOO專指由美國(guó)Sigma-Aldrich公司出品的、型號(hào)為cat.N0.ClOO的觸酶。所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體，是指將生物素共價(jià)連接到乙肝表面抗原單克隆抗體分子后得到的復(fù)合物。所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶C100，是指將鏈霉親和素與觸酶ClOO進(jìn)行共價(jià)結(jié)合所得的復(fù)合物。
[0035]以上技術(shù)方案中，酶標(biāo)板可以選用96孔黑色熒光酶標(biāo)板。96孔黑色熒光酶標(biāo)板，生物素，抗乙肝表面抗原單克隆抗體，抗乙肝表面抗原多克隆抗體，鏈霉親和素，觸酶ClOO均可于市面購(gòu)得。
[0036]作為優(yōu)選，所述洗滌是向酶標(biāo)孔中加入320?360yL/孔的洗滌液，洗滌3?4次，每次間隔10?30s。
[0037]作為優(yōu)選，所述待測(cè)樣品為血清:(1)將買(mǎi)來(lái)的乙肝表面抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別用全血清稀釋，濃度按照所需的實(shí)際檢測(cè)限確定；(2)稀釋好的乙肝表面抗原全血清樣本放入4°C冰箱備用。
[0038]本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)。用于檢測(cè)乙肝表面抗原的新型熒光ELISA檢測(cè)方法的原理是:將乙肝表面抗原與包被的多克隆抗體結(jié)合，接著加上生物素化的單克隆抗體，再加上SAOCAT(鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶C100，下同)，通過(guò)觸酶催化雙氧水分解，降低對(duì)巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)的熒光淬滅，根據(jù)熒光強(qiáng)度的高低來(lái)判斷樣品中乙肝表面抗原的濃度。如果樣品中的乙肝表面抗原濃度高，熒光強(qiáng)度高;反之，則熒光強(qiáng)度低。即熒光強(qiáng)度的高低與樣品中的菌的濃度成正相關(guān)。該方法可直接用于檢測(cè)血清中的乙肝表面抗原。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的檢測(cè)。
[0039]采用本發(fā)明技術(shù)方案具有如下有益效果:
[0040]1、本發(fā)明方法使用更為靈敏的新型的觸酶取代傳統(tǒng)ELISA方法中的辣根過(guò)氧化物酶，可以大大節(jié)約了成本。
[0041]2、本發(fā)明方法使用更為靈敏的新型的熒光底物(巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn))取代傳統(tǒng)ELISA方法中的化學(xué)顯色底物，可以大大提高其檢測(cè)靈敏度，相對(duì)于傳統(tǒng)ELISA至少提高了 2-3數(shù)量級(jí)。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1是本發(fā)明檢測(cè)方法與常規(guī)以辣根過(guò)氧化物酶作為抗體標(biāo)記物酶的檢測(cè)方法的原理對(duì)比圖。
[0043]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中百分熒光率-菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0044]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中百分吸光率-菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0046]以下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10%)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90至Ijl1之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語(yǔ)言可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0047]除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
[0048]以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑;所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值;以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0049]以下實(shí)施例中，抗生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體和多克隆抗體購(gòu)買(mǎi)于無(wú)錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司；所述的生物素(Cat.N0.B5161 )、鏈霉親和素(Cat.N0.S4762)、觸酶(cat.N0.C100)和底物液A雙氧水(35% ,cat.N0.349887)均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。所述的觸酶Cl00即指觸酶(cat.N0.C100)。
[0050]實(shí)施例1(本發(fā)明檢測(cè)乙肝表面抗原的新型熒光ELI SA檢測(cè)方法在檢測(cè)血清中乙肝表面抗原含量中的應(yīng)用)
[0051]本發(fā)明新型熒光ELISA檢測(cè)方法用于檢測(cè)血清中的乙肝表面抗原含量時(shí)，通過(guò)以下步驟實(shí)施:樣品前處理、用本發(fā)明檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)、分析結(jié)果。
[0052](I)樣品前處理
[0053]I)將買(mǎi)來(lái)的乙肝表面抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別用全血清稀釋，濃度按照所需的實(shí)際檢測(cè)限確定;2)稀釋好的乙肝表面抗原全血清樣本放入4 °C冰箱備用。
(2)用本發(fā)明檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)上述樣品中乙肝表面抗原含量
[0054]取包被有抗乙肝表面抗原含量多克隆抗體的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本lOOyL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；取包被有抗乙肝表面抗原多克隆抗體的酶標(biāo)板，加樣本I OOyL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后放置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液340μ!7孔，充分洗滌4次，每次間隔1s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)，再加入生物素化乙肝表面抗原單克隆抗體10yL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后放置37 °C避光環(huán)境中反應(yīng)60min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液340μ!7孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)，加入SA0CAT，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后放置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體用干，用洗滌工作液340μ!7孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)O加入底物液A雙氧水(1ymoI/L)稀釋液，10yL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;加入熒光底物液B巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)底物液50yL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37 °0避光環(huán)境中反應(yīng)15min，設(shè)定熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Var1skan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀)于激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm處檢測(cè)，測(cè)定每孔熒光值(請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的熒光值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中乙肝表面抗原的含量。
[0055]所述抗乙肝表面抗原多克隆抗體包被的96孔黑色熒光酶標(biāo)板的制備是用
0.05mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將乙肝表面抗原多克隆抗體(購(gòu)買(mǎi)于無(wú)錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司)釋成10yg/mL，100yL/孔，4°C放置過(guò)夜，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340yL/孔，洗板次，30s/次;然后加入0.5 %牛血清白蛋白(BSA，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，cat.N0.A4737)封閉，340yL/孔，37°C放置2h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25 °C)晾干;抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4 °C下保存。
[0056]所述的乙肝表面抗原適當(dāng)濃度梯度分別為10—14g/mL10—13g/mL、10—12g/mL、10—ng/mL、10—10g/mL、10—9g/mL、10—8g/mL。
[0057]所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體通過(guò)以下方式獲得:將Img乙肝表面抗原單克隆抗體用PBS(pH 8.6,0.01mol/L)稀釋，加入50yL活潑酯化生物素(0.76mg/mL)使抗體的終濃度為2mg/mL，室溫避光反應(yīng)45min。反應(yīng)產(chǎn)物在0.0lmol/L的I3BS溶液中透析72h，去除游離的生物素;透析結(jié)束后，將樣品冷凍干燥得到生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體，分裝，-20°C保存。
[0058]所述SAOCAT通過(guò)以下方式獲得:將SA用PBS(pH 8.6，0.0Imo 1/L)溶解為lmg/mL，再加入1yL SM(PEG)24(Thermo:22104，82.8mg/mL)反應(yīng)45min，反應(yīng)結(jié)束后用凝膠柱(Thermo:43230)分離純化，出去多余的交聯(lián)劑；收集的液體用Nanodrop測(cè)定，將有蛋白的用溶液混合，再加入到5mg觸酶溶液中(終濃度2mg/mL)。將獲得的樣品冷凍干燥，分裝，-20°C保存。
[0059]所述生物素化乙肝表面抗原單克隆抗體工作液的制備:采用活潑酯化生物素與乙肝表面抗原單克隆抗體偶聯(lián)得到的，用PBS(0.01M，pH7.4)稀釋成1:230。
[0060]所述SAOCAT工作液的制備:采用鏈霉親和素和觸酶偶聯(lián)得到的，用PBS(0.0lM，卩!17.4)稀釋成1:300。
[0061 ] 所述底物液A雙氧水的制備:用即3(0.0111101/1，？!17.4)稀釋至1(^11101/1。所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)熒光底物液的制備:方法，用PBS (0.0 Imo I/L，pH7.4)稀釋成1:400。
[0062]所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.0lmo VL的roST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0063](3)分析結(jié)果
[0064]用上述制備的6個(gè)乙肝表面抗原不同濃度的菌液10—13g/mL、10—12g/mL、10—ng/mL、10—1()g/mL、10—9g/mL、10—8g/mL。在激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0065]淬滅百分熒光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的淬滅百分熒光率等于第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的熒光強(qiáng)度值減去標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的熒光強(qiáng)度值的平均值(雙孔)，再除于第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))，即百分熒光率(％ ) = (Fo-F)/Fo X 100%，其中Fo為第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的熒光強(qiáng)度值，F(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的熒光強(qiáng)度值的平均值(雙孔)。
[0066]以淬滅百分熒光率為縱坐標(biāo)，以乙肝表面抗原濃度(g/mL)橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線為7 = 11.18禮(^(1) + 10.601，妒=0.9885，見(jiàn)附圖2。該方法的最低檢測(cè)限被定義為10—14g/mL的熒光值加上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得最低檢測(cè)線為10—%/111匕當(dāng)進(jìn)行實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)，將樣本的熒光值(斤()4)/^(^100%)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出所對(duì)應(yīng)樣本的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中乙肝表面抗原的實(shí)際濃度。
[0067]實(shí)施例2(以辣根過(guò)氧化物酶為抗體標(biāo)記酶、以TMB作為顯色底物的乙肝表面抗原ELI SA檢測(cè)方法)
[0068]傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法用于檢測(cè)血清中乙肝表面抗原含量時(shí)，通過(guò)以下步驟實(shí)施:樣品前處理、用傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)、分析結(jié)果。
[0069](I)樣品前處理
[0070]I)將買(mǎi)來(lái)的乙肝表面抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別用全血清稀釋，濃度按照所需的實(shí)際檢測(cè)限確定;2)稀釋好的乙肝表面抗原全血清樣本放入4 °C冰箱備用。
(2)用傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)上述樣品中乙肝表面抗原含量
[0071]取包被有抗乙肝表面抗原含量多克隆抗體的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本lOOyL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；取包被有抗乙肝表面抗原多克隆抗體的酶標(biāo)板，加樣本I OOyL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后放置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液340μ!7孔，充分洗滌4次，每次間隔1s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)，再加入生物素化乙肝表面抗原單克隆抗體10yL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后放置37 °C避光環(huán)境中反應(yīng)60min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液340μ!7孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)，加入SA0HRP，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后放置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min;小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體用干，用洗滌工作液340μ!7孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；加入TMB顯色液，lOOyL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37 °C避光環(huán)境中反應(yīng)15min ；加入終止液50yL/孔，輕輕振蕩混勾，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處或雙波長(zhǎng)450nm處檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；對(duì)比待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值大小，定量分析待測(cè)樣品中的乙肝表面抗原的殘留量。
[0072](3)分析結(jié)果
[0073]用上述制備的6個(gè)乙肝表面抗原不同濃度10—13g/mL、10—12g/mL、10—ng/mL、10—1()g/mL、10—9g/mL、10—8g/mL。百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光百分率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光強(qiáng)度平均值(雙孔)減去第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光強(qiáng)度值，再除于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光強(qiáng)度平均值(雙孔)，即百分吸光率(％ ) = (B-Bo)/B X 100%，其中B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光強(qiáng)度平均值(雙孔)，Bo為第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光強(qiáng)度值。
[0074]以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以乙肝表面抗原濃度(g/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = -16.18Log(x)+96.915，R2 = 0.981，見(jiàn)附圖3。該方法的最低檢測(cè)線被定義為百分吸光率大于10—14g/mL的吸光率加上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得最低檢測(cè)限為10—13g/mL。當(dāng)進(jìn)行實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)，將樣本的百分熒光率((B-Bo)/B X100%)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出所對(duì)應(yīng)樣本的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中乙肝表面抗原的實(shí)際濃度。
[0075]由實(shí)施例1與實(shí)施例2的對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新型ELISA方法靈敏度可達(dá)經(jīng)典ELISA方法的1000倍，同時(shí)也證明本發(fā)明的新型ELISA方法可適用于以高靈敏度檢測(cè)任何傳統(tǒng)ELI SA方法可以檢測(cè)的物質(zhì)。
[0076]實(shí)施例3
[0077]—種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100。
[0078]在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件:
[0079]該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0080]具體檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0081 ] I)包被乙肝表面抗體；
[0082]2)取步驟I)包被后的抗體，與待測(cè)樣品混合后于35°C避光環(huán)境中反應(yīng)40min，洗滌；
[0083]3)而后加入生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體混合，于35°C避光環(huán)境中反應(yīng)40min，洗滌；
[0084]4)而后加入鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO混合，于35°C避光環(huán)境中反應(yīng)40min，洗滌；
[0085]5)而后加入濃度為8ymol/L的雙氧水溶液混合，于35°C避光環(huán)境中反應(yīng)20min;
[0086]6)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)混合，于35°C避光環(huán)境中反應(yīng)1min;
[0087]7)檢測(cè)步驟6)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。
[0088]其中步驟I)具體包括以下操作:
[0089]A)在酶標(biāo)板上以0.04mol/L、pH9.4的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋乙肝表面抗原多克隆抗體至9yg/mL，包被液的加入量為80yg/孔，稀釋后靜置8h ；
[0090]B)去除酶標(biāo)板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標(biāo)板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35°C封閉lh，而后棄去封閉液。
[0091]步驟3)所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體是通過(guò)以下方法制備的:配制含有l(wèi)mg/mL乙肝表面抗原單克隆抗體、0.07mg/mL生物素的PBS溶液，于避光條件下反應(yīng)30min，所述PBS溶液的濃度為0.005mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體。
[0092]步驟4)所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO是通過(guò)以下方法制備的:配制含有0.5mg/mL鏈霉親和素的PBS溶液，所述PBS溶液的濃度為0.005mol/L，而后加入SM(PEG)24反應(yīng)30min，而后凝膠柱純化，收集濾液向其中加入觸酶ClOO至終濃度lmg/mL，即得到所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO。
[0093]步驟6)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)是通過(guò)以下方法制備的:配制含有8mmo 1/L硝酸鎘、20mmo 1/L巰基丙酸、3mmol/L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的PH為11，將所述前體溶液水浴加熱至93°C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0094]步驟7)中熒光強(qiáng)度的檢測(cè)是利用酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)的，激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nmo
[0095]所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3% (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005mol/L，所述PBST溶液的pH為7.0。
[0096]實(shí)施例4
[0097]—種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100。
[0098]在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件:
[0099]該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0100]具體檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0101]I)包被乙肝表面抗體；
[0102]2)取步驟I)包被后的抗體，與待測(cè)樣品混合后于39°C避光環(huán)境中反應(yīng)80min，洗滌；
[0103]3)而后加入生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體混合，于39°C避光環(huán)境中反應(yīng)80min，洗滌；
[0104]4)而后加入鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO混合，于39°C避光環(huán)境中反應(yīng)80min，洗滌；
[0105]5)而后加入濃度為12ymol/L的雙氧水溶液混合，于39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40min;
[0106]6)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)混合，于39°C避光環(huán)境中反應(yīng)20min;
[0107]7)檢測(cè)步驟6)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。
[0108]其中步驟I)具體包括以下操作:
[0109]A)在酶標(biāo)板上以0.06mol/L、pH9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋乙肝表面抗原多克隆抗體至llyg/mL，包被液的加入量為120yg/孔，稀釋后靜置12h;
[0110]B)去除酶標(biāo)板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標(biāo)板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于39°C封閉3h，而后棄去封閉液。
[0111]步驟3)所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體是通過(guò)以下方法制備的:配制含有3mg/mL乙肝表面抗原單克隆抗體、0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光條件下反應(yīng)60min，所述PBS溶液的濃度為0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體。
[0112]步驟4)所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO是通過(guò)以下方法制備的:配制含有2mg/mL鏈霉親和素的I3BS溶液，所述PBS溶液的濃度為0.02mol/L，而后加入SM(PEG)24反應(yīng)60min，而后凝膠柱純化，收集濾液向其中加入觸酶ClOO至終濃度3mg/mL，即得到所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO。
[0113]步驟6)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)是通過(guò)以下方法制備的:配制含有12mmo I /L硝酸鎘、28mmo I /L巰基丙酸、7mmo I /L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的PH為11.5，將所述前體溶液水浴加熱至97°C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0114]步驟7)中熒光強(qiáng)度的檢測(cè)是利用酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)的，激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nmo
[0115]所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.7% (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.02mol/L，所述PBST溶液的pH為7.5。
[0116]實(shí)施例5
[0117]—種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100。
[0118]在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件:
[0119]該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0120]具體檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0121]I)包被乙肝表面抗體；
[0122]2)取步驟I)包被后的抗體，與待測(cè)樣品混合后于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min，洗滌；
[0123]3)而后加入生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體混合，于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min，洗滌；
[0124]4)而后加入鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO混合，于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)60min，洗滌；
[0125]5)而后加入濃度為ΙΟμπιοΙ/L的雙氧水溶液混合，于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;
[0126]6)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)混合，于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min;
[0127]7)檢測(cè)步驟6)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。
[0128]實(shí)施例6
[0129]—種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100，該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。
[0130]實(shí)施例7
[0131]—種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100。
[0132]以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，該方法屬于雙抗夾心酶聯(lián)免疫法，該方法是針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)，該方法中用于標(biāo)記抗體的酶是觸酶C100。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)包被乙肝表面抗體； 2)取步驟I)包被后的抗體，與待測(cè)樣品混合后于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40?80min，洗滌； 3)而后加入生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體混合，于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40?80min，洗滌； 4)而后加入鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO混合，于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)40?80min，洗滌； 5)而后加入濃度為8?12ymol/L的雙氧水溶液混合，于35?39°C避光環(huán)境中反應(yīng)20?40min； 6)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)混合，于室溫避光環(huán)境中反應(yīng)10?20min; 7)檢測(cè)步驟6)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于步驟I)具體包括以下操作: A)在酶標(biāo)板上以0.04?0.06mol/L、pH9.4?9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋乙肝表面抗原多克隆抗體至9?llyg/mL; B)去除酶標(biāo)板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標(biāo)板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35?39°C封閉I?3h，而后棄去封閉液。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于步驟A)中包被液的加入量為80?120yg/孔，稀釋后靜置8?12h再執(zhí)行步驟B)。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于步驟3)所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體是通過(guò)以下方法制備的:配制含有I?3mg/mL乙肝表面抗原單克隆抗體、0.07?0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光條件下反應(yīng)30?60min，所述PBS溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的乙肝表面抗原單克隆抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于步驟4)所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶ClOO是通過(guò)以下方法制備的:配制含有0.5?2mg/mL鏈霉親和素的PBS溶液，所述PBS溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，而后加入SM(PEG)24反應(yīng)30?60min，而后凝膠柱純化，收集濾液向其中加入觸酶ClOO至終濃度I?3mg/mL，即得到所述鏈霉親和素標(biāo)記的觸酶Cl 00。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于步驟6)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)是通過(guò)以下方法制備的:配制含有8?12 m m ο I / L硝酸鎘、2 O?28mmol/L巰基丙酸、3?7mmol/L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的pH為11?11.5，將所述前體溶液水浴加熱至93?97 °C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于步驟7)中熒光強(qiáng)度的檢測(cè)是利用酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)的，激發(fā)波長(zhǎng)為310nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nmo10.根據(jù)權(quán)利要求3?9任一項(xiàng)所述的針對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)方法，其特征在于所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3?0.7 % (v/v)吐溫-20的I3BST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，所述PBST溶液的pH為7.0?7.5。
【文檔編號(hào)】G01N33/58GK105842447SQ201610157006
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月18日
【發(fā)明人】黃小林, 熊勇華, 許恒毅
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)